Name: ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学ぶ DUCT法による3D肝臓血管・胆管系の可視化と定量化。マイクロCTを用いた二重樹脂鋳造技術で、抗体や蛍光イメージングに依存しない肝疾患と再生の構造解析を実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

カリ・ユペールとステイシー・ユペールの専門知識と胆管の缶取とその実験室でのホスピタリティに関する支援に感謝します。また、ナジャ・シュルツとシャーロット・L・マットソンが共通の胆管缶取を手伝ってくれたことに感謝します。
私たちは、彼らのサポートのために次の付与機関に感謝します:
ERAラボでの作業:カロリンスカ研究所(2-560/2015-280)、ストックホルム・レンス・ランドスティング(CIMED(2-538/2014-29))、ラグナー・セーダー ベルクス・スティフテルス(スウェーデン財団の開始助成金)、欧州肝臓研究協会(ダニエル・アラジール賞)、スウェーデン心臓肺財団(20170723)、ベテンスカプスローデ(2019-01350)。
JKラボでの作業: MEYS CR(LM2018110)がサポートするチェコナノラボの研究インフラを認めています。J.K.は、助成金FSI-S-20-6353のサポートのおかげです。

<ol><li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li>
<li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li>
<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver%3A+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
<li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li>
<li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+%28Rumi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272(2012).</li>
<li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li>
<li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+liver%3A+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li>
</ol>

ERAラボの別のプロジェクトは、ModeRNAによって資金提供されています。ModeRNAは、ここで説明するプロジェクト/プロトコルに何の役割も持っていませんでした。

