Name: 腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ野生カエノラブディティス線虫の選択的洗浄法。腸内微生物叢を濃縮し、培養困難な細菌を同定する手法を確立。宿主と微生物の相互作用研究に応用可能です。

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クリスチャン・ブランドル博士と国立センター・ド・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック(CNRS)ヌーラゲ・フィールド・ステーションに感謝します。

1. NGMプレート上の野生の線虫のためのダウアー形成を誘導する
<ol><li>目的の栄養のない微生物を持つワームを得た後、食品源としてOP50-1大腸菌を用いた標準的なNGMプレート上の野生のカエノールハブディティス株を成長させます。線虫を20°Cでインキュベートする。 注: カエノハブディティス 線虫を成長させる標準的な温度は15〜25°Cの間ですが、目的の微生物の損失を防ぐために経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>すべてのOP50-1が消費され、大部分がダウアー段階に達するまで、4〜5日間20°Cで動物のプレートを飢えさせます。 注:ダウアーは、栄養不足のために発達し、保護キューティクルを持つ長命の幼虫です。</li>
</ol>2. 線虫を洗う
<ol><li>M9最小塩媒体(42m Na2HPO4、22 mM KH2PO4、8.6 mM NaCl、19 mM NH4Cl)の5 mLを6cmプレートに加えます。</li>
	<li>無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9とワームをピペットアップし、滅菌15 mL遠心分離管に移します。</li>
	<li>臨床遠心分離機を使用して、室温で30 sの1000 x g でチューブ内のワームを回転させます。</li>
	<li>滅菌15 mLピペットを使用して、M9上清をワームペレットの上に除去して捨てます。M9の約50 μLをワームの上に残して、チューブ下部の生きたワームを邪魔しないでください。</li>
	<li>トリトンX-100のM9+ 0.05%を同じ遠心管に10mL加え、チューブのキャップを十分に締めます。</li>
	<li>チューブを室温で20分間ヌテーターにインキュベートし、外部微生物を除去します。チューブをヌテレーターから取り出し、30sの場合は1000 x g でワームをスピンダウンします。</li>
	<li>滅菌ピペットを使用して、M9上清を除去し、ワームのペレットの上に捨てます。M9の約50 μLをワームの上に残して、チューブ下部の生きたワームを邪魔しないでください。</li>
	<li>手順 2.5 ~ 2.8 を 3 回繰り返します。</li>
</ol>3. 線虫の消毒
<ol><li>0.25%SDS(250 μLの10%SDS)、カルベニシリン50 μg/mLを加えて、M9バッファーの10 mLに抗生物質とSDS溶液を調製し、 25 μg/mL のカナマイシン、12.5 μg/mL のテトラサイクリン、ゲンタマイシン 100 μg/mL、ストレプトマイシン 50 μg/mL、クロラムフェニコール 37.5 μg/mL、セフォタキシム の表200 μg/mL(材料の表を参照)。</li>
	<li>抗生物質に線虫を含むチューブを、室温でヌテーター上のSDS溶液を一晩インキュベートします。 注:すべての非ダウアーワームと胚は死ぬでしょうが、ダウアーワームの多くは、この洗浄プロセスを生き残ります。</li>
</ol>4. 抗生物質とSDS溶液の除去
<ol><li>室温で1分間1000 x g でチューブ内のワームをスピンダウンします。滅菌ピペットを使用して、チューブの底部にあるワームを邪魔することなく、遠心管から上清を取り除きます。</li>
	<li>M9 + 0.05% トリトンX-100の10 mLを加え、チューブのキャップを適切に締めます。チューブを室温で20分間、ヌテーターにインキュベートします。</li>
	<li>チューブをヌテレーターから取り出し、1000 x g でワームを1分間回転させます。手順 4.2 ~ 4.3 を 3 回繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄の後、ワームペレットを溶液の100 μLの底部に邪魔されず、残りを捨てます。</li>
</ol>5. きれいな線虫株を伝播する
<ol><li>無菌ガラスピペットを使用して、OP50-1で播種した10cm NGMプレートの中央に上清とペレットの100 μLを移します。中央の液体を邪魔することなくプレートを乾燥させます。</li>
