Name: 遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶアストロサイトとニューロンのミトコンドリアカルシウムイメージング法。GCaMP5GとGCaMP6sを用いた遺伝子組み換えカルシウム指標により、細胞特異的なミトコンドリア機能の動態を可視化し、神経細胞のカルシウムシグナリングメカニズムを解明する。

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この研究は、国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(NINDS)がR01NS069726とR01NS094539をSDに付与することによって支援されました。私たちは、オーディオ録音のためにエリカDeMersに感謝します。

動物に関する手続きは、ミズーリ大学コロンビア校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. DNAプラスミドの構築
注: インビトロ および インビボ イメージングでは、アストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターおよびミトコンドリア標的配列を有するGCaMP5G/6sをコードするDNAプラスミドが構築される。
<ol><li>ミトコンドリアマトリックス(MM)ターゲティングシーケンス(ミト-)ATGT CCGTCCCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGGGCTCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAG GATCCATTCG TTG17クローニング部位にエコRIとバムHIアデノ関連ウイルスの骨格内の(AAV)プラスミドpZac2.1は、アストロサイトgfaABC1DプロモーターまたはニューロンCaMKIIプロモーター18、19、20を含むプラスミドを得る。</li>
	<li>サブクローンGCaMP5G/6sをクローニング部位にBamH IとNot 1を上のプラスミドで、新しいプラスミドpZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6sおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6sのミトコンドリアインストロサイトおよび211ニューロンで遺伝子の遺伝子発現を標的とする。</li>
	<li>pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNAプラスミドを インビトロ 試験用トランスフェクション用に準備します(セクション2)。 インビボ 研究18 のためのニューロンのためのアストロサイトと血清型9のための血清型5でAAVベクターを生成する(セクション3)。</li>
</ol>2. インビトロ ミトコンドリアCa2+ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング
<ol><li>E15-16胚18、22、23、24の皮質からP1新生児マウスおよび一次ニューロンの皮質から一次アストロサイトを調製し、10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して直径12mmのガラスカバーリップで培養する それぞれ。</li>
	<li>pZac-gfaABC1D-GCaMP6sおよびpZac-CaMKII-GCaMP5Gプラスミドを有するトランスフェクト成熟した星細胞およびニューロンは、脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、アストロサイトのミトコンドリアおよびGCaMP5GのミトコンドリアでGCaMP6を発現させる。各ウェルの細胞を0.5μgのDNAでトランスフェクトし、後で培地を6時間変更します。 注:アストロサイトとニューロンは、トランスフェクションの1〜2日後にイメージングする準備ができています。</li>
	<li>トランスフェクション後1~2日目 にインビトロ ミトコンドリアCa2+ イメージングを行う。<ol>
<li>アストロサイトまたはニューロンで培養したガラスのカバーリップを、蛍光または2つの光子顕微鏡下でPH-1灌流室に移します。</li>
		<li>ACSFで100 μM ATPで占星ミトコンドリアCa2+取り込みを刺激するか、100 μMグルタミン酸/10 μMグリシン20,25で神経細胞ミトコンドリアを刺激する(図2および図3)。 注: ACSF から ATP およびグルタミン酸/グリシン含有 ACSF へのソリューションの変更は、ALA-VM8 灌流システム21によって制御されます。溶液の変化の速度は弁を調節することによって1-2 mL/minで制御される。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 生体内 ミトコンドリアCa2+ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング
<ol><li>AAV製剤。<ol>
<li>セクション1で作成したDNAプラスミドを使用して、次の組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターを調製する:rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびrAAV2/9-CaMKII-ミト-GCaMP6sベクター。 注:本実験では、血清型5のrAAVベクターを、細胞球中のミトコンドリアでGCaMP5Gを発現し、血清型9のrAAVベクターを作製し、細胞内のミトコンドリアでGCaMP6を発現するように調製した。</li>
	</ol></li>
	<li>立体的なAAV注射。<ol>
<li>3%イオブルランでマウスを麻酔します。 注:手術中の後、イオブルランレベルは2%に減少します。</li>
		<li>マウスが手術レベルの麻酔に達した後、尾とつま先のピンチによって決定されるように、手術部位、運動または体性感覚皮質の上に髪を剃り、毛トリマーで剃る。</li>
		<li>マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼の軟膏を眼に適用して、手術中に保護します。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。 注:無菌の手順を使用して手術を行います。すべての外科用具は、オートクレーブまたはホットビード滅菌装置によって滅菌される必要があります。</li>