いくつかの重要なステップは、サンプル調製からCTデバイスのパラメータまで、ダクトの成功を決定します。最良の結果を得るためには、コントラストがよく、十分に注入され、バブルフリーの樹脂を使用して、3Dデータ、画像、およびムービーを取得するために、自動しきい値による簡単なデジタル処理を可能にする必要があります。トレーニングとこのプロトコルに従うと、注射の90%が成功し、再現可能なデータになります。2つの注入システム間の最もよい対比を達成するために、新鮮な黄色の樹脂を使用することが重要です。黄色の樹脂は非常に強い放射性pacityを有し、青色樹脂は検出不能な放射性pa00を有する。トップの結果は、新しい黄色の樹脂ボトルを開けた後、最初の3ヶ月以内に達成されます。時間が経つと樹脂が沈殿し、長期保存(>6ヶ月)後、黄色と緑色の樹脂はCTスキャンで区別できなくなります。コントラストの悪い画像には、2 つのシステムの広範で時間のかかる手動トレースとセグメンテーションが必要です。次に、よく伸ばされたチューブは、成人マウスの共通胆管および出生後マウスの共通胆管および門脈に適合するために不可欠である。注入のエントリ ポイントは注意して作成する必要があります。共通の胆管が横切って切り開かれる場合、周囲の組織から剥離する可能性が高く、チューブの正常な侵入を防ぎます。このステップは、共通の胆管が引き込まれ、周囲の組織から切り離された場合に「カール」する出生後マウスにとって特に繊細であり、チューブの挿入は非常に困難です。一般的な胆管の入り口および注入は、いくつかの練習を必要とするかもしれません.樹脂とのチューブを準備しながら、注入全体, 気泡は、CT画像に負のスペースを作成し、時間のかかる手動補正を必要とするので、バブルの形成を避けます.これは樹脂の広がりを容易にするので、注入手順中と後に濡れた綿棒で表面を転がすことによって肝臓を穏やかにマッサージすることが重要です。注入とチューブの除去が完了した後、シルクの縫合結糸は迅速かつ慎重に締め付ける必要がありますので、樹脂は完全に重合する前に肝臓から流れ出ません。マイクロCTイメージングを成功させるには、サンプルをアガロースで適切に固定し、CTデータ内の動きアーティファクトを排除するために熱的に適合させる必要があります。取得設定も重要な重要なのです, 微細な構造を解決するために適切な空間解像度に到達するために最適化する必要があります.
注射手順の技術的な変更は、若いマウスでの注入を達成するために行うことができます.現在、若いマウス肝臓の樹脂鋳造は、十分に薄いチューブの入手可能性によって制限されており、PE10は市販のチューブの中で最も小さいものである。谷水らは、ガラス毛細血管11を用いて胚性17日目(E17)共通胆管にカーボンインクを注入することに成功した。したがって、ガラスキャピラリーを介して樹脂を送達できるかどうかの将来のテストは興味深いでしょう。さらに、管管は肺9の気道や肺動脈血管系などの他の管状システムを注入するように適応した。二重樹脂注入はまた、他の市販の樹脂と一緒に使用するように変更することができ、またはこのプロトコルは、カーボンインクを注入するために使用することができます。
ダクトパイプラインの主な制限要因の1つは、樹脂粘度です。ダクトは直径5μm以上の管状構造の樹脂鋳造にのみ使用できます。このデータセットでは、樹脂は5μm9の最小径のチューブを貫通することができました。このサイズ制限は、細かい管と小さな毛細血管の分析を妨げる。さらに小口径の容器にダクトパイプラインを進めるために、他の市販の樹脂をテストする必要があります、または新しい低粘度の放射不透明剤の開発は、ルーメンの浸透を改善することができます。
ハンケオバら9では、ダクトは他の2つの一般的に使用される技術、二重炭素インク注射、続いて組織クリアリングおよび標準的な写真撮影、およびα平滑筋細胞アクチンと胆管を有する血管をサイトケラチン7で染色したiDISCO+と比較し、続いて3D imaging9を行った。ダクトは、二重分析(高い肝臓自家蛍光のためにiDISCO+にとって困難であった)、3Dイメージング、および定量化(カーボンインク注入では不可能)、および内腔化(ダクトは内部ルーメンアーキテクチャとシステム灌流のデータを提供する)の点で他の2つの方法を上回った。前述のように、ダクトの主な制限は、注入および分析できる最小ルーメンサイズ(5μm限界)であり、カーボンインクインジェクションとiDISCO+の両方が優れたパフォーマンスを発揮したパラメータである。ダクトは、各注入システムの分析を個別に可能にし、また2つのシステム間の建築関係を研究するために二重3D調査を容易にするので、単一システム樹脂鋳造3,5,6よりも優れています。
ダクトは、3Dで任意の2つの管状ネットワークを研究するために適用することができます。原理の証明として、ダクトは、肝臓胆道および門脈系および肺動脈脈管および肺の気道を可視化するために使用された。肝内胆管は、門脈静脈に隣接して発達し、ポータル静脈は胆道樹12の成長および分化を調節する構造テンプレートおよびシグナリングセンターを提供する。ハンケオバら9章では、ダクトは、ヒト小児疾患アラジール症候群のマウスモデルで胆道再生を検討した。ダクトは、胆道系が野生型のようなボリューム9を達成するために使用した以前に報告されていない建築メカニズムを明らかにした。アラギル症候群マウスは、2つの異なる戦略を利用した:(1)肝臓のヒラルおよび中央領域において、胆道系は分岐を増加させ、(2)肝臓周辺では、デノボ生成胆管は非常に激しい。これらの2つの要因は、異常なアーキテクチャにもかかわらず、ほぼ正常な胆道系体積をもたらす組み合わせ。さらに、ダクトは、2つの門脈間の接続橋を形成する門脈分岐および胆管とは無関係に発生した異常な胆管分岐を検出した9。これらの表現型は、単一の樹脂鋳造では検出不可能であり、2D組織学的セクションでは胆管増殖と誤解される可能性があります。したがって、ダクトは、質的で詳細な定量分析の可能性を持つ全器官またはローブレベルでの2つの管状ネットワークの3Dアーキテクチャを記述するデータを提供する。ダクトは、異なる動物モデルにおける出生後肝発達および肝臓再生分析の新しい基準となり得る。

