Name: 感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎（PMU）モデルによるマウスの眼内炎症誘導法。熱殺菌マイコバクテリアを用いて慢性免疫介在性眼炎症を研究し、新規治療法の評価に応用できます。

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この研究は、米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所(KP)K08EY0123998、(KP)R01EY030431、(KP)R21 EY02939、UWビジョン研究コア助成金(NEI P30EY01730)、マークデイリー、MD研究基金、クリストファーアンドアリダレイサム研究基金からの贈り物、失明予防研究からの無制限の部門助成金、および失明予防研究(KP)からのキャリア開発賞。ブリストルで実施された作業は、サイトリサーチUKとアンダーウッドトラストからの追加資金提供によってサポートされました。

著者らは、開示すべき金銭的対立はない。

ブドウ膜炎の動物モデルは、眼の炎症と恒常性のメカニズムを理解し、ブドウ膜炎患者の医学的および外科的治療の前臨床評価を可能にするのに役立ちました37。PMUモデルのウサギとラットの両方のバリアントは、概念実証研究38、39、40を通じて前臨床治療におけるその価値を実証しています。マウスには多様なトランスジェニック株が利用できるため、マウスPMUモデルシステムを確立することで、この病気の病態に寄与する特定の細胞型、経路、および遺伝子を特定するためのより詳細な機構研究が可能になりました。
ブドウ膜炎の動物モデルは、炎症の発生率と強度における動物間の変動性を示すことができます41。C57BL/6マウス系統では、ここで概説したプロトコルを使用してPMUを確実に生成します。ブドウ膜炎の経過と強度の株特異的な変動は、EAUとEIUの両方で報告されています42,43。.PMUの重症度と経過に対する株特異的な影響は実験的に測定されていませんが、このモデルは野生型C57BL / 6Jおよびアルビノマウス(B6(Cg)-Tyrc-2J / J)で使用され、同様の炎症反応を引き起こしました。PMUモデルを生成する際に、以下にリストされている考慮事項を制御することは、新しい研究者が変動性を制限し、最も一貫性があり再現性のあるブドウ膜炎を生成するのに役立ちます。
皮下注射の一貫性を確保します。 一貫した皮下注射を提供するには、すべての気泡がエマルジョンから除去されていることを確認してください。考慮事項には、シリンジをロードする前に、事前に作成されたエマルジョンの短い遠心分離機(400 x gで30秒)が含まれます。これにより、エマルジョンに閉じ込められた空気が除去されます。また、シリンジを装填するときは、定期的に反転(チップアップ)して軽くたたいて気泡を取り除きます。注射中は、筋肉内注射を避けるために注射器を深く入れすぎないでください。逆に、浅い(皮内)注射は、皮膚を通してエマルジョンの侵食をもたらし得る。濃厚な粘性エマルジョンを完全に注入し、皮膚からの逆流を防ぐために、注射部位から注射器を取り外す前に少し一時停止することを忘れないでください。
皮下注射をしてから7日後に、後肢の両側に触知可能な結節の存在を確認します。結節が特定できない場合は、エマルジョンではなく空気が注入された可能性があります。この場合、急性炎症はそれほど堅牢ではない可能性があり、慢性炎症は発症しない可能性があります。
感染性眼内炎の発症を予防する: 細菌性または真菌性眼内炎は、予防されない場合、交絡変数を生成します44。細菌性眼内炎を予防するために、硝子体内懸濁液を作るときは、常に優れた無菌技術を実践し、目に触れるすべての再利用可能なツールを取り扱い、洗浄してください。滅菌済みの使い捨てアイテムの使用、オートクレーブ、または95%アルコール洗浄またはワイプによる洗浄が重要です。眼の表面、まぶた、および眼周囲の毛皮に適用されるベタジンの適切な使用も、眼内炎の予防に役立ちます45。注射後の経過中に眼の構造が極度の炎症によって消滅するため、感染のある目を認識するのは簡単です。これはPMUでは一般的ではありません。眼内出血の存在はまた、眼内炎または注射による外傷を示唆し得る。そのような場合は、これらの動物を研究から除外してください。
硝子体内注射の一貫性を確保します。 硝子体内注射は、PMUにおける信頼性が高く再現性のある炎症の誘発における重要なステップです。各注射で一定量のMtb懸濁液を提供すること、外傷を回避すること、および懸濁液の逆流を防ぐことはすべて、注射を行う際に考慮すべき要素です。一貫した懸濁液を確保するために、解凍時およびシリンジに装填する前に、ストック懸濁液を完全にボルテックスします。使用されるこのMtb抽出物は溶液を形成しないため、懸濁液は時間の経過とともに沈降する可能性があります。各注射でMtb抽出物の濃度を均一にするには、装填後15分以内にシリンジを使用または排出してリロードします。フェニレフリンは、後眼に広い視野を提供し、注射中の眼への外傷のリスクを低減するために拡張に使用されます。この落下は、自然な蓋の収縮と地球のわずかなプロトーシスを生成し、鉗子で目をつかむ必要なしに、辺縁の後方1〜2 mmの領域を良好に視覚化できます。鉗子を使用して眼を拘束すると、潜在的な外傷を引き起こし、眼圧を一時的に上昇させ、Mtb懸濁液の逆流のリスクを高める可能性があります。外傷は、目に過度の量を注入しようとすることによっても引き起こされる可能性があります。眼圧の有意かつ長期にわたる上昇および眼への外傷を防ぐために、注入量は2μLに制限されている。さらに、若い動物は成体マウスよりも小さい目を持っています。典型的には、6〜8週間のマウス(20〜25g)は、均一な眼球サイズを提供し、Mtb注射後の炎症のより大きな一貫性を確保する。マイコバクテリア懸濁液の注射後逆流のより高い頻度が、より小さなマウスで観察された。これは、順番に、予想よりも少ない急性炎症につながります。希フルオレセイン溶液は、初心者のインジェクターに注入技術の成功に関する視覚的なフィードバックを提供するために使用されます。注射時の拡張は、硝子体腔内の注入された物質の直接視覚化を可能にし、水晶体外傷の証拠に注意する機会を与える。水晶体外傷の場合、水晶体の透明度が変化し、OCTで視覚化できる白内障を引き起こす可能性があります。眼の外傷の場合、水晶体誘発性ブドウ膜炎の可能性があるため、眼を研究から除外する必要があります46。Mtb懸濁液を眼内に分散させ、逆流を減少させるために、注射器を眼から取り外す前に10秒間一時停止することをお勧めします。