		<li>マウスを立体装置に取り付けた後、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールを3回交互に頭皮を殺菌します。注射部位を露出させるために頭皮の正中線に切開を行います。</li>
		<li>ブレグマ・ラムダ軸で皮膚を切り開き、運動または体性感覚皮質の意図された注入位置に高速ドリルで〜1mmの直径のバリ穴を作成します。</li>
		<li>アデノ関連ウイルス(rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5Gベクター[1 x 1011 GC]またはrAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6sベクター[1 x 1011 GC])を含む33 Gハミルトン注射器を使用して、標的領域に最大1μLのウイルスを注入する。 注: たとえば、皮質ウイルスの配信の場合は、複数の手順で 2 つの深さでウイルス溶液を注入します。まず、針を硬膜から1mmの深さまで挿入し、脳が回復するために5分を許します。次に、マイクロシリンジポンプコントローラで制御されるハミルトンシリンジを使用して、針を~700 μmの深さまで移動し、500 nLの注入速度で500 nLのウイルス溶液を注入します。注射が完了したら、ウイルスが脳に拡散できるように5分間待ちます。次に、針を300μmの深さで第2の注入位置まで移動します。ここでは、さらに500nLのウイルス溶液を注入する。ウイルスが脳に拡散できるように10分待ちます。</li>
		<li>ティッシュ接着剤を使って頭皮と皮膚を閉じます。マウスは、加熱パッド上で回復してみましょう。回復後にマウスを動物施設に送り返す。</li>
	</ol></li>
	<li>頭蓋窓の内接および 生体内2光子(2-P)ミトコンドリアCa2+ 信号のイメージング。 注:頭蓋窓の移植は、運動または体性感覚皮質26、27、28、29の上にAAV注入の3週間後に行われます。カルプロフェン(10mg/kg)は、手術前に潜在的な痛みから救済を提供するために皮下注射される。頭蓋窓の外科処置はAAVの注入の外科プロシージャと同一であり、無菌状態で行われる。<ol>
<li>3%イオブルランでマウスを麻酔します。 注:これは最初の用量であり、後で手術のために2%に減らします。イメージングの際、ACSFに溶解した130mgケタミン/10mgのキシラジン/kg体重の腹腔内(IP)注射が麻酔に使用されます。</li>
		<li>マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼科軟膏を目に適用する。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。 注:すべての外科用具は殺菌される必要がある。</li>
		<li>頭皮の中線に長さ5〜8mmの切開を行い、はさみを使用して皮膚のフラップを取り除きます。</li>
		<li>頭蓋骨が露出した後、ウイルス注入領域(すなわち、運動皮質または体性感覚皮質、 図1B)上の高速ドリルを使用して直径2.0〜3.0mmの開頭術を行う。まず、4つの小さな穴を作り、その後、穴を接続する円でドリルします。その後、鋭いはさみで骨を持ち上げて取り除き、取り除きます。露出した硬膜は頭蓋窓の突起のために取除くか、またはそのまま保つことができる。</li>
		<li>透明なシリコーンを担い、直径3~5mmのガラスカバースリップを開きます。爪楊枝を使って頭蓋の窓を脳の表面にそっと押し込みます。次に、少量のシリコーン接着剤で縁を密封する。 注:または、シリコーンディスクの代わりに、1.2%低融点アガロースゲルは、カバーガラスと脳組織の間で使用することができます。</li>
		<li>最後に、カバースリップの端を歯科用セメントで密封します。強い結合のために頭蓋窓の端にセメントをわずかに適用するように注意してください。歯科用セメントで、カスタムメイドの金属製ヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けます。 メモ:金属板は、イメージングセッション中にマウスの頭部を2-P顕微鏡のステージに固定するために使用されます(図1C)。</li>
		<li>イメージング中に水浸漬のために頭蓋窓のカバースリップの上に0.5 mLのACSFソリューションを追加します。</li>
		<li>脳の窓を通して910 nm波長のニューロンにおける星状細胞およびミトGCaMP6sのミト-GCaMP5Gのイメージングのin vivo 2-Pの時間経過を行う(図1C)、20、27。 注:イメージング中、マウスは生理学的温度を維持するために加熱パッド上にあります。マウスは、イメージングセッションが完了した直後に犠牲になります。</li>
		<li>共局在化を決定する必要がある場合 には、インビボに スルフォホダミン101(SR101)を標識する。<ol>
<li>ステップ3.3.4の終わりに、100 μM SR101の100 μLを1-5分間皮質表面のACSFに塗布して下さい。</li>
			<li>ACSF で表面を洗い流して、非結合 SR101 を洗い流します。2-Pイメージングを使用して、星状細胞におけるmito-GCaMP5GおよびSR101の共標識は、45〜60分後に観察することができる(図4A)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本稿では、アストロサイトやニューロンにおけるミトコンドリアCa2+信号をイメージングする方法とプロトコルを提供します。GECI GCaMP5G/6sを表現するために、ミトコンドリアターゲティングおよび細胞型特異的戦略を実施しました。ミトコンドリアでGCaMP5G/6sを標的にするために、プラスミドにミトコンドリアターゲティング配列を含む。生体内のアストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5G/6sを発現させるために、アストロサイト特異的プロモーターgfaABC1Dおよびニューロン特異的プロモーターCaMKIIをプラスミドに挿入した。アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5G/6sの細胞型特異的発現は、アストロサイトにおけるSR101標識およびNeuNを有するニューロンの免疫染色によって確認することができる。我々のデータから、これらの戦略は、生体内のアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する信頼できる細胞型特異的アプローチを提供する。
GECI 発現の...

