Name: 微小電極アレイを用いた脊髄侵害受容回路におけるネットワーク活動の記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶ 微小電極アレイを用いたマウス脊髄背角スライスのネットワーク活動記録法。4-アミノピリジン刺激により痛み信号処理の回路ダイナミクスを高解像度で解析し、鎮痛薬スクリーニングのプラットフォームとして活用できます。

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この研究は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会(NHMRC)(B.A.G.およびR.J.C.への助成金631000、1043933、1144638、および1184974)とハンター医学研究所(B.A.G.およびR.J.C.への助成金)から資金提供を受けました。

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
<li>Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Aminopyridine+induces+expansion+of+cutaneous+receptive+fields+of+dorsal+horn+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells.</a> Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+oscillatory+Ca2%2B+waves+in+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn.</a> European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).</li>
<li>Egert, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).</li>
<li>Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays+for+electrophysiological+monitoring+of+hippocampal+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).</li>
<li>Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present+and+future+of+spike+sorting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Past, present and future of spike sorting techniques.</a> Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).</li>
<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+membrane+excitability+in+rat+spinal+lamina+I+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

侵害受容性シグナル伝達、処理、および痛みを特徴付ける結果として生じる行動的および感情的応答における脊髄DHの重要性にもかかわらず、この領域内の回路はほとんど理解されていないままである。この問題を調査する上での重要な課題は、これらの回路6,31,32を構成するニューロン集団の多様性であった。光遺伝学と化学遺伝学に牽引されたトランスジェニック技術の最近の進歩は、これらの重要なつながりを解き明かし始めており、感覚情報を処理する微小回路を定義し始めています1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 <sup...

脊髄DH内の特定のタイプの抑制性および興奮性介在ニューロンの役割は、急速な速度で明らかにされている1,2,3,4。一緒に、介在ニューロンはDHのニューロンの95%以上を占め、侵害受容を含む感覚処理に関与しています。さらに、これらのニューロン間回路は、末梢信号が神経軸を上昇して脳に到達し、痛みの知覚に寄与するかどうかを決定するために重要である5、6、7。今日まで、ほとんどの研究は、in vitro細胞内電気生理学、神経解剖学的標識、およびin vivo行動分析の組み合わせを用いて、単一細胞または生物全体の分析のいずれかでDHニューロンの役割を調査してきた1,3,8,9,10,11,12,13,14 .これらのアプローチは、疼痛処理における特定のニューロン集団の役割の理解を著しく進歩させた。しかし、特定の細胞型と小さなマクロ回路が、マイクロ回路レベルでニューロンの大規模な集団にどのように影響し、その後DHの出力、行動応答、および疼痛経験を形成するかを理解するには、ギャップが残っています。
マクロ回路または多細胞レベルの機能を調査できる技術の1つは、微小電極アレイ(MEA)15,16である。MEAは、数十年にわたって神経系の機能を調査するために使用されてきました17,18。脳内では、ニューロン発生、シナプス可塑性、薬理学的スクリーニング、毒性試験の研究が容易になりました17,18。これらは、MEAの種類に応じて、インビトロおよびインビボの両方の用途に使用できます。さらに、MEAの開発は急速に進化しており、さまざまな電極番号と構成が利用可能になりました19。MEAの主な利点は、複数の電極を介して高い空間的および時間的精度で多くのニューロンにおける電気的活動を同時に評価する能力である15,16。これは、ニューロンが回路およびネットワーク内で、制御条件下で、局所的に適用された化合物の存在下でどのように相互作用するかのより広範な読み出しを提供する。
in vitroDH製剤の1つの課題は、進行中の活性レベルが典型的には低いことである。ここでは、この課題は、DH回路を化学的に刺激するために電位依存性K+チャネル遮断薬である4-アミノプリイジン(4-AP)を使用する脊髄DH回路で対処されています。この薬剤は、以前は急性脊髄スライスのDHにおいて、および急性in vivo条件下でのリズミカルな同期電気的活性を確立するために使用されてきた20、21、22、23、24。これらの実験は、4−AP誘導活性20、21、22、23、24、25を特徴付けるために、単一細胞パッチおよび細胞外記録またはカルシウムイメージングを用いてきた。一緒に、この研究は、リズミカルな4-AP誘導活性のための興奮性および抑制性のシナプス伝達および電気シナプスの要件を実証した。したがって、4-AP応答は、薬物誘発性エピ現象としてではなく、生物学的関連性を有する天然の多シナプスDH回路を覆い隠すアプローチとして見なされてきた。さらに、4-AP誘導活性は、神経因性疼痛状態として鎮痛薬および抗てんかん薬に対して同様の応答プロファイルを示し、コネキシンなどの新規な脊髄ベースの鎮痛薬標的を提案するために使用されている20、21、22。
ここでは、MEAsと脊髄DHの化学的活性化を4-APと組み合わせて、この侵害受容回路をマクロ回路またはネットワークレベルの分析で研究する調製物が記載されている。このアプローチは、素朴で神経因性の「痛みのような」条件下で侵害受容回路を調査するための安定した再現可能なプラットフォームを提供する。この調製物はまた、既知の鎮痛薬の回路レベルの作用を試験し、亢進性脊髄における新規鎮痛薬をスクリーニングするためにも容易に適用可能である。