PMUモデルは、硝子体内注射におけるMtbの濃度を変えることによって急性炎症の強度を変えるように修正することができる。2.5 μg/μLから15 μg/μLまでのさまざまな投与量が、私たちのラボで以前にテストされています。しかし、10 μg / μLを超える用量は、自発的な水晶体破裂、重度の角膜浮腫と瘢痕化、および催眠症を含む重度の眼の損傷を引き起こすことが判明しました。.この程度の重症度は、感染後のブドウ膜炎を有するヒト患者では典型的ではないため、これらの濃度は推奨されない。5 μg / μLの用量は、軽度から中等度の急性炎症および軽度の慢性ブドウ膜炎を確実に引き起こすことがわかりました。10μg/μLの用量は、確実に中等度から重度の急性疾患およびより顕著な慢性疾患を引き起こす。したがって、硝子体内濃度を変化させることは、実験的質問に基づいて必要に応じて使用するための代替疾患重症度を提供することができる。結果がmTBへの反応によるものであり、皮下または硝子体内注射に関連する外傷ではないことを確認するために、コントロールを選択する必要があります。.偽注射コントロールでは、mTB抽出物の代わりにPBSを使用できます。曝露されていない動物と比較するために、真のナイーブサンプルは、仲間の目が常に同等であるとは限らないため、考慮する必要があります。
マウスの眼のサイズが小さいため、OCTは、直接可視化や顕微鏡明視野写真よりも前房の炎症を検出するためのより感度の高いアッセイになります。ラット25のPMUを用いた以前の研究では、OCTよりも組織学によってより多くの細胞を検出できるが、2つのモダリティの間には良好な相関関係があることが判明した。OCTには、同じ動物における炎症を縦方向にモニターするために使用できるという追加の利点があります。EAUやEIUなどの他の主要なブドウ膜炎モデルも、定量分析にOCTを採用しています12、47、48。マウスのPMUモデルでは、前房細胞はOCTでのみ見え、大きな低血圧が存在しない限り臨床検査では見ることができません。硝子体炎症(硝子体炎)はカラー眼底イメージングで観察できますが、定量的変化の検出はOCTイメージングでのみ可能です。網膜血管の炎症や網膜の損傷など、モデルの他の側面は、OCTと顕微鏡明視野眼底写真のいずれかで簡単に識別できます。
OCTを使用する場合、炎症の程度の地域差によって局所イメージングがどのように影響を受けるかを考慮することが重要です。以前の報告では、ヒトの前房内の細胞の分布が不均一であり、より多くの細胞が劣っていることが確認されています49。マウスでは、同様の素因が一般的です。したがって、ACを介した垂直または放射状のスキャンは、炎症の範囲をキャプチャする画像を確保するのに役立ちます。さらに、同じ場所でイメージングを実行すると、同じ目で縦方向に収集された画像にも一貫性が保たれます。目の同じ部分で画像を取得するには、安定したランドマークと体系的なアプローチを使用します。前房画像の場合、画像は角膜の頂点のすぐ隣の中心にあり、下角で低血圧の存在を検出できるように垂直に向けられています。後部セグメント画像の場合、画像は視神経を中心にしています。地域変動を確実にキャプチャするために、スコアリングに少なくとも3つのラインスキャンを使用することを検討することをお勧めします。炎症が末梢の場所に限定されている場合は、ボリュームスキャンを取得すると便利です。ボリュームスキャンの収集は、地域の変動をキャプチャするのにも役立ちますが、データストレージ要件が増加します。
PMUマウスモデルにおける炎症を特徴付けるために使用することができる他のインビボアッセイには、生物発光イメージングが含まれる13、35。マルチパラメータフローサイトメトリー分析のような死後アッセイを実施して、眼の水腔および後房に浸潤する免疫細胞型集団を同定および定量することができる12,26。PMUモデルでは、急性炎症は、好中球浸潤が優勢な自然応答と、それに続く慢性で持続的な適応T細胞優性応答が1か月以上持続することを特徴とします35。死後組織に対して実施することができる免疫機能の他のアッセイには、眼液サイトカイン分析が含まれる。さらに、mRNAシーケンシングや免疫蛍光イメージングなどの他のダウンストリームアッセイを使用して、ブドウ膜炎における網膜免疫細胞集団の遺伝子およびタンパク質発現パターンを評価することができます50,51。
PMUモデルは、異なる種に適した適応を使用して、他のげっ歯類システムで複製することができます。PMUモデルは、以前にラットおよびウサギで使用されてきた38、39、40。ラットでは、急性汎ブドウ膜炎は硝子体内注射後に発症し、組織学による慢性炎症の兆候を発症することなく14日間で自然に解消します24。ウサギでは、ブドウ膜炎の誘発は硝子体内注射の前に2ラウンドの皮下注射を利用しますが、強力な汎ブドウ膜炎も生成します。マウスモデルを使用する利点の1つは、ブドウ膜炎の基本的なメカニズムを理解するのに役立つ多数のトランスジェニックおよびノックアウト株がすぐに利用できることです52。すべてのげっ歯類モデルは、薬剤が全身または局所ドロップとして投与される場合、前臨床療法試験に使用できます。.ただし、サイズが大きいため、ラットとウサギの目は、ブドウ膜炎の埋め込み型または局所注射治療オプションの前臨床試験で使用するためのより良いモデルです。
要約すると、このプロトコルは、眼抗原による事前免疫に依存しない新しいツールを使用して、慢性眼の炎症のメカニズムを研究することに関心のある研究者を提供します。