ミトコンドリアは、細胞内の動的な小器官であり、エネルギー生産のための細胞大国と考えられています。一方、ミトコンドリアは、局所的または細胞質Ca2+上昇に応答して、母体にCa2+を取ることができます。ミトコンドリアCa2+取り込みは、三カルボン酸(TCA)サイクルおよび酸化リン酸化における反応などの代謝過程を含むミトコンドリア機能に影響を及ぼし、生理学的条件下でCa2+感受性タンパク質を調節する1、2、3、4。ミトコンドリアCa2+過負荷はまた、細胞死の決定要因であり、様々な脳障害における壊死およびアポトーシスを含む5、6、7。これは、ミトコンドリア透過性遷移細孔(mpPPs)の開口部とアポトーシス細胞死を開始するカスパーゼ補因子の放出を引き起こす。したがって、細胞生理学と病理をよりよく理解するために、生きている細胞におけるミトコンドリアCa2+のダイナミクスと取り扱いを研究することが重要です。
ミトコンドリアは、Ca2+取り込みと流出のバランスをとってマトリックスCa2+ホメオスタシスを維持します。ミトコンドリアCa2+取り込みは主にミトコンドリアCa2+ユニポーター(MCUs)によって媒介され、ミトコンドリアCa2+流出はNa+-Ca2+-Li+交換器(NCLX)とH+/Ca2+交換器(mHCXs)8によって媒介される。バランスは、Gタンパク質共役受容体(GPDR)9の刺激を通じて摂動することができる。ミトコンドリアCa2+ホメオスタシスも、不溶性xCa 2+-xPO4 x-xOH複合体8の形成によるミトコンドリア緩衝の影響を受ける。
細胞内およびミトコンドリア濃度の変化([Ca2+])は、蛍光または発光Ca2+指標によって評価することができる。標識へのCa2+結合はスペクトル修飾を引き起こし、生細胞でのリアルタイムでの自由な細胞[Ca2+]の記録を可能にする。現在、細胞内のCa2+の変化を監視するために、有機化学指標と遺伝的にコード化されたCa2+指標(GECI)の2種類のプローブが利用可能です。一般的に、異なるCa2+親和性(Kdに基づく)、スペクトル特性(励起および発光波長)、動的範囲、および感度が調査中の生物学的問題に対して利用可能である異なる変異体が利用可能である。多くの合成有機Ca2+指標が細胞質Ca2+イメージングに使用されていますが、ミトコンドリアCa2+イメージング用のミトコンドリアマトリックスに選択的にロードできるのはごくわずかですが、Rhod-2が最も広く使用されています(レビューでは10,11を参照)。しかし、Rhod-2 は、長い時間経過実験の間に漏れの大きな欠点があります。さらに、ミトコンドリア、他のオルガネラ、サイトゾルの間で分割され、異なるサブコンパートメントでの絶対測定が困難になります。対照的に、細胞型プロモーターおよび細胞内区画ターゲティング配列を用いることによって、GECIは、インビトロまたはインビボで細胞およびコンパートメント特異的なCa2+イメージング用の異なる細胞タイプおよび細胞下コンパートメントで発現することができる。単一波長蛍光強度ベースのGCaMP Ca2+指標は、最近、主要なGEIS12、13、14、15、16として登場しました。本稿では、アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5GおよびGCaMP6s(GCaMP5G/6s)のミトコンドリア標的化および細胞型特異的発現のプロトコルと、これらの細胞タイプにおけるミトコンドリアCa2+の取り込みについて説明する。このプロトコルを用いて、個々のミトコンドリアにおけるGCaMP6G/6sの発現が明らかにでき、そして単一ミトコンドリア分解能におけるCa2+取り込みは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおいて達成することができる。

