Name: ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたヒト多能性幹細胞のコアシェル型カプセル化法。スフェロイド形成効率と生存率を向上させ、多孔プレートや撹拌培養に対応可能なスケーラブルな細胞治療開発技術です。

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この研究は、メイヨー・クリニック再生医療センター、J・W・キークヘファー財団、アル・ナヒヤン財団、ミネソタ州再生医療(RMM 101617 TR 004)、NIH(DK107255)からの助成金によって部分的に支援された。

1. デバイス製造
<ol><li>マイクロカプセル化装置及び解離装置の設計は、CADソフトウェア10,11を用いて行う。</li>
	<li>SU-8フォトレジストの3層をシリコンウェーハ上に順次スピンコートし(図2A)、所望の高さ(60、100、および150μm)の構造を達成する。 メモ: 上部金型と下部金型のプロセスは同じです。<ol>
<li>SU-8 2025ネガ型フォトレジストでクリーンな10cmシリコンウェハを1,100rpmでスピンコートし、最初の60μm層を作成しました。ホットプレート上で65°Cで3分間、95°Cで10分間ソフトベークした後、μPG 101PCにコアチャネルパターンの設計ファイルをアップロードしてマスクレスアライナーを用いて金型を露出させた。その後、65°Cで3分間、95°Cで10分間露光後ベークを進めた。</li>
		<li>2番目のSU-8 2025レイヤー(40μm)を1,500rpmでスピンコートし、シェルチャンネルパターンに適したCADファイルをアップロードして露光します。 メモ: ソフトベイクと露光後のベイクは、前の手順と類似していました。</li>
		<li>3番目のSU-8 2025層を1,400rpmでスピンコートして高さ50μmを達成し、上記のプロセスを繰り返しますが、油相の構造を露出させます。</li>
		<li>未露光のフォトレジストが全て除去されるまでSU-8現像液に浸漬して3層全てを1段階で現像する。</li>
		<li>金型を160°Cのホットプレート上で10分間ハードベークして密着性を向上させ、現像後に発生する可能性のある小さなクラックをシールします。</li>
		<li>次のステップでエラストマーの結合を避けるために金型をクロロトリメチルシランにさらし、使用するまで15cmのペトリ皿に入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>図1D及び図2Bで説明したように、同様に解離装置用モールドを準備する。ステップ1.2.3で前述したように、シリコンウェーハ上にSU-8フォトレジストの1層をスピンコートして、所望の高さ(50μm)の構造を達成する。前のステップと同様に、ソフトベイクと露光後のベイク、現像、ハードベイクを行います。 注:三角形の支柱の配列がチャンバ全体を覆い、チャンバの幅が出口に向かって減少するにつれてポスト間の間隔が狭まりました。三角形の支柱は、400 μm(入口)から30 μm(出口)の範囲のピッチで、片面あたり200 μmであった。</li>
	<li>ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィー法により金型を作製した。<ol>
<li>PDMSエラストマーベースとエラストマー硬化剤を遊星遠心分離機で10:1のw / w比で混合します。マイクロカプセル化マスターモールドと解離マスターモールドの両方に混合物を注ぎ、3〜4mmの層を作成します。 注:50gのエラストマーベースと5gの硬化剤の混合物は、厚さ3mmのマスターモールドを覆うのに十分です。</li>
		<li>金型を入れたシャーレを真空デシケーターに15分間置き、未硬化PDMSを脱気した。</li>
		<li>ペトリ皿をオーブンに移し、80°Cで最低60分間焼く。</li>
		<li>オーブンからマスターモールドを取り外し、冷却させます。精密ナイフを使用して、ウェーハの形状に合わせてPDMSを慎重に切断し、PDMS片をマスターモールドから剥がします。</li>
		<li>メスで各デバイスのエッジをトリミングしてPDMSスラブを切り取り、解離デバイスの入口/出口流体ポートをパンチアウトし、ステンレス製の針を使用して上部のマイクロ流体デバイスのみにパンチアウトします。汚染を避けるために、デバイスをマジックテープで覆います。 メモ: ニードルゲージは、入口ポートと出口ポートでそれぞれ 14 G と 15 G です。</li>
		<li>接合のために、PDMS片の上下のパターン化された側面を、プラズマエッチャー上のO2 プラズマで2分間処理する。</li>
		<li>両方のPDMS部品を立体鏡の下に合わせ、蒸留水の薄い分離層をマイクロチャネル(2μL)に直接加えます。</li>
		<li>アライメントされたPDMS装置を80°Cのオーブンに一晩置いて接合を完了し、PDMSを元の疎水性状態に戻した。さらに使用するまで、デバイスを保管してください。 注:これにより、コア用に120μm、シェル用に200μm、オイルチャネル用に300μmの3つの異なる高さを有する同軸フローフォーカシング装置が得られます。</li>
		<li>プラズマ接合直後にデバイスを使用するには、疎水性コーティング溶液30 μLを流体チャネルに慎重に、しかししっかりと注入し、疎水性コーティングを達成します。次いで、疎水性コーティング溶液の残留物が装置内で観察されなくなるまで、チャネルに空気を直ちにパージする。</li>
		<li>まず装置のパターン化された側と洗浄されたスライドガラスをO2 プラズマで2分間処理して解離装置を接着し、次いで80°Cのオーブンで一晩さらに硬化させるためにそれらを組み立てる。 メモ: デバイスは、その後使用するまで保管できます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 溶液の調製