「ブドウ膜炎」という用語は、すべてが眼内炎症を特徴とする不均一な一連の状態を表します1。ブドウ膜炎の動物モデルは、疾患メカニズムの理解や新しい治療法の前臨床試験に重要です。ブドウ膜炎の動物モデルが多数確立されている2。最も広く研究されている2つは、実験的自己免疫性ブドウ膜炎(またはブドウ膜炎;EAU)およびエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎(EIU)。EAUは、典型的には、眼抗原による免疫によって生成されるか、またはAIRE遺伝子の非存在下で中枢寛容が破壊されたときに自然発生的に起こり得る3,4。その後、モデルの他の変異体は、異なるブドウ膜生成ペプチドを含むように5,6,7開発されている。これらは広範囲にレビューされています8、9、10。EAUは、Vogt-小柳-原田病やバードショット絨毛網膜炎などのT細胞依存性自己免疫性ブドウ膜炎の形態の主要なモデルです。EIUは、細菌性リポ多糖(LPS)の全身または局所注射によって生成されます10,11。EIUは、自然免疫シグナル伝達経路12の活性化によって生じる急性ブドウ膜炎のモデルとして使用されている。どちらのモデルも、眼免疫学の現在の理解に役立っていますが、どちらも感染後の慢性ブドウ膜炎の効果的なモデルではありません。マウスで最近確立されたプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)モデルは、この形態のブドウ膜炎の臨床的および細胞的側面を調査および評価するためのアプローチを提供するようになりました13。
世界中でマイコバクテリア感染症の有病率が高く、2019年に世界保健機関によって1,000万人以上の新規症例と140万人以上の死亡が報告されています14。活動性結核(TB)感染の肺外症状にはブドウ膜炎が含まれ、感染性ブドウ膜炎のよく認識されている原因です15,16。結核関連ブドウ膜炎の症状はプロテアンであり、これは、直接眼感染やあまり理解されていない免疫介在性炎症を含む複数の異なる疾患メカニズムを反映している可能性があります17,18,19。これらの感染後後遺症の提案されたメカニズムには、網膜色素上皮(RPE)におけるパウチ菌感染の持続によって刺激される慢性炎症反応、正常に除去された眼感染からの残留病原体関連分子パターン(PAMP)の存在によって刺激される慢性炎症反応、および分子模倣または抗原のプロセスを介した眼抗原に対する適応免疫応答の不適切な活性化が含まれます。 全身性結核感染によって引き起こされる広がり20,21,22,23。
慢性感染後ブドウ膜炎の機構的理解をよりよく得、疾患の開始におけるマイコバクテリア抗原の役割を研究するために、マウスで使用するためにPMUモデルが開発された13,24。したがって、炎症を誘発するために、マウスはまず全身感染を模倣するために熱死した結核菌H37Ra株からの抗原の皮下注射を受け、続いて7日後に同じ抗原の硝子体内注射を受けて局所眼感染を模倣するために左または右眼に投与する。その後のブドウ膜炎の強度および持続時間は、縦方向のin vivo光干渉断層撮影(OCT)および眼底画像化25によってモニターされる。PMUは、硝子体炎、血管周囲網膜炎症、および網膜外損傷の病巣領域を伴う慢性T細胞優性後部ブドウ膜炎に発展する急性骨髄優性汎ブドウ膜炎を特徴としています26。眼の後部に肉芽腫性炎症が存在することは、PMUモデルを使用して、過去のMtb感染の免疫学的証拠を持つ患者に見られる、ある種の前部(肉芽腫性および非肉芽腫性)および中間ブドウ膜炎の研究に使用できることを示唆しています27。さらに、PMUモデルで使用された加熱死Mtbの成分は、抗結核療法(ATT)に反応する眼結核患者の再発性ブドウ膜炎の側面の根底にある免疫応答を引き起こすことが示唆されています28。PMUは、EAUやEIUと比較して疾患の開始と炎症経過が異なるため、眼抗原による免疫に依存しないブドウ膜炎の新しい動物モデルであり、慢性ブドウ膜炎患者の疾患メカニズムの解明に役立つ可能性があります。このプロトコルでは、PMUの生成、炎症の臨床経過のモニタリング、フローサイトメトリーによる死後分析のための眼サンプルの収集の方法を概説しています。

