完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成
2021年8月10日
ここでは、定義されたプロテオリポソームにおける完全に精製された成分を用いたMsp1抽出活性の再構成のための詳細なプロトコルを提示する。
脂質二重層からタンパク質を除去するAAA-ATPasesの使用は、タンパク質の品質管理における一般的なテーマです。この本質的なプロセスの機械論的理解には、再構成されたシステムが必要です。AAA-ATPEsによる以前の再構成は複雑で異質であった。
当社のシステムはシンプルで完全に定義されています。これにより、AAA-ATPase Msp1、基質、脂質環境を操作することができます。まず、以前に調製した再構成バッファー、精製 Msp1 および TA タンパク質およびリポソームを PCR チューブに加え、氷上で 10 分間インキュベートします。
インキュベーション中に、P200ピペットチップの先端を直径約1/8インチに切ります。次に、バイオビーズを含むチューブを完全に渦液にして、均一な混合物を得る。次に、蓋を素早く取り外し、カットされたP200ピペットチップを使用して、適切な量のビーズを空のPCRチューブに移します。
10分間の再構成用インキュベーションが完了したら、ノーカットピペットチップを使用して、Bioビーズからすべての液体を取り除きます。その後、再構成の100マイクロリットルをBioビーズでチューブに移し、車輪で16時間回転させます。翌日、ピコフュージでチューブを回転させてビーズをペレット化し、再構成した材料をクリーンなPCRチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
リポソームへの再構成に失敗したタンパク質を除去するために、グルタチオンスピンカラムを抽出バッファで平衡化し、通常は400マイクロリットルのバッファで3ラウンドの洗浄を行い、続いて遠心分離して緩衝液を除去する。次に、再構成された材料に各シャペロンの5マイクロモルを加え、その後に100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、最大200マイクロリットルの体積を持ち込みます。この混合物を平衡化したグルタチオンスピンカラムに加え、スピンカラムを差し込んで30分間回転させ、シャペロンを樹脂に結合させます。
回転後、列を短く回転させます。凝集したタンパク質の枯渇したクリア済み材料であるフロースルーを収集します。氷の上に置き、抽出アッセイに直接進みます。
SDS-PAGE分析用のチューブを準備します。入力チューブに45マイクロリットルの二重蒸留水、フロースルーチューブに40マイクロリットルの水、各チューブに4X SDS-PAGEローディングバッファの16.6マイクロリットルを加えます。抽出アッセイの場合、抽出反応を調製し、抽出バッファーで最終容積を 200 マイクロリットルまで持ち出します。
その後、抽出アッセイを摂氏30度の熱ブロックで2分間温めます。アッセイを開始するには、ATPを2ミリモルの最終濃度に加えます。ピコフュージで5秒間チューブを回転させ、30°Cで30分間インキュベートします。
インキュベーション中に、反応の5マイクロリットルのサンプルを取り、入力チューブに加えます。また、先に示したように抽出アッセイ中の各サンプルについて1つのグルタチオンスピンカラムを平衡化する。30分間のインキュベーションが完了したら、200マイクロリットルの抽出バッファーをチューブに加えて、合計容量を400マイクロリットルにします。
次に、この反応を平衡グルタチオン樹脂に加え、摂氏4度で30分間回転させます。回転後、カラムを回転してフロースルーを集め、フロースルーチューブ用に10マイクロリットルのサンプルを取ります。400マイクロリットルの抽出バッファーで樹脂を2回洗浄し、洗浄後にフロースルーを廃棄します。
3回目の洗浄後、フロースルーを維持し、洗浄チューブ用に50マイクロリットルのサンプルを取ります。次に、抽出バッファー内の 5 ミリモルの最終濃度に還元されたグルタチオンを加えることによって溶出バッファーの 5 ミリリットルを準備します。.200マイクロリットルの溶出バッファーをスピンカラムに加え、5分間インキュベートします。
次に、カラムを遠心分離し、フロースルーを収集します。溶出のステップをもう一度繰り返します。2回目の溶出後、溶出サンプルから50マイクロリットルのアリコートを取り出し、それをエルテチューブに加えます。
ウェスタンブロットを実行した後、抽出効率は、エルト分数中の基質の量を入力画分と比較することによって決定することができる。フロースルーの信号はある程度の変動性を示していますが、一般的には入力分数に似ており、洗浄端数には信号がありません。典型的には、陽性対照に対して約10%の抽出効率があり、負の対照には1〜2%の抽出効率がある。
再構成条件が最適化されていない場合、抽出レベルは正サンプルと負サンプルの間で比較可能です。この技術により、私たちの研究室は、Msp1による認識に影響を与える基質の生物物理学的特性をテストすることができました。
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概要
本記事では、定義されたプロテオリポソーム内で、完全に精製された成分を用いてMsp1の抽出活性を再構成するための詳細なプロトコルを提示します。本研究は、タンパク質の品質管理に不可欠なAAA-ATPaseの再構成プロセスの簡素化を目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 細胞生物学
背景
- AAA-ATPaseは、脂質二層からタンパク質を除去する上で極めて重要な役割を果たしています。
- このプロセスのメカニズムを理解するには、再構成系が必要です。
- 従来の手法は複雑で不均一なものでした。
- 本研究では、シンプルで完全に定義された再構成系を提示します。
研究目的
- AAA-ATPase Msp1およびその基質を操作すること。
- 研究のために規定の脂質環境を構築すること。
- タンパク質抽出メカニズムへの理解を深めること。
使用した手法
- 再構成バッファーの調製。
- 精製したMsp1およびTAタンパク質の使用。
- PCRチューブへのリポソームの添加。
- 混合液を氷上で10分間インキュベートする。
主な結果
- Msp1再構成のためのシンプルで効果的なプロトコルが確立されました。