<table><tbody><tr><td>人工涙液軟膏</td><td></td><td>ラグビーNDC-0536-6550-91</td><td>83%白色ワセリン</td></tr><tr><td>酸シアノアクリレート接着剤</td><td>世界精密機器</td><td></td><td>3M Vetbond</td></tr>接着剤<tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ 2B</td><td>手術</td></tr><tr><td>デュモン鉗子 細かい先端と</td><td>微細な科学ツール</td><td>11255-20</td> 硬膜<td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップの除去用、0.13-0.17 mm厚</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542A</td><td>頭蓋窓カバー用</td></tr><tr><td>高速マイクロドリル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-17</td><td>骨研磨ドリルビット付き</td>ファインサイエンスツール18000-17</tr><tr><td>注射</td>器ハ<td>ミルトン</td>ウイルス<td>注射用</td><td>2.5ミリリットル</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg / kg体重</td></tr>低<tr><td>融点アガロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9793</td><td>運動アーチファクトの低減</td></tr><tr><td>金属フレーム</td><td>カスタムメイド</td><td>顕微鏡ステージへの脳の取り付けについては</td><td>図1を参照</td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプコントローラー</td><td>ワールドプレシジョンスツ</td><td>UMP3</td><td>インジェクションスピードコントローラー</td></tr><tr><td>マウス定位固定装置</td><td>ストールティング</td><td>51725</td><td>マウス保持用</td></tr><tr><td>灌流チャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>ALAサイエンティフィック・インスツルメン</td>ツ <td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>自己調整型加熱パッド</td><td>ファイン・サイエンス・ツール</td><td>21061</td> マウス<td>の低体温症を予防</td></tr><tr><td>スルフォホダミン101</td><td>インビトロジェン</td><td>S-359</td><td>アストロサイトを標識する赤色蛍光色素</td></tr><tr><td>手術用ハサミ、12cm</td><td>ファイン・サイエンス・ツール</td><td>14002-12</td> 解<td>剖用</td></tr><tr><td></td><td>材料</td>Xylazine VEDCO NDC-50989-23 10 mg/kgの体重の清算のためのトレフィン<td>のファインサイエンスツール</td><td>18004-23</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子組み換えca2+ 指標(gec)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアca2+ 取り込み

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

ミトコンドリアCa2+は、細胞質Ca2+緩衝、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達を制御する上で重要な役割を果たしています。ミトコンドリアCa2+の過負荷は、神経変性および神経疾患におけるアポトーシス細胞死を含む様々な病理学的状態に寄与する。ここでは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する細胞型特異的およびミトコンドリア標的分子アプローチを提示する。ミトコンドリア標的化遺伝子組み換えCa2+指標(GECIs)GCaMP5GまたはGCaMP6s(GCaMP5G/6s)をコードするDNAプラスミドをアストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターgfaABC1DおよびCaMKIIおよびミトコンドリアターゲティング配列(ミトコンドリア標的配列)で構築した。インビトロミトコンドリアCa2+イメージングでは、PMIDを培養したアストロサイトおよびニューロンにトランスフェクトしてGCaMP5G/6sを発現させた。インビボミトコンドリアCa2+イメージングでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を調製し、マウス脳に注入し、アストロサイトおよびニューロンのミトコンドリアでGCaMP5G/6sを発現させた。我々のアプローチは、細胞質とミトコンドリアCa2+シグナル伝達の関係を研究するために、アストロサイトとニューロンにおけるミトコンドリアCa2+ダイナミクスを画像化する有用な手段を提供する。