<table><tbody><tr><td>AK-FLUOR</td><td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td><td></td><td>10% フルオレセイン ナトリウム 100 mg/mL 5 mL バイアル</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Akorn Animal Health, IL, USA</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Xylazine 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution</td><td>Alcon, TX, USA</td><td>8007-1</td><td></td></tr><tr><td>B-D Precision Glide Needles -25 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>B-D Precision Glide needle -30-G</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Bond MAX, Bond Rx</td><td>Leica Biosystems, IL,USA</td><td></td><td>自動IHC染色システム</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール軟膏</td><td>Martindale Pharma, Romford, UK</td><td></td><td>1% w/w Chloramphenicol</td></tr><tr><td>EG1150H</td><td>Leica Biosystems, IL,USA</td><td></td><td>Tissue Embedding</td></tr><tr><td>Envisu R2300</td><td>Bioptigen/Leica</td><td></td><td>OCT Machine</td></tr><tr><td>Freund's Incomplete Adjuvant</td><td>BD Difco, NJ, USA</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal 潤滑剤 眼軟膏</td><td>アルコン, TX, USA</td><td></td><td></td></tr>---<tr><td>GenTeal 潤滑油アイジェル</td><td>アルコン, TX, USA</td><td></td><td></td></tr>---<tr><td>H37Ra 凍結乾燥マイコバクテリア抽出</td>物 <td>BD Difco, NJ, USA</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン RN ニードル (33/12/2)S</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>7803-05(33/12/2)</td><td>33 G</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>CAL7633-01</td><td>5 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>インスリン針</td><td>Exel International, USA</td><td>26029</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Zoetis, USA</td><td>377341</td><td>Ketamine HCL 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td><td></td><td>オルタナティブイメージング/OCTマシン</td></tr><tr><td>Nanofil 10 & micro;L シリンジ</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 眼内注射キット</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>IO-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dissection scope</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL</td><td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td><td></td><td></td>17478020115</tr><tr><td>RM2255</td><td>Leica Biosystems, IL,USA</td><td></td><td>Tissue Sectioning</td></tr><tr><td>TB Syringe</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td><td>309602</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Tetracaine 0.5%</td><td>Alcon, TX, USA</td><td>1041544</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek VIP series</td><td>Sakura Finetek USA, Inc.,CA.</td><td></td><td>組織学 組織処理</td></tr><tr><td>トロピカミド 1%</td><td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK</td><td></td><td>Minims</td></tr><tr><td>Tylenol</td><td>Johnson &Johnson Consumer Inc, PA, USA</td><td>NDC 50580-614-01</td><td>アセトアミノフェン</td></tr><tr><td>ビスコティアーズ</td><td>ノバルティスファーマシューティカルズ, キャンベリー, 英国</td><td></td><td>Carbomer アイジェル 0.2% w/w</td></tr></tbody></table>