	<li>ダウアーが中央から這い出し、OP50-1芝生を通って5-10分間クロールできるようにします。</li>
	<li>慎重に1つのダウアーをピックアップし、6 cm NGMシードプレートにプレートします。合計で、少なくとも10ダウアーを選び、OP50-1(合計10プレート)で播種した個々の6cm NGMプレートにプレートを入れてください。</li>
	<li>ダウアーが成長し、次の世代(F1)が成人期に達するまで、20°Cでプレートを4〜5日間インキュベートします。OP50-1以外の微生物の増殖と見なされる、すべてのプレートの汚染を視覚的に確認します。</li>
	<li>各クリーンプレートについて、目的の表現型に応じて、ノルマルスキーまたは蛍光インザビダイラゼーション(FISH)12)などの蛍光顕微鏡を介して目的の微生物の伝播を確認します。</li>
</ol>6. 微生物の腸管解剖とPCR同定
<ol><li>動物を3〜4日間20°Cで成長させ、OP50-1細菌の量を減らすことができます。飢えたワームのプレートにM9培地5mLを加えます。</li>
	<li>無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9 + ワームをピペットアップし、滅菌15 mL遠心分離管に移します。</li>
	<li>臨床遠心分離機を使用して、室温で30 sの1000 x g でチューブ内のワームを回転させます。</li>
	<li>滅菌15 mLピペットを使用して、チューブの下部にある生きたワームを邪魔することなく遠心管から上清を取り除きます。</li>
	<li>M9 + 0.05% Triton X-100の10 mLを加え、外的な微生物を除去するために20分間、ヌテーターにチューブをインキュベートします。ワームを洗うために4回繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄後、滅菌ピペットチップを使用して、溶液の100 μLで底部のペレットを乱すことなく上清を取り除きます。</li>
	<li>無菌ピペットチップを使用して、M9とワームをシードなしのNGMプレートに移し、ワームが20分間這い回っている間にプレートを乾燥させ、キューティクルと腸からOP50-1を取り除くのに役立ちます。</li>
	<li>乾燥したプレートにM9の250 μLを加え、ガラスピペットを使用して、M9 + ワームを新しいシードなしNGMプレートに移します。繰り返しますが、そのプレートを乾燥させ、ワームが20分間這い回るようにします。</li>
	<li>プレートにM9の250 μLを加え、M9+ワームの100 μLをクリーンな時計ガラスに移します。</li>
	<li>2本の無菌26G注射針を使用して、片方の針でワームを押さえ、もう一方の針を使用して線虫を切断する。切断後、体から腸(粒状)と生殖腺(透明)が自然に身体から出てきます。</li>
	<li>一方の針で腸を押さえ、もう一方の針で切り取って、露出した腸の一部を切り取ります。 注:可能であれば、ノルマルスキー顕微鏡、FISH、または免疫ヒストケミストリー23を使用して、目的の微生物が常にエバート腸に存在することを確認してください。</li>
	<li>1回の解剖された腸を、10 μLの滅菌水を含む0.5 mL PCRチューブに移します。異なる動物からの腸を含む少なくとも5つのPCRチューブを合計する場合に繰り返します。</li>
	<li>PCRチューブを-80 °Cで最低5分間凍結します。PCR チューブを冷凍庫から取り出し、サンプルを解凍します。</li>
	<li>腸から細菌を分離するために数回上下に液体をピペット.</li>
	<li>微生物の疑いのあるタイプに応じて、細菌、酵母、またはマイクロスポリディアの小さなリボソームサブユニットのDNA配列に対して、ユニバーサルプライマーペアを使用してPCRを実施します。 注: 例えば、ユニバーサル細菌16Sプライマーを使用したサンプルプロトコルを 表1に示します。</li>
	<li>フィルターベースのDNA洗浄および濃縮キット( 材料表を参照)を使用して増幅を精製し、サンガーシーケンシングを実行します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

このプロトコルは、一連の洗浄手順を使用して、野生の単離されたカエノアハブディティス線虫からの微生物の単離および同定について説明する。多くの微生物は野生分離線虫に関連しており、そのうちのいくつかは、宿主微生物相互作用および先天性免疫における将来の研究に使用できるエキサイティングな型を有する。多くの化学的微生物叢および病原性細菌は、生体外細菌増殖のための標準的な技術を使用して野生のカエノールハブディティス線虫から単離されている25,26。しかし、すべての微生物をインビトロで培養できるわけではないので、野生の線虫で培養することが必要になります。一部の微生物は、微小胞子胞子のような耐性胞子期を有し、SDSの高濃度は、胞子の特異的な濃縮を可能にする、ほとんどの細菌および真菌を殺すために使用することができる。このプロトコルは、SDSおよび抗生物質治療に耐性のない、治療不能な腸内微生物を濃縮する方法を提示する。