本研究の目的は、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるGECを用いたミトコンドリアCa2+シグナルを画像化する方法論を提供することであった。インビトロおよびインビボミトコンドリアCa2+イメージングの結果をここに提示する。
培養されたアストロサイトおよびニューロンにおけるインビトロミトコンドリアCa2+シグナル伝達 ミトコンドリアCa2+アストロサイトへの取り込みはATPアプリケーションによって引き出され、ニューロンにおけるミトコンドリアCa2+取り込みは、灌流系を介したグルタメートおよびグリシンの適用によって引き出すことができる。図2および<strong cl...

このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+ イメージングの方法を提供することを目的としています。

遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

この手順のデモンストレーションは、大学院生のZhe Zhang、研究スペシャリストの南南張、イルカー・オズデン教授、シンフア・ディンです。この手順の全体的な目標は、遺伝子組み換えカルシウム指標、GCaMP5Gおよび6sを使用してイメージングのインビトロおよびインビボミトコンドリアカウントのための細胞型特異的な対アストロサイトとニューロンおよびミトコンドリアターゲティング方法を開発することです。インビトロまたはインビボイメージングでは、アストロサイトまたはニューロン特異的プロモーターgfaABC1DまたはCaMKIIおよび遺伝子組み換えカルシウム指標であるGCaMP5G/6sをミトコンドリア標的配列で含むDNAプラスミドを構築します。インビトロミトコンドリアカルシウムイメージングでは、リポフェクタミン法を用いて前述のDNAプラスミドを用いてガラスカバースリップで培養したアストロサイトニューロンをトランスフェクトしました。画像化は、蛍光または2光子顕微鏡下でガラスカバースリップを拡散室に移すことによって、トランスフェクションの1〜2日後に開始することができる。左側にGCaMP6sを発現するミトコンドリアやアストロサイトからの蛍光シグナルの例を、右側にGCaMP5Gを発現するニューロンのミトコンドリアについて紹介します。インビボイメージングでは、細胞内のミト-GCaMP6s発現に対する細胞-GCaMP5Gおよび血清型9の発現に関連するアデノウイルスに関連する血清型5を用意した。立体ウイルス注射手術では、まず3%イオブルランでマウスを麻酔しました。手術の後、イオブルランレベルは、麻酔の適切なレベルに達した後に2%に減少し、頭皮の上の毛髪を剃り、マウスは立体性外科手術器具に配置されます。眼科軟膏は、手術中にそれらを保護するために目に適用されます。注射手術は無菌の器械および無菌の技術を含む無菌のプロシージャを使用して行われる。手術器具は、オートクレーブまたはホットビーズ滅菌装置によって滅菌されます。マウスを立体税に取り付けた後、頭皮をベタジンと70%エタノールで3回洗浄します。その後、皮膚はブレグマラムダ軸に沿って切り開き、垂直はターゲットの位置上の高速ドリルによって行われます。本研究では、運動皮質またはパラコルテックスのいずれかを対象とした。関連するアデノウイルスベクターを運ぶ33ゲージのハミルトン注射器が脳に穴を通して挿入され、標的領域にベクターが注入される。皮質分娩のために、我々は複数のステップで2つの深さでウイルス溶液を注入する。まず、針を1ミリメートル深く皮質に挿入します。脳が回復するまで5分を許した後、針を700マイクロメートルの深さまで動かし、500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが脳内で拡散できるように5分待ちます。そして、針を深さ300マイクロメートルの2番目の注射位置まで移動します。ここでは、さらに500ナノリットルのウイルス溶液を注入します。注射が完了した後、ウイルスが拡散するのを10分間待ってから、脳から針を取り除き、骨ワックスまたはKwik-Silでバリ穴を閉じます。最後に、皮膚はVetbondで縫合され、マウスは動物施設に送り返される前に加熱パッドで回収される。マウスは、GCaMP発現が成熟する期間である、最低3週間でインビボイメージングに使用する準備が整います。頭蓋窓の注入の外科は注入の外科のために記述されるように無菌条件を使用してまた行われる。頭蓋窓の外科的処置は、頭蓋骨暴露の時点まで注射外科手術と同一である。頭蓋骨が露出すると、ウイルス注入領域上の直径2〜3mmの開頭術の四分の一は、マニピュレータに取り付けられた高速ドリルによって作られた4つの浅い穴でマークされます。その後、頭蓋骨のセクションは、頭蓋骨切開術の峡谷で、これらの4つの穴を結び、円の中で骨を慎重かつゆっくりと掘削することによって薄くなる。国境の頭蓋骨が十分に薄い場合、骨は鋭いピンセットで持ち上げられ、取り除かれます。露出した硬膜は頭蓋窓の注入のために取除くか、またはそのまま保つことができる。頭蓋窓は直径3~5ミリのガラスカバースリップで構成され、中心に約300ミクロンの厚さのシリコーンディスクが作成されています。頭蓋窓の取り付けは、頭蓋骨の上に置くことによって達成される。マニピュレータに取り付けられた爪楊枝の一部は、頭蓋窓を脳の表面にそっと押し込むために使用されます。次いで、頭蓋窓の縁部を少量のシリコーン接着剤Kwik-Silで密封する。最後に、頭蓋の窓は、歯科アクリルで頭蓋骨の縁に固定されています。