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(pmu)

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

「ブドウ膜炎」という用語は、すべてが眼内炎症を特徴とする不均一な一連の状態を表します。大まかに言えば、ブドウ膜炎は病因によって定義されます:感染症または自己免疫。感染性ブドウ膜炎は適切な抗菌剤による治療を必要としますが、自己免疫性ブドウ膜炎はコルチコステロイドまたは他の免疫抑制剤による治療を必要とします。感染後ブドウ膜炎は慢性ブドウ膜炎の一種であり、最初の感染後に免疫後遺症を制御するためにコルチコステロイドが必要です。 結核菌 (Mtb)感染に伴うブドウ膜炎は、感染後ブドウ膜炎のよく知られた形態ですが、病気のメカニズムは完全には理解されていません。mTB感染後の慢性眼の炎症を刺激する上でマイコバクテリア抗原と自然リガンドが果たす役割を理解するために、マウスで使用するためにモデルPrimed Mycobacteria ブドウ膜炎(PMU)が開発されました。この原稿では、カラー眼底および光干渉断層撮影(OCT)イメージングを使用して、PMUを生成し、炎症の臨床経過を監視する方法を概説しています。PMUは、加熱死菌抽出物による免疫とそれに続く7日後に片方の眼への同じ抽出物の硝子体内注射によって誘発されます。眼の炎症は、in vivoイメージングを使用して縦断的にモニタリングされ、その後、組織学、フローサイトメトリー、サイトカイン分析、qPCR、またはmRNAシーケンシングを含む幅広いアッセイのためのサンプル収集が行われます。PMUのマウスモデルは、慢性ブドウ膜炎のメカニズムであるmTBに対する眼の反応の研究、および新しい抗炎症療法の前臨床有効性試験に有用な新しいツールです。

このプロトコルは、マウスにプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)を誘発するための手順を概説しています。この方法は、マウスモデルシステムで信頼性が高く堅牢な眼の炎症を引き起こすのに役立つ手順を概説します。このプロトコルを使用して、免疫学的、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスアッセイでさらに評価するために、単一の動物からブドウ眼と炎症を起こしていない仲間の目を生成しました。