ここで紹介する技術は、キューティクルの強化、咽頭ポンピングの抑制、頬栓27で口を覆うなどの生理学的変化により、ダウアー動物に見られる環境抵抗を利用しています。このプロトコルの重要なステップは、様々な抗生物質と0.25%SDSとの一晩のインキュベーションです。このステップは、内部微生物をそのままにしたまま、すべての外部微生物を殺すために使用されます。C.エレガンスダウアーは、30 min27で10%で高いSDS濃度を生き残るために実証されていますが、このプロトコルは、微生物を殺すだけでなく、抗生物質に細菌をさらに暴露するために中程度だが長時間のインキュベーションを使用しています。さらに、SDSの中程度の濃度は、C.熱帯から一晩1%SDSへの暴露がすべてのダウアー動物の死をもたらしたので、他のカエノアハブディティス種からのダウアーが生き残ることを確実にするのに役立ちます。すべてのダウアーが死んだ場合、SDSの濃度および/またはSDSへの暴露の長さを減らすべきである。逆に、F1生成プレートが洗浄後も目に見える汚染がある場合、SDS濃度とインキュベーション時間を増やすべきです。
もう一つの重要なステップは、洗浄後の単一のダウアー動物の分離である。このステップは、すべての動物がSDSと抗生物質治療の後にきれいではないとして重要です。したがって、動物はOP50-1で10cm NGMプレートの中央に配置され、放射状に外側に這うようにする。多くの場合、OP50-1を通る拡張クロールは、キューティクルに付着した潜在的な生き残った微生物を取り除くのに役立つように見えるので、より遠位の動物を選ぶのが最善です。しかし、これは、それが高頻度で集団に存在しない場合、関心のある微生物のために豊かにすることがより困難になるため、プロトコルの制限につながります。ここでは、接着性のアルファプロテオバクテリアが集団の90%~95%に存在していた。したがって、ほとんどのきれいなプレートは、マイクロバイオーム細菌を持っていました。しかし、対象となる微生物が集団においてはるかに低い頻度で存在する場合、さらに多くのF1 プレートをスクリーニングする必要がある場合がある。
このプロトコルは、野生の線虫に見られる関心のある任意の数の非カルト性微生物を分離するために使用される可能性が高い。しかし、微生物はダウアーキューティクルによって保護された組織にあり、ダウアー動物で生き残ることができ、宿主に観察可能な表現型を有する必要がある。したがって、この技術は、ここで説明するアルファプロテオバクテリア種以外の腸内腔内の他の微生物叢細菌を、付着しない細菌を含む濃縮するために使用することができる。また、このプロトコルは、線虫のオチェイウス・ティプラエ28に感染する脂性細胞内細菌、ボルデテラ・アトロピを濃縮するために使用された。濃縮後、B.アトロピはNGMプレート上にコロニーを形成することが判明し、より急速に成長する汚染物質が除去されると、目的の微生物が体外でカルト的であることが発見される可能性があることを示した。この技術は、細胞内細菌を豊かにするこの能力を考えると、オルセーウイルスを含むマイクロスプロイドおよびウイルスに対して働く可能性が高い。しかし、これらの微生物はダウアーへの出入りが可能でなければならない。
このプロトコルはバイオセーフティレベル1の実験室で行うことができるが、それ以上の微生物汚染を防ぐためには、滅菌技術を全体にわたって維持しなければならないことを覚えておくことが重要である。プロトコルは、抗生物質の種類/濃度、SDSの割合、および/またはナイスタチンなどの抗真菌剤の添加を含む研究者のニーズに応じて変更することができます。多くの場合、野生分離線虫に見られる汚染微生物の数は劇的に変化する可能性があります。ここでは、NGMプレート上の非OP50-1 大腸菌 増殖の見かけの損失を、きれいな線虫株の読み出しとして使用した。しかし、汚染微生物の非可分泌物集団が存在する可能性があるため、汚染の程度を見るためには16S rRNAアンプリコンシーケンシングなどのメタゲノミクス法を実施することが不可欠である。ワーム株が洗浄されると、それは凍結し、将来の研究のために離れて保存することができます。全体として、このプロトコルは、研究者が野生の線虫中の非耕作微生物を豊かにすることを可能にし、宿主の適性への影響を研究し、植民地化または感染のフェノタイプを特徴付け、遺伝的ツールを利用して宿主と微生物の相互作用の根底にあるメカニズムを理解することを可能にする。

