完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成
2021年8月10日
ここでは、定義されたプロテオリポソームにおける完全に精製された成分を用いたMsp1抽出活性の再構成のための詳細なプロトコルを提示する。
脂質二重層からタンパク質を除去するAAA-ATPasesの使用は、タンパク質の品質管理における一般的なテーマです。この本質的なプロセスの機械論的理解には、再構成されたシステムが必要です。AAA-ATPEsによる以前の再構成は複雑で異質であった。
当社のシステムはシンプルで完全に定義されています。これにより、AAA-ATPase Msp1、基質、脂質環境を操作することができます。まず、以前に調製した再構成バッファー、精製 Msp1 および TA タンパク質およびリポソームを PCR チューブに加え、氷上で 10 分間インキュベートします。
インキュベーション中に、P200ピペットチップの先端を直径約1/8インチに切ります。次に、バイオビーズを含むチューブを完全に渦液にして、均一な混合物を得る。次に、蓋を素早く取り外し、カットされたP200ピペットチップを使用して、適切な量のビーズを空のPCRチューブに移します。
10分間の再構成用インキュベーションが完了したら、ノーカットピペットチップを使用して、Bioビーズからすべての液体を取り除きます。その後、再構成の100マイクロリットルをBioビーズでチューブに移し、車輪で16時間回転させます。翌日、ピコフュージでチューブを回転させてビーズをペレット化し、再構成した材料をクリーンなPCRチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
リポソームへの再構成に失敗したタンパク質を除去するために、グルタチオンスピンカラムを抽出バッファで平衡化し、通常は400マイクロリットルのバッファで3ラウンドの洗浄を行い、続いて遠心分離して緩衝液を除去する。次に、再構成された材料に各シャペロンの5マイクロモルを加え、その後に100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、最大200マイクロリットルの体積を持ち込みます。この混合物を平衡化したグルタチオンスピンカラムに加え、スピンカラムを差し込んで30分間回転させ、シャペロンを樹脂に結合させます。
回転後、列を短く回転させます。凝集したタンパク質の枯渇したクリア済み材料であるフロースルーを収集します。氷の上に置き、抽出アッセイに直接進みます。
SDS-PAGE分析用のチューブを準備します。入力チューブに45マイクロリットルの二重蒸留水、フロースルーチューブに40マイクロリットルの水、各チューブに4X SDS-PAGEローディングバッファの16.6マイクロリットルを加えます。抽出アッセイの場合、抽出反応を調製し、抽出バッファーで最終容積を 200 マイクロリットルまで持ち出します。
その後、抽出アッセイを摂氏30度の熱ブロックで2分間温めます。アッセイを開始するには、ATPを2ミリモルの最終濃度に加えます。ピコフュージで5秒間チューブを回転させ、30°Cで30分間インキュベートします。
インキュベーション中に、反応の5マイクロリットルのサンプルを取り、入力チューブに加えます。また、先に示したように抽出アッセイ中の各サンプルについて1つのグルタチオンスピンカラムを平衡化する。30分間のインキュベーションが完了したら、200マイクロリットルの抽出バッファーをチューブに加えて、合計容量を400マイクロリットルにします。
次に、この反応を平衡グルタチオン樹脂に加え、摂氏4度で30分間回転させます。回転後、カラムを回転してフロースルーを集め、フロースルーチューブ用に10マイクロリットルのサンプルを取ります。400マイクロリットルの抽出バッファーで樹脂を2回洗浄し、洗浄後にフロースルーを廃棄します。
3回目の洗浄後、フロースルーを維持し、洗浄チューブ用に50マイクロリットルのサンプルを取ります。次に、抽出バッファー内の 5 ミリモルの最終濃度に還元されたグルタチオンを加えることによって溶出バッファーの 5 ミリリットルを準備します。.200マイクロリットルの溶出バッファーをスピンカラムに加え、5分間インキュベートします。
次に、カラムを遠心分離し、フロースルーを収集します。溶出のステップをもう一度繰り返します。2回目の溶出後、溶出サンプルから50マイクロリットルのアリコートを取り出し、それをエルテチューブに加えます。
ウェスタンブロットを実行した後、抽出効率は、エルト分数中の基質の量を入力画分と比較することによって決定することができる。フロースルーの信号はある程度の変動性を示していますが、一般的には入力分数に似ており、洗浄端数には信号がありません。典型的には、陽性対照に対して約10%の抽出効率があり、負の対照には1〜2%の抽出効率がある。
再構成条件が最適化されていない場合、抽出レベルは正サンプルと負サンプルの間で比較可能です。この技術により、私たちの研究室は、Msp1による認識に影響を与える基質の生物物理学的特性をテストすることができました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本記事では、定義されたプロテオリポソームを用い、完全に精製された成分を使用してMsp1の抽出活性を再構成するための詳細なプロトコルを提示します。本研究は、タンパク質の品質管理に不可欠なAAA-ATPaseの再構成プロセスの簡略化を目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 細胞生物学
背景
- AAA-ATPaseは、脂質二重層からタンパク質を除去する重要な役割を担っています。
- このプロセスのメカニズムを理解するには、再構成系が必要です。
- 従来の手法は複雑であり、不均一でした。
- 本研究では、シンプルで完全に定義された再構成系を提示します。
研究目的
- AAA-ATPase Msp1とその基質を操作するため。
- 研究用に定義された脂質環境を作成するため。
- タンパク質抽出メカニズムへの理解を深めるため。
使用方法
- 再構成バッファーの調製。
- 精製Msp1およびTAタンパク質の使用。
- PCRチューブへのリポソームの添加。
- 混合物を氷上で10分間インキュベート。
主な結果
- Msp1再構成のための簡便で効果的なプロトコルを確立した。
- 定義されたシステムにより、構成要素のより適切な操作が可能となる。