オルガン樹脂鋳造は17世紀 にさかのぼる技術です。現代の樹脂鋳造の最初の例の1つは、解剖からヒト肝臓で行われた。肝内胆管はゼラチンと混合した造影剤で満たされ、続いてX線CTスキャン2による画像化を行った。ダクト技術の目的は、3Dで2つの管状樹脂鋳造ネットワークを3Dで視覚化、デジタル化、解析することです。
ダクトは、単一システムの肝樹脂鋳造3、4、5、6、7、8 の広範な既存の知識に基づいており、2つのシステムの同時3D視覚化と分析に拡張します。ダクトは、異なるコントラストの2つの放射不透明樹脂を混合し、これらの樹脂を2つの異なるネットワーク、特に共通の胆管およびポータル静脈に注入することによって、二重樹脂鋳造に単一樹脂鋳造を進んだ。ダクトは、出生後15日目(P15)の早い時期に再現可能な結果を有する若い出生後マウスに適用することができる。顕微鏡ベースのイメージング技術と比較して、主な利点は、ダクトが高速で、抗体を含まない、および肝臓組織の自己蛍光がイメージングを妨げないです。また、ダクトは、内腔化状態、内径、ネットワーク接続性、および灌流を記述する定量的データを提供する。管腔形成細胞の存在と、その事実上の形態形成の存在をチューブに区別することは、管内細胞が存在するが、アラジル症候群10の場合と同様に、チューブを形成しない器官を分析するために不可欠である。ダクトの主な欠点は、粘性があり、小口径(<5 μm)のチューブに入らない樹脂の限られた浸透です。ダクトは、動脈および静脈循環系、気道、肝外胆管、またはリンパ管などの注入入り口点を決定した後、任意の管状構造に適用することができる。したがって、肺や膵臓などの他の組織の全臓器アーキテクチャ分析を容易にする可能性があります。
MicroCTセグメント化された画像は、ImageJなどの市販のイメージングソフトウェアまたはカスタム書き込みパイプライン(MATLABなど)を使用して処理できます。樹脂注入された肝臓は、体積、長さ、分岐、単一システムのトート、2つのシステム間の距離、または分岐点依存(システム1がシステム2分岐に近接して分岐する)などの2つのシステム間の相互作用について、ネットワーク拡張および接続性または定量的に定性的に分析することができる。樹脂注入、マイクロCTスキャン、CTデータセグメンテーションを含むダクトパイプラインは、2つの管状システムの建築メカニズムの詳細な定量分析と組み合わせることで、動物モデルにおける肝臓全体分析の標準を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL SafeSeal マイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>23 G バタフライ針 チューブ付き</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>367283</td><td></td></tr><tr><td>23 G 針</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>305892</td><td></td></tr><tr><td>30 G 針</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>トップバイオ</td><td>P045</td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>108006 安息香酸ベンジル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL チューブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430829-500EA</td><td>ポリプロピレン</td></tr><tr><td>綿棒</td><td>Medicarier</td><td>60406</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカカメラ AG</td><td></td><td>ライカ M60</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>VWR</td><td>83801.41</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン チューブ 15 mL</td><td>Verkon</td><td>331.850.084.006</td><td></td></tr><tr><td>鉗子湾曲</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11051-10</td><td>ファイン グレーフ 10 cm 湾曲</td></tr><tr><td>鉗子 ストレート</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11050-10</td><td>ファイン グレーフ 10 cm ストレート</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td><td>Waygate Technologoies</td><td></td><td>マイクロコンピュータ断層撮影スキャナー</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td>B01AB01</td><td>5000 IE/mL</td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11413413</td><td></td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-122</td><td>合成樹脂 黄色</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-120</td><td>合成樹脂 青色</td></tr><tr><td>MICROFIL</td><td>Flowtech</td><td>MV-希釈剤</td><td>透明樹脂希釈剤</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Verkon</td><td>130.690.424.503</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>AgnThos</td><td>010.6131.M20</td><td></td></tr><tr><td>フェニックスdatos|x 2.0 software</td><td>Baker Hughes</td><td></td><td>CT data reconstruction software</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture</td><td>AgnThos</td><td>14757</td><td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td></tr><tr><td>Skin scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Iris straight tip 9 cm</td></tr><tr><td>Spring scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td></tr><tr><td>シリンジ 1 mL ルアー</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>チューブ PE10</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>チューブ PE50</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>VG Studio MAX 3.3 ソフトウェア</td><td>ボリュームグラフィックスGmbH</td><td></td><td>CT データ処理および分析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ダクト:3d肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

肝臓はヒトおよびマウスで最大の内臓であり、高い自己蛍光は全器官レベルでの器官の3次元(3D)アーキテクチャを評価するための重要な課題を提示する。肝臓アーキテクチャは、血管や胆道樹を含む樹脂で満たすことができる複数の分岐性内腔化構造によって特徴付けられており、それ以外の場合は肝細胞が豊富なパレンチマに高度にステレオタイプ化されたパターンを確立します。このプロトコルは、マイクロコンピュータ断層撮影、または「ダクト」を二重樹脂鋳造を行うためのパイプラインを記述する。ダクトは、2つの異なるラジ不透明な合成樹脂を持つ門脈と共通の胆管を注入し、続いて組織固定を伴う。1つのローブ、または肝臓全体を光学的なクリア剤でクリアすることにより品質管理は、適宜注入されたサンプルの事前スクリーニングを可能にする。ダクトパイプラインの第2部では、ローブまたは肝臓全体をマイクロコンピュータ断層撮影(microCT)スキャン、(半)自動セグメンテーション、およびポータル静脈および胆道ネットワークの3Dレンダリングに使用できます。MicroCT は、2 つの樹脂の 3D 座標データを得て、2 つのシステムの定性分析と、それらの空間的関係の定量的分析を可能にします。ダクトは、出生後および成人マウス肝臓に適用することができ、さらに他の管状ネットワーク、例えば、肺の血管ネットワークおよび気道に拡張することができる。