遺伝モデル生物C.エレガンスは、宿主と微生物の相互作用を研究するための優れた生体内システムである1,2。彼らは他の動物と比較して比較的単純な生理学を持っていますが、細胞生物学の多くは哺乳類と根本的に似ていて、生物学的研究のための良いモデルとなっています1,3,4。さらに、それらは顕微鏡的で、維持しやすく、短い寿命を通して透明なままである。これらの特性は、宿主と微生物の相互作用を支配するメカニズムの迅速な研究を可能にし、遺伝的に柔軟な宿主の生体内感染および植民地化の視覚化5,6を可能にする。最後に、C.エレガンスは細菌、真菌、ウイルス感染に迅速に反応し、宿主微生物相互作用および腸内微生物叢7,8,9を研究するための優れたモデルとなる。
野生のC.エレガンスおよび他の線虫のサンプリングの増加は、自由に生きている線虫および自然な遺伝的変異の生態に関する研究を可能にした10,11。同時に、サンプリングは、C.elegans12,13,14,15と相互作用する天然の生物学的病原体および微生物の発見を増加させ、ウイルス、細菌、微小胞子胞子、oomycetes、または真菌との相互作用を研究する多くの宿主微生物モデルシステムの確立につながっている16,17,18,19,200 .典型的には、野生のC.エレガンスは、多くの場合、より温暖な気候で、腐敗した茎や果物に見られ、主に彼らは自己再生21です。これらのサンプルが実験室に持ち込まれると、野生の線虫がクローン集団に隔離され、関連する微生物叢の配列を運ぶ。カエノールハブディティス線虫に関心のある新しい微生物を発見すると、動物は、容易に視覚化された模倣機を使用して顕微鏡によって感染または植民地化のために直接スクリーニングされることが多い。例えば、ウイルス感染は腸構造の崩壊として視覚化され、微小胞体の段階は胞子またはメロンツ14,22として宿主細胞の内部で見ることができる。将来の調査のために目的の微生物が発見されたとき、それは孤立して研究できるように、野生の線虫に見られる他の汚染微生物から分離されなければならない。多くの場合、目的の微生物はインビトロで培養できないため、宿主線虫の微生物を濃縮することが不可欠です。
例えば、このプロトコルは、線虫の腸内腔内にコロニー形成する細菌を含む C.tropicalis の野生の単離物を記述し、腸上皮細胞に指向性で付着する。フェノタイプでは、細菌は腸管腔の内側に沿って垂直に成長し、毛のような外観を与え、ダウアーステージを含む動物のすべての段階で標準的なノルマルスキー顕微鏡で視覚化される。この野生の C.熱帯 株が成長した線虫増殖培地(NGM)プレートには、他の微生物との目に見える汚染が含まれていた。このプロトコルは、この未知の付着細菌を研究するためのプレート上の追加の汚染微生物の成長を減らすために開発されました。線虫は、内腔内の細菌を保護するためにダウアー段階に強制され、その後、一連の洗浄を使用して洗浄されました。その後、未知の細菌種を腸の解剖とシーケンシングのための16SリボソームDNAのPCR増幅によって同定した。
全体として、このプロトコルは、野生捕獲線虫に関連する関心のある微生物を潜在的に豊かにすることができる。その後、標的微生物を同定し、顕微鏡観察を通じて生体内感染またはコロニー形成フェノタイプを可視化し、宿主の適性または宿主と微生物の相互作用の他の側面に及ぼす影響を研究する。カエノハブディティス線虫と相互作用する新しい微生物種の単離と研究は、微生物の病原体およびマイクロバイオーム研究に関連する宿主と微生物相互作用の宿主免疫および新規パラダイムの遺伝的メカニズムを明らかにすることができる。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1356</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>BD プレシジョン グライド ニードル - 26 G</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td></td> 305115 <td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>セフォタキシム</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C7039-500mg</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>DNAクリーンおよびコンセントレーターキット</td><td>Zymo