強い結合のために頭蓋窓の端にわずかに歯科用アクリルを適用するためのケアを与える必要があります。他の多くの研究グループが過去に実施したように、1.2%のアガロースゲルをシリコンディスクの代替としてカバーガラスと脳の間で使用することができます。頭蓋窓がしっかりと取り付けられた後、頭蓋骨に金属板が取り付けられます。このヘッドプレートは、イメージングセッション中に2光子顕微鏡のステージ上でマウスの頭部を固定するために使用されます。アストロサイトにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みはATDの適用によって引き出され、ニューロンのミトコンドリアカルシウム取り込みは、灌流系を介した重力を伴う人工脳脊髄液中のグルタミン酸グリシン用途によって引き出すことができる。その後、アストロサイトおよびニューロンにおける個々のミトコンドリアにおけるカルシウム取り込みは観察され得る。以下の映画は、左のATPによって引き出されるアストロサイトと、右のグルタミン酸とグリシンによって引き出されるニューロンにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みについて示しています。イメージングは、コヒーレントから100万台のTiサファイアウルトラレーザーを搭載したプレーリーテクノロジーズのウルティマ2光子顕微鏡システムを備えたアストロサイトおよびニューロンのミトコンドリア蛍光シグナルの時間経過2光子画像を収集することによって行われます。880~910ナノメートルの励起波長を使用しており、GCaMP5Gや6sでのインビボイメージングに最適です。有限体細胞およびマイト-GCaMP5Gおよび6sのニューロン特異的発現と、SR101またはニューロン特異的マーカーNeuNのアストロサイト特異的標識の共局在化により再確認した。生体内のアストロサイトおよびニューロンにおける自発的なミトコンドリアカルシウム取り込みは、2光子顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングによって観察することができる。画像は、左のアストロサイトと右側のニューロンの個々のミトコンドリアで自発的なカルシウムの増加を示しています。我々のアプローチは、細胞型特異的ミトコンドリアカルシウムイメージングインビトロおよびインビボに有用である。このビデオを見た後, あなたは、アストロサイトとニューロンでミトコンドリアカルシウムの取り込みを画像化する方法をよく理解している必要があります。.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良​​い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。...

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

このビデオでは、培養細胞におけるミトコンドリアカルシウムの取り込みを測定するための共焦点顕微鏡イメージングベースのアッセイについて説明しています。このアッセイでは、カルシウム感受性蛍光色素Rhod-2/AMを使用して、透過処理された培養細胞のミトコンドリアカルシウムを測定します。...

培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するためのカルシウム注入アッセイ

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神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

線条体におけるアストロサイトの細胞内Ca2+シグナルの特性と機能は、まだ完全には調査されていません。血清型2/5のアデノ随伴ウイルス(AAV2/5)を使用して、線条体アストロサイトで遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現する方法、および線条体アストロサイト内のCa2+シグナルをin...

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ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca2 +イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca2 +シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca2...

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

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レシオメトリック指標を用いた一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオンレドックス状態の生画像化

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遺伝子組み換え^Ca2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリア^Ca2+ 取り込み

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