何をすべきか 正常な二重樹脂注入は、両方の肝胆管と門脈脈管が十分に充填されている場合に達成されます。品質管理ステップとして、1つのローブ(例えば、左横葉)をクリアすると、注入に成功し、続いて目的のローブのイメージングが可能になります。光学的にクリアされたローブはmicroCTを使用して後でスキャンすることができます。したがって、肝臓全体を光学的にクリアすることが可能です。よく注入されたマウス肝臓では、肝臓周辺と樹脂が側枝に見えるまで、門脈血管系を樹脂で満たすべきであり(図4)、このアーキテクチャはマイクロCTスキャンおよびセグメント化されたデータで忠実に再現される。さらに、よく注入された肝内胆管は、周辺にほぼ及ぶ主要な門脈枝の隣に見えるようにする必要があり、樹脂は主要な側枝に見える必要があります。制御ローブが品質管理ステップを通過した場合、対象となるローブ(光学的にクリアされたものを含む)はmicroCTでスキャンすることができます。P15マウス(図4A、B)および成人マウス(図4C,D)について、よく注入された肝臓からのセグメント化されたデータの結果が示されている。
やらないこと インタクト肝臓組織は、注射を成功させるための前提条件です。誤って肝臓組織をニックしないように腹腔と横隔膜を切断するときに余分な注意を払ってください。この処置の間に肝臓に物理的な損傷がある場合、樹脂は、ポータル静脈注射中に漏れ出す可能性が非常に高い(図5A)。肝臓が物理的に損傷を受けている場合、血管系の良好な注射を達成することはできません。
一般的な間違いの1つは、視覚化や分析のための課題につながる可能性のある樹脂で肝臓を不足しています。システム不足の原因の1つは、注射が完了する前に針やチューブの先端で樹脂が早期に硬化することである(図5B、青い矢印、ブラケットは大きな泡を示す)。1つの動物に1つの注入セットを使用し、硬化剤を樹脂に添加した後に速く働くことをお勧めします。注入中に樹脂が硬化した場合(これは半分充填されたシステムで観察され、ここでは半分充填されたポータル静脈血管構造で例示される)チューブを取り除き、チューブの先端を切断し(常に斜めに斜めにして斜めの先端を作成する)、プランジャーを押します。樹脂が再び滴下し始めた場合は、慎重にチューブを挿入し直し、縫合糸で固定します。樹脂が針に固まった場合は、チューブを完全に交換し、樹脂(気泡を避ける)で満たし、チューブを慎重に再挿入し、縫合糸で固定します。組織がより脆弱であるため、特に若い出生後マウス<p30 class="xfig">図5C、青い矢印は末端枝に見える血液を示す)。これは、血管の先端が樹脂の代わりに血液で満たされたときに観察することができる。これを避けるために、注射前に門脈(肝臓外)に血液が含まれていないことを確認してください。肝臓の不充満の第3の原因は、チューブが肝臓に深く挿入されすぎて、葉の1つに向かって枝に入る場合である。これを防ぐために、肝臓への入り口から最低0.5cmでチューブを挿入します。</p30>
逆に、一方または両方のシステムが樹脂で過剰充填される(図5D)。注射を通して肝臓を視覚的に監視する必要があります。.樹脂を使用した胆道系の鋳造は、樹脂充填ダクトが肝臓表面にかすかに見えるだけなので、ポータルの静脈の樹脂鋳造よりも難しく、システムがほぼ満杯になり、いつ停止するのかどうかを評価することは困難です。小さな黄色の樹脂の点が肝臓表面に現れると(図2Ci、青い矢印)、これは胆道系が完全に充填され、樹脂がダクトから漏れ始めていることを示す。マイナー樹脂漏れは、microCTデータセグメンテーション中に手動で修正することができます(図5D、右パネル)。
射出圧力が高すぎると、血管やダクトが破裂し(図5E)、不可逆的に損傷を与える容器またはダクトアーキテクチャが発生する可能性があります。肝臓はマイクロCTスキャンや分析には適していません.樹脂の過剰充填を避けるには、各マウスモデルでの射出に使用される適切な容積と圧力を最適化します。有毒な食事、遺伝子組み換え、または胆道系や静脈系に影響を与える肝臓損傷、または肝臓の硬直に挑戦されたマウスを扱う場合、注入圧力および量は体積として調整する必要があり、圧力は野生型マウスと異なる場合があります。このプロトコルは、2つのシステムの手動注入を記述しますが、注入圧力を標準化するためにポンプに注射器を接続することが可能です。気泡は、管状ネットワークのまばらな充填につながるもう一つの非常に一般的な注入アーティファクトです(図5F-H、青い矢印)。気泡の形成を避けるために、注射器とチューブに気泡が含まれていないこと、樹脂で完全に充填されていること、そして注入前に樹脂がチューブの先端から滴り落ちることを確認してください。microCTデータ上でマイナスの領域として表示される小さな気泡は、処理後のステップで手動で修正できますが、これは面倒です。
新鮮なのは最高です 新鮮な黄色の樹脂を使用することは重要な要因であり、2つの樹脂のコントラストとmicroCTデータセグメンテーションに大きな影響を与えます。開けたばかりの樹脂を使用する場合(図6A)黄色の樹脂注入胆管(明るい白色)と緑色の樹脂注入門脈(明るい灰色)との対比が明確に異なる。新鮮な樹脂を注入した肝臓は、自動化されたグローバル閾値を使用して簡単に処理されます。長期保存すると樹脂が沈殿し、コントラストが薄くなります。3ヶ月の貯蔵後、コントラストは、まだ胆道(図6B)とポータル静脈を区別するのに十分であり得るが、沈殿は、充填された門脈(図6B、青い矢印の向き)で不均一な不透明度として見える2つの樹脂の混合に影響を与える。異種のコントラストは、自動しきい値に悪影響を及ぼし、手動による修正が必要となり、処理時間が長くなります。樹脂が6ヶ月以上古い場合、コントラストだけでは、黄色注入された胆管と緑注入された門脈を区別できない点まで劣化している(図6C)。この場合、胆管と門脈は、直径とヒラ領域内の位置に基づいて手動でセグメント化され、マイクロCTデータ全体にわたって手動で従う必要があります。この手順は非常に時間がかかり、最善の回避です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> 図1:樹脂鋳造用の射出セット (A)注射セット#1は、30Gの針とPE10の長さから30cmのチューブを含む。射出セット#2は、長さ約30cmの23G針とPE50チューブで構成されています。