Research</td><td>11-303C</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaqポリメラーゼ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>EP0711</td><td></td></tr>ゲン<tr><td>タマイシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G1264-250mg</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>K1876-1G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A-661</td><td></td></tr>スト<tr><td>レプトマイシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T7660-5G</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>時計メガネVWR</td><td></td><td>470144-850</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

カエノハブディティス・エレガンス (C.エレガンス)は、特に腸の文脈において、宿主と微生物の相互作用とマイクロバイオームを研究するための優れたモデルであることが証明されています。最近、野生の カエノハブディティス 線虫の生態学的サンプリングは、細菌、ウイルス、真菌、および微小胞子症を含む関連する微生物の多様な配列を発見しました。これらの微生物の多くは、さらなる研究を保証する興味深い植民地化または感染性素型を有するが、それらはしばしば耕用できない。このプロトコルは、 C.エレガンス および関連線虫の所望の腸内微生物を濃縮し、キューティクルに付着する多くの汚染微生物の存在を減少させる方法を提示する。このプロトコルは、開発のダウアー段階に動物を強制し、外部汚染を除去するために一連の抗生物質と洗剤洗浄を使用することを含みます。ダウアー動物は過酷な環境条件から線虫を保護する生理学的変化を有するので、腸内微生物はこれらの条件から保護されます。しかし、豊かさが機能するためには、動物がダウアーに発展するときに関心のある微生物を維持する必要があります。動物がダウアーステージを離れると、彼らは個々のラインに一体伝播されます。F1 集団は、所望の微生物または感染のフェノタイプのために、そして目に見える汚染に対して選択される。これらの方法は、研究者が C.エレガンス および細胞内腸病原体の天然マイクロバイオームの一部を構成する腸内腔内の耕作不能微生物を豊かにすることを可能にする。これらの微生物は、コロニー形成または感染性素型および宿主の適合性に及ぼす影響について研究することができる。

野生のC.熱帯菌(JU1848)は、フランス領ギアナのヌーラーグの森で腐ったヤシの木の果実から分離されました(図1A)24。この株は、腸管腔を指向的にコロニー形成する薄い微生物を有することが判明した(図1B)。この微生物は、株JU1848との共培養を介してC.エレガン株N2に容易に移され、そこで同様に腸管腔を植民地化した。
複数世代にわたって大腸菌OP50-1を播種した標準的なNGMプレート上でのJU1848の伝播は、OP50-1芝生の内外の様々な暗い粘膜コロニーとして見られる目に見える汚染をもたらしました(図2A)。野生のJU1848のプレートは、動物をダウアーに押し込むために飢えさせ、説明したように清掃されました。清掃を生き延びた単一のダウアー動物をOP50-1で播種した個々の6cm NGMプレートにメッキし、20°Cで4日間増殖させた。 F1の立ち上がりの複数のプレートは、目に見える微生物汚染なしに観察された(図2B)。F1の子孫は、腸管腔内に付着細菌がまだ含まれていることが確認された(下記参照)。
清潔なJU1848動物は、プロトコルに記載されているように腸の破片を分離するために洗浄され、切断された(ステップ6.1-6.12)。解剖された腸の内腔に付着した細菌はノマルスキー顕微鏡を 介して 検証された(図3)。JU1848の内腔内の微生物は細菌であると疑われ、解剖された腸は、普遍的な細菌16Sプライマー、27F、および1492Rを使用したPCRのテンプレートとして使用されました。合計6個の個別の解剖された腸から、PCR産物をサンガー を介して 配列し、クリーンクロマトグラフは6つの配列がすべて同一であることを示した。これらの配列に基づいて、この細菌は、クラスΑプロテオバクテリアの新種として同定されたが、既知の順序または属(補足ファイル1)に分類することができなかった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig01.jpg"> 図1:野生のC.熱帯の内腔を植民地化した細菌を付着させる(A)フランス領ギアナのヌーラゲスの森の中の腐ったユーテルペspのフィールドサンプル画像(家族:アレカセア)ヤシの木の果実。(B)株JU1848のノマルスキー画像は、宿主腸の内腔(lu)にブラシ状の外観を形成する何千もの長くて薄い細菌で見られる(in)。