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

このプロトコルは、マウスモデルで熱死したマイコバクテリアを使用して、信頼性が高く堅牢な眼の炎症を誘発する手順の概要を示しています。このプライミングされたマイコバクテリアブドウ膜炎モデルは、マイコバクテリア感染後に発症する慢性免疫媒介性眼炎のメカニズムを研究するのに役立ちます。慢性ブドウ膜炎のこのモデルは、特定のマウス系統の使用または眼抗原による免疫を必要としない。このモデルは、眼の炎症の病因の機構研究におけるトランスジェニックおよび遺伝子ノックアウトマウス株の使用を容易にします。このPMUモデルは、ヒトの眼の炎症またはブドウ膜炎の新しい治療法をテストする研究に役立ちます。新しい点眼薬や全身投与された免疫調節剤などの治療法は、このモデルで有効性をテストできます。このモデルは、熱死したマイコバクテリア抗原が目のような免疫特権器官の微小環境をどのように変化させるかの研究を容易にします。これらの結果は、他の種類の眼感染症が眼にどのように影響するか、または脳などの免疫特権部位が微小細菌抗原にどのように反応するかについての洞察も提供する可能性があります。まず、クランプを解除します ソニケーターコンバーターユニットの本体 70%アルコール綿棒でプローブを清掃します。次に、超音波処理器の電源を入れ、電源制御ノブを回して電源設定を4に調整します。次に、PBS中に結核菌H37Raの微細懸濁液を生成し、プローブの先端をPBS含有微小細菌粉末に浸漬する。氷上で混合物を30秒間超音波処理し、次いで30秒間休止し、液体を加熱せずに粉末を均一な懸濁液に完全に分散させるために合計5分間繰り返す。次に、2.5ミリリットルのフロイント不完全アジュバントを混合物に加え、エマルジョンが練り歯磨きのような粘稠度を形成するまで氷上で超音波処理プロセスを繰り返します。皮下注射の場合は、1ミリリットルの注射器に200〜300マイクロリットルのマイクロバクテリアエマルジョンをロードします。シリンジから空気を排出し、充填されるまで断続的な反転とタッピングでシリンジを充填し続けます。次に、6〜10週齢の麻酔をかけたC57黒6Jマウスの鼠径リンパ節の領域に近い腰の背側表面または脚の腹側表面のいずれかに皮下注射を行います。筋肉を貫通しないように注意しながら針を慎重に挿入し、50マイクロリットルのエマルジョンを皮下腔に注入します。濃厚なエマルジョンを完全に注入するために、すぐに針を取り外さないでください。硝子体内注射用の抗原ストックを調製するには、前述のようにPBS溶液中のH37Raを超音波処理し、次いで溶液を100マイクロリットルの容量に分注し、摂氏20度で保存する。注射当日、全身麻酔の深さを確認した後、0.5%テトラカイン1滴で角膜を麻酔し、2.5%フェニレフリン1滴で瞳孔を拡張します。余分な液体を軽くたたいた後、眼内炎のリスクを減らすために、目の表面と周囲の髪に5%ベタジンを1滴加えます。2〜3分後、ベタジンを取り除き、麻酔下での乾燥と白内障の形成を防ぐために、0.3%ヒプロメロースゲルで目を覆います。次に、抗原とフルオレセインの混合物を入れた10マイクロリットルの注射器をロードし、マウスをプラットフォーム上の腹臥位に置き、左右のイヤーバーを使用してマウスの頭を固定します。マウスをスコープの下に配置して向きを変え、右目の上鼻面が見えるようにします。次に、30ゲージの針を使用して、まつげを変位させ、強膜を露出させ、辺縁と橈骨血管を視覚化します。次に、滅菌済みの30ゲージ針を使用して、辺縁の後方1〜2ミリメートルの強膜にガイド穴を開けます。次に、注射ホルダーに取り付けられた34ゲージの針を、ガイドホールを通して、レンズを避ける角度で目に挿入しますが、針の先端を硝子体腔に入れます。マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、1マイクロリットルの結核菌抽出物を硝子体腔に慎重に注入します。一貫した逆流の場合は、適切な用量送達を確保するために注射量を1.5マイクロリットルに増やします。.目の緑がかった反射を視覚化して硝子体内配置を確認し、10秒後に針を目から外します。マウスを麻酔した後、2.5%フェニレフリンを1滴で瞳孔を拡張し、余分な液滴が鼻や口に入るのを防ぎます。2〜3分後、余分な液体を軽くたたき、0.3%ヒプロメロースゲルで目を覆います。次に、体の暖かさを維持するためにマウスを外科用ガーゼの層で包み、次にマウスを動物カセットの上に置き、バイトバーで頭を配置します。光干渉断層撮影またはOCT画像を取得するには、OCTイメージングシステムの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。後房イメージングの場合は、水晶体の表面が眼に接触しないように注意しながら、OCTを眼の表面に近づけてください。目が正しく配置されたら、高速スキャンを停止し、ボリュームスキャンプロトコルを選択して、[照準]オプションでスキャンをアクティブにします。後部セグメント画像の場合、視神経が水平Bスキャンアライメント画像の中心に揃い、網膜が垂直アライメント軸に揃うように調整します。前眼部画像の場合は、水平B-スキャンアライメント画像と垂直B-スキャンアライメント画像の両方で角膜の頂点を中央に配置するように位置を調整します。最後に、[スナップショット]をクリックしてボリュームスキャンイメージをキャプチャし、[保存]をクリックします。硝子体内注射の24時間後、水性および硝子体に炎症細胞が見られます。前房には角膜浮腫、低血圧、および複数の浮遊炎症細胞が見られ、後房には硝子体炎が見られます。眼の炎症の程度は、これらのOCT画像でスコアリングできます。ゼロより大きく2.5未満の合計スコアは、軽度の炎症を表します。スコアが 2.5 より大きく、4.5 未満。中等度の炎症を表し、4.5を超えるスコアは重度の炎症を識別します。炎症スコアは、ヘマトキシリンおよびエオジン染色切片に見られる5つの特性を使用して決定することもできます。重症度スコアは、水性および硝子体中の炎症細胞の数をカウントすることによって決定される。明視野縦眼底イメージングは、網膜および血管周囲の炎症を特定することもできます。重度の炎症を起こした眼は、カラー眼底イメージングで網膜に複数の白い浸潤と血管の曲がりを示し、2日目のOCTで高密度硝子体炎と網膜浮腫を示します。軽度の炎症を起こした眼は、眼底の目立たない線状病変がますます少なくなり、硝子体腔に多数の浸潤細胞が見られます。皮下注射および硝子体内注射中の一貫性を確保し、感染性眼内炎の発症を防ぐための適切な対策を講じることは、このモデルを正常に複製するのに役立つ重要なステップです。in vivo生物発光イメージングは炎症の特性評価に使用でき、マルチパラメーターフローサイトメトリー分析などの死後アッセイを実行して、浸潤免疫細胞タイプの集団を識別および定量化できます。サイトカイン分析、mRNAシーケンシング、および免疫蛍光イメージングを使用して、ブドウ膜炎の遺伝子およびタンパク質発現パターンを評価したり、網膜免疫細胞集団を特定したりできます。このプロトコルは、将来の研究者がマウスの硝子体内空間にアクセスするのに役立つ、再現性のある、無菌性、および最小限の外傷性注射を実行する方法を示しています。OCTは、小実験動物の目の目視検査では見逃されがちな眼の炎症を検出する上でも重要な役割を果たします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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このビデオは、感染後ブドウ膜炎のマウスモデルにおける眼の炎症を検出および定量化するためのin...