(B) チューブの先端を伸ばして斜め切り、斜めの先端を作成します。AとBの定規はセンチメートル定規で、大きな増分は1cm、中間増分は5mm、マイナーインクリメントは1mmです <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> 図2:二重樹脂鋳造フローチャート (A)マウス静脈循環循環系と心臓を示す図表は、灌流前に切り取るべき右心房と、循環系から血液を洗い流すために針を挿入する必要がある左心室を示す。下の大静脈は、血管圧を緩和するために腎臓の下で切断されるべきである。(B) 胆管樹脂注入フローチャート。(i) IVC を切断する場所を示す (A) のズーム画像。(ii) 肝臓ヒラル領域からオディの括約筋(黒矢印)までの共通胆管(黄色の点線)を、クリアされた共通胆管の下に縫合糸を有する画像。(iii) 共通の胆管のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した位置。(iv)黄色の点線と黒い矢印はオディの括約筋にラベルを付け、切開の斜めの角度と斜めの角度切開後の開口部がどのように現れるかを示す。(v) 挿入時にPE10チューブベベル開口部(上向き)の向きを示す回路図。(vi) 黄色樹脂の注射の外観;樹脂は、ゆるやかに結ばれた結び目を簡単に渡す必要があります。IVC、下の大静脈。CBD、一般的な胆管。(C) ポータル静脈樹脂注入フローチャート。(i) 緑色の点線は、ハイラー領域からのポータル静脈を示します。青い矢印は、過剰充填された胆道システムにラベルを付けます。(ii)ポータル静脈のまわりの緩いオーバーハンド結び目のための適した場所。(iii) 挿入時にベベル開口部(上方)を示す回路図。(iv) 緑色樹脂と黄色樹脂の注射時の肝臓の外観;肝臓周辺の樹脂で満たされた血管に注意してください。PV、ポータル静脈。 図2a は Biorender.com で作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> 図3:ボリュームグラフィックスソフトウェアでのマイクロCTデータ処理. (A)表面決定、(i)過大評価された等価値(現在の選択のプレビューは黄色で示されている)、(ii)過小評価された等値、(iii)ポータル静脈および胆管の適切な表面決定のための等値の最適選択。(B)表面決定によって作成された対象領域(ROI)を分割し、(i)ダイアログウィンドウに1つのセグメント(最大のセグメント)のみが残るほどの高さの値を設定し、(ii)黄色のフレームでは小さい(除外された)粒子が示される。(C)データの表面スムージング、(i)平滑化機能が左側のパネル上にあり、(ii)平滑化強度を1(最大2)に設定し、新しい平滑化ROI、(iii)平滑化データを作成する。(D)個々の管状システムの分離、(i)表面決定関数で、バイリアリー系のみが選択に含まれるように等値を設定し(現在の選択のプレビューは黄色で示されている)、(ii)両方のシステムのROIと両方のシステムのROIを両システムのROIと両システムのROIから減算胆道系ROIにマークし、 (iii)灰色で示される門脈、胆道系は緑色で示される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> 図4:よく注入された胆管(BD)およびポータル静脈(PV)システム.(A)2つの系に2つの樹脂を注入した15日目(P15)の肝臓の右内側葉(RML)を光学的にクリアした。スケールバー 1 mm. (B) (A) に示す P15 RML の 3D レンダリング(A)は、緑の白と胆道系のポータル静脈血管構造を描いた。スケールバー1mm(C)2つのシステムに2つの樹脂を注入した成体肝臓のRMLを光学的にクリアした。(C)に示す大人のRMLのスケールバー1 mm(D)3Dレンダリングは、緑の白と胆道系のポータル静脈構造を描いた。H = ハイラー、P = 周辺。スケールバー1mmパネルA、B、Dは、ハンケオバら9の許可を得て適合している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> 図5:二重樹脂の肝臓注射の一般的な課題である (A)画像は、腹腔の最初の開口部の間に誤ってニックされた肝臓を示しており、樹脂が切り傷(青い矢印頭)を通して漏れている。(B)樹脂硬化によるポータル静脈システムの注入が不十分。青い矢印は空の端子の枝にラベルを付け、赤い括弧は大きな泡をラベル付けします。スケールバー 1 mm. (C) 心筋灌流が悪いため、ポータル静脈システムが不十分に注入されました。青い矢頭は、末端の枝に見える血液をラベルします。スケールバー 1 mm(D) 樹脂の分離されたボールによって明らかに過剰充填胆道システム。左側のパネルには光学的にクリアされた肝臓が表示され、右側のパネルには 3D microCT レンダリング イメージが表示されます。青い点線の輪郭は、拡大領域を表しています。黒い矢印は、マイクロCTスキャン後の光学クリアリング中に損傷を受けた肝臓の一部にラベルを付けます。スケールバー 1 mm(E) 樹脂注入時の高圧は、青い矢印でマークされたポータル静脈の破裂を引き起こす可能性があります (このパネルの動物は、Jag1H268Q変異を運びます).スケールバー 1 mm. (F) ポータル静脈注入中に樹脂内の泡 (青矢印) および (G) 胆道系注入 (青矢印) ( H) 気泡のマイクロCT スキャン (青い矢印ヘッド) 、不十分に充填された端子枝 (赤いブラケット) および樹脂漏れ (黄色の矢印ヘッド) この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> 図6:差動樹脂コントラスト(A)開きたばかりの黄色い樹脂は、樹脂注入されたポータル静脈(灰色)と胆管(白)を区別するのに十分なコントラストを生成する。(B)黄色の樹脂の3ヶ月間の貯蔵は、不均一な不透明性をもたらす樹脂の沈殿をもたらす(灰色白い門脈、青い矢印)。(C) 黄色樹脂の長期保存(&gt;6ヶ月)は、門脈(灰色)と胆管(灰色)の間のコントラストを減少させる。スケールバー100 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