<ol><li>ストックソリューション。まず、実際の使用のためにより低い濃度に希釈されるストック溶液(濃縮溶液)を調製する。 注:ストックソリューションは、低濃度で作業溶液を調製する際の準備時間の節約、材料の節約、保管スペースの削減、および精度の向上に使用されます。<ol>
<li>30 mL の 2x コア溶液 (16% PEG および 34% 密度グラジエント培地) を調製します: 4.8 g の 35 kDa PEG、10.2 mL の密度グラジエントメディア、および 19.8 mL の DMEM/F12 培地を混合します。このコア溶液を0.22μmのシリンジフィルターを使用してろ過します。</li>
		<li>50 mLの鉱物油を3%界面活性剤で調製する:48.5 mLの鉱物油と1.5 mLの界面活性剤を混ぜる。0.22 μmのシリンジフィルターでろ過した後、滅菌状態に保ちます。</li>
		<li>50 mLの鉱物油を0.5%界面活性剤で調製する:49.75 mLの鉱物油と0.25 mLの界面活性剤を混ぜる。無菌状態に保ちます。</li>
		<li>1 Mジチオセリトール(DTT)を調製する:1.5425gのDTTを10mL蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。</li>
		<li>1 Mトリエタノールアミン(TEA)を調製する:433.6 μLの蒸留水に66.4 μLのTEAを加える。無菌状態に保ちます。</li>
		<li>1%プルロニックF127(PF127)を調製する:100mgのPF127を10mLの蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実用的なソリューション<ol>
<li>4.5 mL の鉱物油と 3% 界面活性剤、および 300 μL の 1 M DTT (1:15 比) を混合して架橋剤エマルジョンを調製します。溶液を2分間ボルテックスし、20°Cの超音波浴中で45〜60分間超音波処理する。 この溶液を27G針で5mLシリンジにロードする。 注:エマルジョンは、油/水混合物を超音波処理することによって生成されます。</li>
		<li>27G針で5mLシリンジに0.5%界面活性剤を含む鉱物油をロードすることによって遮蔽油溶液を調製する。</li>
		<li>400 μLの1x DPBSに32 mgのPEG-4-Malを加えてシェル(8% w/v PEG-4-Malおよび15 mM TEA)溶液を調製し、8% w/v溶液を形成し、この溶液を2分間渦巻きます。その後、6 μLの1 M TEA(終濃度15 mM TEA)を添加する。最後に、スピンフィルターを通して13,000 x g で5分間遠心分離し、ロッカーの上で30分間暗闇の中に保ちます。次に、この溶液を27G針で1mLシリンジにロードする。 注:蓋を開ける前にPEG-4-Mal容器を室温で10分間放置し、蓋を閉じる前にN2ガスを吹き込んでO2をN2に置き換えてください。 溶液に添加する前にボルテックスTEAを。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コア溶液中の細胞懸濁液を調製する<ol>
<li>hPSCをトリプシンで37°Cで5〜10分間処理する。 それから、それらを皿から集めます。細胞剥離後にトリプシンを培地でクエンチし、次いで細胞を15mL円錐管に移す。</li>
		<li>バルク細胞懸濁液を遠心分離機(400 x g、5分間)する。上清を注意深く吸引し、次いで、最小限の体積の増殖培地を用いて細胞ペレットを再懸濁する。自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。 注:典型的な細胞アリコートは12〜20 x106 個の細胞を含み、400 μLのコア溶液を作るのに十分である。</li>
		<li>バルク細胞懸濁液から12〜20 x106 個の細胞を取り、細胞/培地懸濁液を遠心分離する(400 x g、5分間)。</li>
		<li>細胞ペレットから培地を注意深く吸引する。次いで、200 μL培地および200 μLの2x PEG溶液(最終濃度30〜50 x106 cell/mL)を加え、穏やかに混合する。 注:低い細胞濃度(20 x106 細胞/ mL未満)は、多くの空のカプセルをもたらした。</li>
		<li>30 μLの1% PF127を溶液に加える。</li>
		<li>マイクロスターラーバー (2 mm x 7 mm) を 1 mL シリンジに挿入し、コア溶液を含むセルを 27 G 針でシリンジにロードします。カプセル化プロセス全体を通して、溶液を氷で冷たく保ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 実験セットアップ
<ol><li>結合したPDMS液滴装置、長さ20cm、長さ5cmの入口マイクロチューブ(内径0.38mm×外径1.1mm)、出口チューブ1本(内径0.5mm×外径1.5mm)、および0.5cmフィッティングチューブ6本(内径1mm×外径1.8mm)を殺菌光源(通常は生物学的安全キャビネットに内蔵)の下に置き、30分間滅菌します。分。</li>
	<li>鉗子を使用して、チューブを流体入口ポートと解離ポートにフィットさせます。</li>
	<li>シェルには長さ20cmのマイクロチューブの3本、オイル、架橋剤エマルジョンの注入口には1本、解離装置の入口には1本を使用します。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液でシリンジの針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスのコア入口と解離デバイスの出口を1本の5cmマイクロチューブで接続する(図1C)。 メモ: 入口マイクロチューブは、最後のステップで挿入された継手チューブ内にしっかりと固定する必要があります。</li>