<table><tbody><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (カルボゲン - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>湾曲したロングハンドルスプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15015-11</td><td></td></tr>カスタム<tr><td>メイドエアインターフェースインキュベーションチャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>鉗子デュモン#5</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>11251-30</td><td></td></tr>グル<tr><td>コース</td>サー<td>モフィッシャーAJA783-500G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>セバ</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>大型手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>ロックタイト 454 インスタント接着</td><td>ボルトと工業用品</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEAs、3 次元</td><td>マルチチャネル システム</td><td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti、60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 窒化チタン (TiN) 電極、1 つの内部参照電極、8x8 の正方形グリッドに整理されています。電極は12&マイクロです。直径m、40&micro;m(100/12/40)または50&マイクロ;m(200/12/50)高さと等間隔100&micro;m(100/12/40)または200&マイクロ;m(200/12/50)離れています。</td></tr><tr><td>MEAヘッドステージ</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>MEAインターフェースボード</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>MCS-IFB 3.0 マルチブート</td><td></td></tr><tr><td>MEAネット</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>MEA灌流システム</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>PPS2 MEAs</td><td></td></tr><tr><td>、平面</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>60MEA200/30iR-Ti、60MEA500/30iR-Ti</td><td>60個の窒化チタン(TiN)電極と1個の内部参照電極、8x8の正方形グリッド(200/30)または6x10の長方形グリッド(500/30)のいずれかに編成されています。電極は30&マイクロです。直径はm、等間隔は200&マイクロ。m(200/30)または500&マイクロ;m(500/30)離れています。</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td></td><td>Motic Moticam X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルアナライザーソフトウェア</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>マルチチャンネル実験ツール</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>ロンゲール</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>小型スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>小型手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤シア</td><td></td><td></td><td>ノアクリレート接着剤</td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>アブカム</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>ニューポート</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

微小電極アレイを用いた脊髄侵害受容回路におけるネットワーク活動の記録

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

脊髄後角(DH)内の特定のタイプのニューロンの役割と接続性は、脊髄疼痛処理を支える回路のますます詳細なビューを提供するために、急速に描写されています。しかし、DHにおけるより広範なネットワーク活動に対するこれらの接続の効果は、ほとんどの研究が単一のニューロンおよび小さな微小回路の活動に焦点を当てているため、あまりよく理解されていないままである。あるいは、多くの細胞にわたる電気的活動を監視できる微小電極アレイ(MEA)の使用は、神経活動の高い空間的および時間的分解能を提供する。ここでは、4-アミノピリジン(4-AP)でDH回路を化学的に刺激することによって誘導されるDH活性を研究するために、マウス脊髄スライスを有するMEAの使用が記載されている。結果として生じるリズミカル活性は、表在DHに制限され、経時的に安定し、テトロドトキシンによって遮断され、異なるスライス配向で調査することができる。一緒に、この調製物は、ナイーブ動物、慢性疼痛の動物モデル、および遺伝的に変更された侵害受容機能を有するマウスからの組織におけるDH回路活性を調査するためのプラットフォームを提供する。さらに、4-AP刺激脊髄スライスにおけるMEA記録は、脊髄DHにおける活性を破壊する新規抗侵害受容性化合物の能力を評価するための迅速なスクリーニングツールとして使用することができる。

脊髄後角におけるネットワーク活動モデル 4-APの適用は、脊髄DHにおける同期リズミカルな活動を確実に誘導する。このようなアクティビティは、EAP および LFP の増加として表示されます。後述の信号は、MEA記録30において既に説明した低周波波形である。薬物適用後のEAPおよび/またはLFP活性の変化は、神経活動の変化を反映する。EAP および LFP の例を図 3B および図 4 に示します。ここでは、EAP/LFPデータの次のパラメータまたは特徴に焦点を当てています:周波数、総数、アクティブ電極数、複数の電極にわたって検出された一致イベントの数、リンクされた隣接する電極の数、および隣接する電極間の結合の強さによって特徴付けられる同期性。代表的な結果を表3及び図3、図4、図5、図6、図7</st...