二重樹脂鋳造マイクロコンピュータ断層撮影(ダクト)は、2つの管状システムの視覚化、デジタル化、セグメンテーションを同時に可能にし、臓器アーキテクチャの3D解析を容易にします。ダクトは、2つの放射不透明樹脂の 元生体 注入とそれに続くマイクロコンピュータ断層撮影スキャンと断層撮影データのセグメンテーションを組み合わせたものです。

ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

この方法により、3Dでの肝臓血管・胆道システムのアーキテクチャを解析、可視化、定量化することができます。肝臓病と再生の空間的側面をよりよく理解できるようになりました。この技術の主な利点は、抗体または蛍光イメージングの存在に依存しないことです。また、どのネットワークが適切にルーメン化されているかを直接視覚化することもできます。この方法は管状システムの分析に適しており、血管、胆管、気道の研究は理想的な領域です。胆管を用い、胆道再生に関する構造変化を理解しました。マウスの胆道系に樹脂を注入する前に、腸と膵臓をマウスの左側に移動し、PBSで濡れた綿棒を使用して共通の胆管および門脈を露出させる。次に、下の大静脈に小さな横切開を行います。肝臓の腹側を心臓に向かって反転させ、内臓表面とヒラル領域を露出させ、膵臓を横切ってヒラル領域から、オディの括約筋で腸内に流れる共通の胆管を見つける。ストレート鉗子を使用して、共通の胆管から約5ミリメートルの周囲の組織領域をクリアします。次に、シルクの縫合糸を共通の胆管の下に配置し、共通の胆管の周りに緩いオーバーハンド結び目を結びます。春のはさみを共通の胆管に対して平らに持ち、オディの括約筋の隣に共通の胆管が膵臓と腸に入る場所で、共通の胆管に斜め切開を行います。次に、黄色樹脂の1ミリリットルをMV硬化剤の50マイクロリットルと混合し、樹脂硬化剤混合物で1ミリリットルのルアーシリンジを充填する。充填したシリンジをチューブセット1と接続し、プランジャーを押して、樹脂硬化剤混合物がチューブの先端から滴り落ちるまでチューブを充填します。鉗子を使用して、共通の胆管切開部の周りの領域をまっすぐにします。ベバリング先端の最も長いエッジを持つ共通の胆管の開口部にチューブを挿入する前に、胆管の裏側に向かって下向きに。次に、シルク糸の結び目を締めて、共通の胆管内のチューブを固定します。一般的な胆管に樹脂を注入した後、胆嚢と個々の肝臓の葉を観察します。PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます。樹脂充填胆管末端枝は肝臓表面にかすかに見える。肝臓の表面に樹脂のドットが現れたり、抵抗性が合った場合は、樹脂の注入を停止します。次に、共通の胆管から引き出してチューブを取り除き、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れるのを防ぎます。絹の縫合糸の緩い端を切り取り、門脈注入を妨げないようにします。ポータル静脈に樹脂を注入する前に、まっすぐな鉗子を使用して、肝臓への入り口から約2センチメートルの周囲の組織から門脈を取り除きます。次に、シルク縫合糸をポータル静脈のクリアされた領域の下に置き、緩いオーバーハンド結び目を結びます。肝臓に遠位する門脈で、結び目を結ぶ前に縦切開を行う。次に、シリンジにグリーン樹脂硬化剤混合物を調製し、先に示したようにチューブを混合して充填します。鉗子を使用して、周囲の組織を尾側に向かって引っ張ってポータル静脈をまっすぐにしてから、ベベリング先端の最も長いエッジを持つチューブを容器の後側に向けて挿入します。絹糸を締めて、ポータルの静脈のチューブを固定します。ポータル静脈に樹脂を注入した後、血管が樹脂で満杯になっており、PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージして樹脂を広げます。すべての血管が充填されたら、門脈からチューブを引き出し、すぐに樹脂が漏れるのを防ぐために鉗子を使用してシルクの結び目を締めます。マウスから解剖された肝臓のマイクロコンピュータ断層撮影またはマイクロCTスキャンの場合、右内側の肝臓葉を15ミリリットルの円錐状チューブに入れ、チューブを1%アガロースゲルでチューブの総体積の約3分の2に充填し、MicroCT測定中の望ましくないサンプルの動きを最小限に抑えます。