腸をコーティングする細菌(ba)層は、括弧([)で示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig02.jpg"> 図2:汚染微生物の増殖は線虫除け洗浄後に失われる。 (A)野生株JU1848は 、大腸菌 OP50-1細菌を播種した標準的な6cm NGMプレート上で顕著な微生物増殖を伝播する。(B)洗浄後、1つのダウアーからのF1子孫のプレートは、20°Cで4日間のインキュベーションの後に目に見える微生物汚染を示 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig02large.jpg" target="_blank">さない。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62937/62937fig03.jpg"> 図3:菌を付着させるのは、解剖された腸管の内腔に見られる。 腸がこぼれ落ちるように首を切られたきれいなJU1848動物のノマルスキー像。コロニー形成細菌(ba)は、ブラケット([)で示され、線虫体(nb)の外側にある腸の一部(in)の内腔(lu)に見られます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/62937fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>濃度</td>
			<td>量</td>
		</tr>
<tr>
<td>27F プライマー (5'-アガグットガッグラムCMGGCTCAG-3')</td>
			<td>20mM</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1492R プライマー (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')</td>
			<td>20mM</td>
			<td>2.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>水の中で解剖された腸</td>
			<td>該当する</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x PCR バッファー</td>
			<td>10倍</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
			<td>10mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>タク・ポリメラーゼ</td>
			<td>5 U/μL</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>該当する</td>
			<td>35.5 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:普遍的な細菌プライマーおよび解剖された腸を用いたサンプルPCRプロトコル。
補助ファイル1: 6つの解剖されたJU1848腸のPCRから派生した細菌16S rDNA配列の筋アライメント。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62937/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank"></a>

野生 のカエノルハブディティス 線虫は、多くの場合、腸内腔または腸に感染する多くの微生物に関連付けられている。このプロトコルは、ダウアーキューティクルの抵抗性を利用して、腸を植民地化する非カルト性微生物を豊かにする方法を詳述する。

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

この方法は、野生のカエノハブディティス線虫に見られる新しい目的の微生物の濃縮および同定を容易にするために開発され、宿主微生物相互作用に関するさらなる調査を可能にした。この技術の主な利点は、研究者が野生の線虫の腸内で直接非化学的病原体および微生物叢細菌のために濃縮することを可能にすることです。まず、目的の培養不可能な微生物を有する線虫の野生のカエノールハブディティス株を得て、食品源としてOP51大腸菌を含む標準的な線虫増殖培地またはNGMプレート上でワームを成長させることから始めます。すべてのOP51エシェリヒア大腸菌が消費され、ワームの大半がダウアー段階に達するまで、20°Cで4〜5日間線虫をインキュベートします。ダウアーの段階で線虫を洗うために、飢えたワームの6センチメートルのプレートにM9最小限の塩媒体の5ミリリットルを追加し、無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9培地とワームをピペットアップし、無菌15ミリリットル遠心管に移します。