脊髄後角におけるネットワークレベルの侵害受容活性を調査するための微小電極アレイ技術と4-アミノピリジン誘発化学刺激の併用が概説される。

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

ご説明のMEA 4-AP脊髄スライス調製物は、背角回路の接続性および脊髄感覚処理中にこれらのネットワークがどのように相互作用するかを研究するためのプラットフォームを提供します。提示された方法論は、背側角回路の活動を巨視的な領域レベルの分解能で調査することを可能にする。この調製物は、脊髄感覚回路におけるシグナル伝達を破壊する化合物の能力を評価するための迅速なスクリーニングツールとして使用することができる。この方法は、特定の細胞型および小さな微小回路の活動がニューロンの大規模な集団にどのように影響し、その後、背角行動応答の出力、そして最終的には痛みの経験を形成するかについての理解のギャップを埋めるのに役立ちます。まず、MEAを馬血清で30分間よく満たします。血清を除去した後、蒸留水が非発泡になるまでMEAを蒸留水で5回十分にすすいでください。その後、ウェルを人工CSFで満たします。麻酔をかけたマウスを断頭した後、腰の高さで皮膚に小さな切り込みを入れて、腹部の上の皮膚を除去します。次に、すべての皮膚が胸郭の上部から骨盤の上部まで、腹側および背側の両方で除去されるまで、切り込みの両側の皮膚を吻方向に引っ張る。体を氷の上に置いた後、腹側アプローチを使用して、内臓を取り外し、肋骨を横方向に胸骨まで切断して、椎骨柱を露出させます。腹側胸郭、肩甲骨の両方、および下肢および骨盤を取り外す。椎骨柱および肋骨標品を氷冷スクロース人工CSFを含む解剖浴に移す。下背筋と付属の上肋骨にピンを配置して、準備の4つの角をすべて固定します。椎骨の腹側表面を覆っているすべての筋肉および結合組織をロンガーで取り除き、T12-L2椎体のほぼ下にある腰 - 仙骨拡大の上の椎体領域を特定する。椎体尾部を腰 - 仙骨拡大領域に除去して、椎骨管に座っている脊髄にアクセスする。湾曲したスプリングはさみを使用して、椎骨の腹側と背側の側面を分離し、脊髄を露出させるために、椎体を吻側に持ち上げて引っ張りながら、椎体椎弓根を両側に切断する。椎体が取り除かれて腰 - 仙骨の拡大が現れたら、コードが自由に浮かぶまで、脊髄を固定する残りの根をスプリングハサミで慎重に取り除きます。腰 - 仙骨の拡大の上下に吻側および尾側の切り込みで脊髄を分離し、コードの標的領域が自由に浮かぶようにする。横方向のスライスの場合は、中央に浅いチャネルカットが施されたプレカットポリスチレンブロック上に、腰部 - 仙骨セグメントを取り付けたルートで持ち上げて配置します。次に、シアノアクリレート接着剤を使用してブロックとコードをセクショニングプラットフォームに取り付け、氷冷スクロース人工CSFスラリーを含む切断浴に入れます。厚さ300マイクロメートルのスライスが得られたら、スライスを酸素化人工CSFを含む空気界面インキュベーションチャンバに移し、スライスを室温で1時間平衡化させる。背側ホーン活動の記録を開始するには、人工CSFで満たされた大きなチップパスツールピペットを使用して、スライスをインキュベーターからMEAウェルに移し、追加の人工CSFを追加します。細かい短いヘアペイントブラシを使用して、スライスを60電極記録アレイの上に置きます。次に、組織の上に加重首を置き、所定の位置に保持し、MEA電極との良好な接触を促進します。MEA を記録ヘッドステージに配置します。倒立顕微鏡を使用して電極上の組織の位置を確認し、できるだけ多くの電極が表層DHの下にあることを確認します。少なくとも 2 ~ 6 個の電極がスライスに接触していないことを確認します。カメラをデバイスに接続した後、解析中に使用するために、MEAを基準としたスライスの基準画像を撮影します。次に、記録ソフトウェアのスタートDAQを押し、すべての電極がクリア信号を受信することを確認します。次に、灌流入口と出口のラインを人工CSFで満たされたMEAウェルに取り付け、灌流システムをオンにします。流量を確認し、流出がスーパーフューセートのオーバーフローを防ぐのに十分であることを確認してください。組織を5分間平衡化した後、生のベースラインデータを5分間記録する。灌流入口ラインを人工CSFから4-アミノピリジン溶液に移動し、4-アミノピリジン誘発リズミカル活性が定常状態に達するまで12分間待つ。次いで、4−アミノピリジン誘導活性の5分間を記録し、薬物を試験するか、または4−アミノピリジンの安定性をチェックするために、その後の記録のために準備される。各記録セッションに続いて、人工CSFでラインをすすぎます。MEAをヘッドステージから取り出し、MEAウェルからネットと組織を取り除いた後、MEAとネットを人工CSFですすぎ、新しいスライスでプロセス全体を繰り返す。解析ソフトウェアを開き、あらかじめ作成された解析レイアウトをロードします。目的のファイルを開き、参照電極と、ノイズが多すぎると見なされる電極の選択を解除します。分析のタイム ウィンドウを設定します。次に、クロスチャンネルフィルタータブに移動します。実験中に撮影した画像とメモに基づいて複雑な参照電極と参照電極を選択し、続行する前に[探索]を押します。「EAP フィルター」タブに移動し、2 次ハイパス・バターワース・フィルターを適用して LFP アクティビティーを除去します。LFP フィルター タブに移動し、2 次バンド パス バターワース フィルターを適用して EAP アクティビティを削除します。EAP 検出器タブで、自動しきい値を選択し、立ち上がりエッジと立ち下がりエッジのボックスにチェックを入れ、デッドタイムを 3 ミリ秒に設定してください。正と負のしきい値を設定するには、生データ アナライザー画面に戻り、タイム マーカーを移動して EAP 検出器タブに戻り、探索を押して、データを検査します。設定された検出しきい値がノイズや非生理学的活性をキャプチャせずにEAPをキャプチャするまで、このプロセスを繰り返します。LFP検出器タブで、手動しきい値を選択し、立ち上がりエッジと立ち下がりエッジボックスにチェックを入れ、デッドタイムを3ミリ秒に設定してください。1 つの電極にしきい値を設定し、満たされたら、[すべてに適用] を選択し、[解析の開始] を押します。電圧ゲートナトリウムチャネルアンタゴニストテトロドトキシンの浴中適用は、EAPおよびLFP活性の両方を消失させ、これらのシグナルのスパイク依存性を確認した。4−アミノピリジン誘導活性パラメータの安定性を、EAPまたはLFPについて特徴付けた。すべての活性特性にLFPに対する活性の一致を加えたものは、4-アミノピリジン適用後12分および15分後における4-アミノピリジン誘導活性の類似性に基づいて安定していた。この機能のEAPまたはLFPは、複数の電極にわたって検出された一致イベントの数の増加によって特徴付けられました。連結された隣接電極の数、および4−アミノピリジン刺激後の隣接電極とLFPsとの間の結合の強さ、次いで相対的安定性。スライスの向きは、in vitro製剤にとって重要な考慮事項です。4−アミノピリジン刺激は、スライス配向に関係なくSDHにおいて同様のリズミカル活性を誘導した。最後に、DHネットワークの4-アミノピリジン活性化の関連性にさらなる光を当てるために、上昇したカリウム人工CSF溶液を浴適用し、4-アミノピリジン刺激に対する同様のDH応答を喚起することを示した。プロトコルの重要なステップは、組織の準備と切片の配置にあり、慎重だがタイムリーな解剖、およびMEA上の組織の繊細な最適な位置決めを通じて組織が健康であることを保証することは、質の高い結果を得るのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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微小電極アレイを用いた神経回路網の電気生理活性の測定