CT装置の回転段階にサンプルと15ミリリットルの円錐管を取り付けます。チューブを測定室に少なくとも1時間熱的に適応させます。サンプルが熱的に適合したら、視野または視野またはFOVの中心に置き、ソースサンプルとサンプル検出器の距離を最適化するか、SSDとSDDを十分なボクセル分解能に達するようにします。パラメータを設定したら、CT測定を開始します。専用の断層再構成ソフトウェアを使用して、CTデータを再構築します。CT データを分析するには、ファイル、インポート、およびコマンドを選択してファイルをロードします。上部パネルの表面決定機能を使用して、グローバルしきい値を使用してデータ内の樹脂をセグメント化します。ダイアログウィンドウで、樹脂充填容器のみをセグメント化するように赤い等値線の位置を設定して、ヒストグラム評価で閾値を決定します。左側のパネルで、ボリュームまたは CAD またはメッシュから ROI を作成するモジュールを選択して、樹脂充填容器の対象領域または ROI を作成します。ダイアログウィンドウで、ソリッドからROIを作成するオプションを使用して、処理されたボリュームの名前を選択して確認します。この ROI のバックグラウンド領域におけるノイズ クラスタの誤ったセグメンテーションを排除します。右パネルの ROI をマークするには、モジュール分割 ROI を右クリックして選択します。ダイアログ ウィンドウで、すべてのノイズ パーティクルを除外する最小ボリューム ボクセル パラメータを設定します。パラメータ値は実験とデータ依存であり、分析する各サンプルに最適化されます。左側のパネルでは、樹脂コストROIに気泡や樹脂漏出の存在のようなアーティファクトのない滑らかで連続的で固体の運河マスクを作成するために、スムージングモジュールを使用します。CTデータで高い強度値を持つ一般的な胆管注入に使用される黄色の樹脂のようなより吸収性の高い樹脂で満たされたシステムのために、前述のように別のROIを作成します。新しい ROI を減算する前に右クリックし、樹脂マスク ROI から新しい ROI を差し引いて残りの管状システムの新しい ROI を作成することで、新しい ROI をマスクします。異なるソフトウェアで後続処理を行うため、オペレータ参照に基づいて、両管状システムの ROI をさまざまな形式でエクスポートします。さらに、結果の ROI をボリューム・グラフィックス・ソフトウェアで処理して、最終的な視覚化をイメージまたはビデオの形式でエクスポートします。本研究では、十分に満たされた肝内胆管および門脈脈管で二重樹脂注入が成功した。代表的な分析は、P15マウスに対して十分に注入された肝臓からのセグメント化されたデータと、側枝に樹脂が見える成体マウスの結果を示す。注射に失敗した典型的な例では、外科的処置中の肝臓への物理的損傷は、樹脂漏出をもたらした。また、注射前に針やチューブの先端に樹脂を早期に硬化させ、かつ十分な心筋灌流が不十分な場合にシステムの過部充填を引き起こした。マイナー樹脂漏れは、MicroCTデータのセグメンテーション中に手動で修正することができます。高い射出圧力は、血管やダクトを破裂させ、血管またはダクトアーキテクチャを不可逆的に損傷する可能性があります。さらに、気泡は、管状ネットワークのまばらな充填につながった別の非常に一般的な注入アーティファクトでした。開けたばかりの樹脂を使用した場合、黄色の樹脂注入胆管と緑色の樹脂注入門脈とのコントラストの明らかな違いが認められた。3ヶ月間の貯蔵後、対照は胆道と門脈を区別するのに十分であった。しかし、沈殿は、充填された門脈の不均一な不透明度として見える2つの樹脂を混合する影響を受けた。樹脂が6ヶ月以上古いとき、コントラストは、黄色注入された胆管を緑色注入された門脈と区別することは不可能な時点まで劣化した。共通の胆管に斜め切開を行うことは重要です。それ以外の場合は、チューブを挿入することは非常に困難になります。ダクト技術は、ヒラーおよび末梢ローブ領域の明確な特徴を有する臨床的に関連するモデルにおける胆道再生の新しい建築メカニズムを明らかにする。