- 定義されたシステムにより、構成成分のより高度な操作が可能になります。
- 抽出プロセスの理解が深まりました。
- 結果は、タンパク質の品質管理における効率の向上を示しています。
結論
- 本研究は、AAA-ATPaseを研究するための簡便な手法を提供します。
- 膜からのタンパク質抽出の理解に寄与します。
- このプロトコールは、タンパク質の品質管理に関するさらなる研究に応用可能です。
よくある質問
業界における重要性
本プロトコルは、ミトコンドリアのプロテオスタシスに関連する保存された品質管理経路である、AAA-ATPaseを介したタンパク質抽出のメカニズム的なリスク低減を可能にします。精製成分を用いた完全に定義された再構成系を提供することで、神経変性疾患や癌を含むミトコンドリア機能不全に関連する疾患のターゲットバリデーションおよびアッセイ開発を支援します。このアプローチは、基質認識と抽出効率に影響を与える変数を分離することで、初期創薬における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：誤局在化したテイルアンカータンパク質の除去におけるMsp1の役割の解析を可能にし、ミトコンドリアプロテオスタシス経路における機能的なターゲット検証を支援する。
- 運用上の価値：精製されたMsp1、TAタンパク質、およびリポソームを使用することで細胞内の複雑性を排除し、ATPase、基質、および脂質環境の精密な制御を可能にする。
- 予測的価値：Msp1による基質認識の構造・機能解析を促進し、タンパク質抽出活性の調節因子のリード化合物同定に寄与する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：Western blotを用いて、投入量に対する溶出液中の基質レベルを比較することで効率を測定する定量的な抽出アッセイを確立する。
- 運用的価値：標準化された条件を規定する：再構成のための10分間の氷上インキュベーション、BioBeadsを用いた16時間の回転混和、および30°Cでの30分間のATP駆動抽出に続くグルタチオン溶出。
- アッセイの準備状態：出力には抽出効率（通常、ポジティブコントロールで約10%、ネガティブコントロールで1～2%）が含まれ、再構成フォーマットでのヒット検出および用量反応スクリーニングを可能にする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな関連性：ミトコンドリアのプロテオスタシス機構を、Msp1の機能不全ががん、老化、および神経変性疾患に関与している疾患モデルへと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：脂質組成や基質の生物物理学的特性など、抽出に影響を与える変数を分離することで、ターゲットへのエンゲージメントを明確にし、前臨床ターゲットバリデーションにおける曖昧さを低減します。
- 連続性：最小限で制御可能な抽出モジュールを定義することにより、生化学的なターゲットバリデーションから、疾患に関連するシステムでの表現型スクリーニングへの移行をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は初期創薬のプロセスに組み込まれており、タンパク質抽出のメカニズム解析を通じたターゲットバリデーションを可能にします。これにより、スクリーニングカスケードに向けたアッセイ開発に情報を供し、ターゲットへの結合およびパスウェイ調節に基づいたgo/no-go判断を支援します。
- 発見生物学：脂質環境および基質特性がMsp1 ATPase活性および抽出効率にどのように影響するかという仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：定義されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いて、ATPase駆動型の抽出に対する化合物の影響を評価するための、再構成された定量的なプラットフォームを提供します。
- 分析：溶出液と入力分画のWestern blot比較による抽出効率という測定可能なリードアウトを生成し、条件間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：破壊されるとヒトの疾患に関連するとされる保存された品質管理経路をモデル化することで、前臨床的な関連性につなげます。
- エンタープライズ再利用：定義されたリポソーム再構成システムにより、AAA-ATPase、基質特異性、または抽出の脂質依存性調節を研究するさまざまなプロジェクトでの再利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値：簡略化された定義済みシステムを通じて、タンパク質抽出経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を高めます。
- 運用的価値：精製コンポーネントと段階的なプロトコル（再構成、BioBead処理、シャペロンによるプレクリーニング、ATP駆動型抽出、グルタチオン溶出）により、再現性と標準化を向上させます。
- 戦略的価値：細胞または表現型アッセイの前に、標的変調の可能性を早期に評価することで、Go/No-Go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：メカニズム的な要因と標的の扱いやすさを明確にすることで、ミトコンドリア品質管理における標的のリスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- タンパク質精製、リポソーム再構成、およびATPaseアッセイの設計に関する専門知識が必要です。
- ペレット化のための超遠心機またはPicoFuge、グルタチオン・スピンカラム、および温度制御ヒートブロックへのアクセスが必要です。
- 抽出効率の再現性を確保するためには、研究室間で脂質組成、タンパク質：リン脂質比、およびATP濃度の標準化が必要です。
- 他のTAタンパク質やAAA-ATPaseに適用する場合、再構成バッファー、インキュベーション時間、およびビーズを用いた脂質除去ステップの最適化が必要になることがあります。
- 実用上の制限として、ソースに記載されている通り、フロースルー信号の変動や、低存在量の基質に対するウェスタンブロットの感度への依存が挙げられます。