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多電極アレイを用いた初代マウス渦巻神経節ニューロンの神経活動の解析

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ラットの脊髄運動ニューロンの経脊髄直流刺激

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微小電極アレイを用いたマウス脊髄切片における神経回路の評価

このビデオは、ラットのC線維神経伝導の単線維記録を示しています。麻酔をかけたラットを切開して坐骨神経を露出させ、下肢に感覚と運動の供給を提供します。その後、個々のCファイバーが露出します。足に埋め込まれた刺激電極を用いて電気刺激を行い、1本の神経線維から反応を記録します。...

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微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー...

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

我々 は自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で下角と局所電界電位を同時に記録する技術を開発しました。この手法は、侵害受容情報の脳内処理の検討を容易にするメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical...

大脳皮質の局所電界電位と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で Electrocorticograms の同時録音

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

このプロトコルは、同時のトランス脊髄直流刺激を用いたラット腰椎モトニューロンの生体内細胞内記録について説明する。この方法により、膜の特性を測定し、脊髄のアノーダルまたは陰極分極化の前後にモトニューロンのリズミカルな発火を記録することができます。...

生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

トランスレーショナルペイン研究のためのオープンソースのリアルタイム閉ループ電気閾値追跡

ここでは、急性麻酔下のin vivo...

麻酔ラットにおける末梢疼痛ブロックを評価する電気生理学的手法

学ぶ 微小電極アレイを用いたマウス脊髄背角スライスのネットワーク活動記録法。4-アミノピリジン刺激により痛み信号処理の回路ダイナミクスを高解像度で解析し、鎮痛薬スクリーニングのプラットフォームとして活用できます。

微小電極アレイを用いた脊髄侵害受容回路におけるネットワーク活動の記録

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