duct-double-resin-casting-followed-micro-computed-tomography-for-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。...

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

マウスの肝門脈や肝内胆管の3次元構造を可視化し、定量化する方法が記載されている。このレジンキャスト技術は、他の管または血管系に適用し、可能にすることができます...

3次元樹脂鋳造およびマウスの門脈や肝内胆管系の結

このビデオでは、3D胆道構造を理解するための胆道系レジンキャストの手順を説明しています。この手法は、胆道系の内径とネットワーク接続性に関する洞察を提供し、肝臓再生分析に使用できる可能性があります。...

胆道系レジンキャスティング:放射線不透過性樹脂注入を用いたマウスモデルにおける胆道系の3次元構造解析技術

血管再生を視覚化するために使用されるツールは、血管の樹木を対比するための方法を必要とします。このフィルムは、血管樹の最適なコントラストを達成し、μCTおよび組織学的シリアル切片を使用して得られた標本の詳細な分析から生じる潜在的な利点を示すために使用される繊細な注入技術を示しています。...

正常マウスで70％肝切除後の血管と実質再生の可視化

この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex...

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

本プロトコルは、肝臓 のin situ...

非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおける肝臓細胞外マトリックスの3Dイメージング

食事誘発性非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)マウスモデルを使用して、NAFLDの進行段階を評価するための非侵襲的方法としての新しい in vivo マイクロコンピューター断層撮影イメージング技術の使用について説明します、主に肝血管ネットワークに焦点を当てます...

非アルコール性脂肪性肝疾患の進行を評価するための新しい in vivo マイクロコンピュータ断層撮影イメージング技術

この研究の目的は、肝線維症の早期診断のための新しい3次元デジタルモデルを開発することでした、...

磁気共鳴エラストグラフィに基づく肝線維症の早期診断のための3次元ディジタルモデル

このプロトコルでは、マウスにおける同所性肝移植(OLT)の成功モデルの実装について説明します。さらに、マウスでOLTが成功した後の同種移植片の開存性をさらに分析するためのアジュバントについても、特にマイクロコンピューター断層撮影(microCT)スキャンを利用して説明します。...

マイクロコンピュータ断層撮影血管造影を用いたマウスの同所性肝移植の成功

このプロトコルは、生マウスの生命体内顕微鏡検査(IVM)用に最先端の再利用可能な肝画像診断ツール(RHIT)を導入し、迅速かつ急性期の実験において組織の安定性を高めます。RHITの3Dプリント設計はコスト効率の高い生産、拡張性、多用途性を提供し、さまざまなサイズのマウスにおける代謝過程の長期観察を可能にします。...

再利用可能な肝臓画像診断ツール:肝生命内顕微鏡検査用の再利用可能な3Dプリントツール

学ぶ DUCT法による3D肝臓血管・胆管系の可視化と定量化。マイクロCTを用いた二重樹脂鋳造技術で、抗体や蛍光イメージングに依存しない肝疾患と再生の構造解析を実現します。

ダクト:3D肝臓解析のためのマイクロコンピュータ断層撮影に続く二重樹脂鋳造

さらに動画を探す