- 抽出プロセスの理解が深まった。
- 結果は、タンパク質の品質管理における効率の向上を示している。
結論
- 本研究は、AAA-ATPaseを研究するための簡便な手法を提供する。
- 本研究は、膜からのタンパク質抽出の理解に寄与する。
- 本プロトコルは、タンパク質の品質管理に関するさらなる研究に適用可能である。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルでは、ミトコンドリアのプロテオスタシスに関連する保存された品質管理経路である、AAA-ATPaseを介したタンパク質抽出のメカニズム的なリスク低減を可能にします。精製された成分を用いた完全に定義された再構成系を提供することで、神経変性疾患やがんを含むミトコンドリア機能不全に関連する疾患のターゲット検証およびアッセイ開発を支援します。このアプローチは、基質認識と抽出効率に影響を与える変数を単離することで、初期探索における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：Msp1が誤局在したテールアンカータンパク質を除去する役割を解析することを可能にし、ミトコンドリアのプロテオスタシス経路における機能的な標的バリデーションを支援する。
- 運用の価値：精製されたMsp1、TAタンパク質、およびリポソームを使用することで細胞の複雑性を排除し、ATPase、基質、および脂質環境の精密な操作を可能にする。
- 予測的価値：Msp1による基質認識の構造・機能解析を促進し、タンパク質抽出活性のモジュレーターとなるリード化合物の同定に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： ウェスタンブロットを用いて、投入量に対する溶出液中の基質レベルを比較することで抽出効率を測定する定量的抽出アッセイを確立します。
- 運用の価値： 標準化された条件を定義します：再構成のための10分間の氷上インキュベーション、BioBeadsを用いた16時間の回転、および30°Cでの30分間のATP駆動抽出とそれに続くグルタチオン溶出です。
- アッセイの準備状況： 出力結果には抽出効率（通常、ポジティブコントロールで約10%、ネガティブコントロールで1～2%）が含まれ、再構成形式でのヒット検出および用量反応スクリーニングが可能になります。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 臨床的意義：ミトコンドリアのプロテオスタシス機構を、Msp1の機能不全が癌、老化、および神経変性に関与している疾患モデルへと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：脂質組成や基質の生物物理学的特性など、抽出に影響を与える変数を分離することで、ターゲットへの結合を明確にし、前臨床段階におけるターゲット検証の曖昧さを軽減します。
- 継続性：最小限かつ制御可能な抽出モジュールを定義することにより、生化学的なターゲット検証から疾患関連システムにおける表現型スクリーニングへの移行を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は初期探索のプロセスに組み込まれており、タンパク質抽出のメカニズム解析を通じてターゲットのバリデーションを可能にします。これにより、スクリーニングカスケードに向けたアッセイ開発に有用な情報が得られ、ターゲットへの結合能やパスウェイ調節に基づいたgo/no-go判断がサポートされます。
- 発見生物学：脂質環境および基質の特徴が Msp1 ATPase 活性と抽出効率にどのように影響するかという仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：定義されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、ATPase 駆動の抽出に対する化合物の影響を評価するための、再構成された定量的プラットフォームを提供します。
- 分析：溶出画分と投入画分の Western blot 比較による抽出効率という測定可能なリードアウトを生成し、異なる条件間での統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：破壊されるとヒトの疾患に関連することがわかっている、保存された品質管理経路をモデル化することで、前臨床的な関連性につなげます。
- エンタープライズ再利用：定義されたリポソーム再構成システムにより、AAA-ATPase、基質特異性、または抽出の脂質依存性変調を研究するプロジェクト間での再利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：簡素化された定義済みのシステムを用いることで、タンパク質抽出経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：精製成分と段階的なプロトコル（再構成、BioBead処理、シャペロンのプレクリーニング、ATP駆動型抽出、グルタチオン溶出）により、再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：細胞または表現型アッセイを行う前に、ターゲット調節の可能性を早期に評価することを可能にし、意思決定（go/no-go判断）を改善する。
- ポートフォリオへの影響：メカニズム上の責任とターゲットの扱いやすさを明確にすることで、ミトコンドリア品質管理におけるターゲットのリスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の考慮事項
- タンパク質精製、リポソーム再構成、およびATPaseアッセイの設計に関する専門知識が必要です。
- ペレタイズのための超遠心機またはPicoFuge、グルタチオン・スピンカラム、および温度制御可能なヒートブロックへのアクセスが必要です。
- 抽出効率の再現性を確保するためには、研究室間で脂質組成、タンパク質：ホスホリピド比、およびATP濃度の標準化が必要です。
- 他のTAタンパク質やAAA-ATPaseへの適応には、再構成緩衝液、インキュベーション時間、およびビーズを用いた脂質除去ステップの最適化が必要となる場合があります。
- 実用上の制限として、ソースに記載されている通り、フロースルー信号の変動や、低存在量の基質に対するウェスタンブロットの感度への依存が挙げられます。