室温で30秒間Gの1,000倍のワームをスピンダウンし、約50マイクロリットルのM9をワームの上に残すことによって、生きたワームを邪魔することなく、無菌15ミリリットルピペットを使用してワームペレットの上のM9上のM9上清を取り除いて捨てます。同じ遠心管に、トリトンX-100の0.05%を含むM9培地の10ミリリットルを加え、チューブを室温でヌテーターに置く前に十分に締め付け、外部微生物を取り除きます。ヌテアに20分間インキュベーションした後、室温で30秒間Gの1,000倍のワームをスピンダウンし、実証したようにM9上清を取り除いて捨て、トリトンX-100の0.05%を含むM9培地で洗浄手順を3回繰り返します。次に、作りたての抗生物質とSDS溶液を添加して、ネマトードを含むチューブを室温でヌテーター上で一晩インキュベートします。抗生物質による治療の後、室温で1分間Gの1,000倍のチューブ内のワームを回転させます。上清を取り除いてから、0.05%トリトンX-100を含むM9を10ミリリットル加え、キャップを十分に締めてヌケーター上のチューブを室温で20分間インキュベートします。完了したら、1,000回Gでワームを1分間回転させ、この手順を3回繰り返します。0.05%トリトンX-100を含むM9で4回目の洗浄後、ワームペレットを溶液の100マイクロリットルで乱さず、残りを捨てます。OP51大腸菌を播種した10センチメートルNGMプレートの中央に上清とペレットの100マイクロリットルを移す。ダウアーが中央から5〜10分間OP51芝生を通って這い出している間、プレートを邪魔されずに乾燥させます。慎重に1つのダウアーをピックアップし、OP51で播種6センチメートルNGMプレートにそれをプレート。同様に、OP51で播種された個々の6センチメートルNGMプレートに少なくとも10ダウアーをプレートします。ダウアーが成長し、次の世代F1が成人期に達するまで、プレートを摂氏20度で4〜5日間インキュベートし、すべてのプレートの汚染を視覚的にチェックします。各クリーンプレートについて、目的の表現型に応じてノマルスキーまたは蛍光顕微鏡を介して目的の微生物の伝播を確認します。ワームを飢えさせ、OP51菌の数を減らすために、線虫を摂氏20度で3〜4日間インキュベートする。最近飢えたワームのプレートにM9培地の5ミリリットルを加え、M9培地とワームを無菌の15ミリメートル遠心管に移し、室温で30秒間Gの1,000倍にスピンダウンします。ヌテタで0.05%トリトンX-100を含むM9の10ミリリットルでワームを5回洗浄する前に上清を20分間取り除きます。最後の洗浄後、溶液の100マイクロリットルのペレットを乱さずに上清を取り除き、M9とワームをシードなし6センチメートルNGMプレートに移します。虫が20分間這い回っている間にプレートを乾燥させ、キューティクルと腸からOP51を取り除くのに役立ちます。プレートが乾燥したら、M9の250マイクロリットルを追加し、新しい播種されていない6センチメートルNGMプレートにワームを移して、プレートが乾燥している間にワームがクロールできるように手順を繰り返します。20分後、M9の250マイクロリットルをプレートに加え、ワームと一緒にM9の100マイクロリットルをきれいな時計ガラスに移し、別の26ゲージシリンジ針でワームを押さえながら、26ゲージの注射針を使用して線虫を切断します。一度切断されると、腸、粒状の塊、透明な生殖腺は、自然に線虫体から回避し、その後、露出した腸の一部を遮断し、滅菌水の10マイクロリットルを含む0.5ミリリットルのPCRチューブに単一の解剖された腸を移管する。PCRチューブ内の少なくとも5つの異なる動物から腸を収集する手順を繰り返します。PCRチューブをマイナス80°Cで最低5分間凍結します。PCRを続行し、識別のためのシーケンシングを進める前に、腸のサンプルを解凍します。野生のカエノルハブディティス熱帯菌株JU1848は、指向性の方法で腸の内腔を植民地化する薄い微生物を有することが判明した。野生株JU1848は、エシェリヒア・コリOP51細菌を播種した標準的な6センチのNGMプレートで顕著な微生物増殖を伝播した。洗浄後、単一のダウアーからのF1子孫のプレートは、4日間のインキュベーションの後に目に見える微生物汚染を示さなかった。首を切られたJU1848動物のノマルスキ像では、コロニー形成細菌は線虫体の外にある腸の内腔に見えた。カエノーハブディティス種によっては、ダウアーの死を防ぐためにSDS濃度が低い必要がある。きれいな線虫株を伝播するには、クロールが生き残った汚染物質を取り除くのに役立つため、中心から最も遠く這い上がったダウアーを選びます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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