マウスモデルにおけるブドウ膜炎の評価のための光干渉断層撮影イメージング

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。...

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

このレポートでは、研究者がマウスモデルを生成できるようにするプロトコルを提示します 眼内ブドウ膜炎の。より一般的には実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)と呼ばれるこの確立されたモデルは、人間の病気の多くの側面を捉えています。ここでは、いくつかの読み出しを用いて疾患進行を誘導およびモニタリングする方法について説明します。...

実験的自己免疫性ブドウ膜炎:眼内炎症性マウスモデル

本プロトコールは、光干渉断層撮影を利用したマウス脈絡膜における黒色腫の移植および評価を記載する。...

光干渉断層撮影 による マウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

感染プロセス中に、重要なステップは、宿主細胞による病原体の付着です。ほとんどのインスタンスでこの接着ステップは、液体を流すことにより生成される機械的ストレスの存在下で発生します。私たちは、細菌の付着の研究において重要なパラメータとしてせん断応力を導入する手法を説明します。...

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

ワックス蛾ハチノスツヅリガの幼虫は、最近、 レジオネラ·ニューモフィラ感染を研究するためのin vivoモデルとして設立されました。ここでは、接種、細菌の病原性とレプリケーションの測定だけでなく、感染した血球の抽出と分析を含む幼虫にレジオネラ症の病因を特徴づける基本的な技術を実証する。...

使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

学ぶプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎（PMU）モデルによるマウスの眼内炎症誘導法。熱殺菌マイコバクテリアを用いて慢性免疫介在性眼炎症を研究し、新規治療法の評価に応用できます。

感染後ブドウ膜炎のモデルとしてのプライミングマイコバクテリアブドウ膜炎(PMU)

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