	<li>1 本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバーに入れます。</li>
	<li>装置を顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動かないようにします。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。</li>
	<li>各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します(図1B)。メーカーのプロトコルに従って、各ポンプを次の流量にプログラムします:コア(3-5 μL/分)、シェル(3-5 μL/分)、シールドオイル(20-80 μL/分)、および架橋オイル(40-60 μL/分)。すべてのポンプでフローを開始します。</li>
	<li>各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。 メモ: 入口チューブに大量の空気がある場合は、空気が完全に除去されるまで、各流量を一時的に増やしてください。過剰な流量は、PDMSとPDMS間の結合不良につながる可能性があることに注意してください。</li>
	<li>カプセル形成が安定したら(図3)、収集チューブの反対側の端を、5mLのmTeSR培地を含む新しい円錐形チューブに置きます。 注:培地には、10 μM ROCK阻害剤、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンが含まれています。</li>
	<li>十分な数のカプセルが回収された後、5%CO2 と共に37°Cで10分間インキュベートする。油相に常駐するカプセルは、チューブの上部にある( 図4A参照)。チューブを軽く叩くと、カプセルが底に沈降します。この後、ほとんどの油および媒体が吸引され得る。</li>
	<li>円錐管の底からカプセルを集め、セルストレーナー(孔径100μm)の上に置き、大量の培地で洗浄する。次いで、2mL培地を用いてマイクロカプセルを6ウェル培養プレートに集め、培地をウェルプレートの上に反転させたままフィルターに通した( 図4A参照)。</li>
</ol>4. マイクロカプセル中のhPSC培養および分析
<ol><li>基本的な文化<ol>
<li>幹細胞カプセルを6ウェルプレート培養皿中で5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。</li>
		<li>1日おきに培地を交換するには、カプセルをセルストレーナーフィルターに集め、余分な培地で洗浄し、ステップ3.10で行ったように2mL培地で6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁します。</li>
		<li>カプセルを少なくとも10日間培養する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>生/死アッセイを実行して、封入幹細胞の生存率を判断します。<ol>
<li>生/死アッセイ溶液(エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAM)を解凍する。</li>
		<li>4 μL の 2 μM エチジウムホモ二量体-1 および 1 μL の 4 μM カルセイン AM 溶液を 2 mL の滅菌 DPBS に加えます。完全な混合を確実にするための渦。</li>
		<li>セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから培地を拡散させます。</li>
		<li>ステップ4.2.2で調製した溶液1mLを用いて、それらを再び12穴培養プレートに集める。37°Cで20分間インキュベートする。</li>
		<li>蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。 注: 細胞生存率は、細胞の総数のうち、緑色で視覚化された生細胞の割合を計算することによって定量化されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回転楕円体サイズの特性評価。<ol>
<li>必要に応じて、マイクロカプセルの入ったウェルプレートを顕微鏡下に置き、適切なスケールバーを使用して関連ソフトウェアに表示される回転楕円体の直径を測定します。</li>
		<li>回転楕円体のサイズを測定および分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ここで説明するカプセル化プロセスは、hPSCスフェロイドの再現性のある形成をもたらす。マイクロカプセル形式により、分化プロトコルの改善/最適化または治療法の試験を目的とした実験のために、マイクロタイタープレートのウェルにスフェロイドを簡単に分配できます。封入幹細胞スフェロイドは、ヒドロゲルシェルが剪断誘発損傷から細胞を保護する懸濁培養においても使用され得る7。
プロトコル内にはいくつかの重要なステップがあります。コア、シェル、およびオイルの流れの流量を「プロトコル」セクションで説明されている範囲内に保つことが重要です。シェル流量が低すぎると、流れが不安定になり、歪んで機械的に不安定なカプセルを生じる。細胞のカプセル化が成功すると、 図4Cに示すマイクロカプセルのようになります。マイクロカプセルは、同様の直径のものでなければならず、コアに捕捉された同程度の数の細胞を有するべきである。単一細胞のスフェロイドへの凝集は、典型的には48時間以内に起こり、72時間でのスフェロイド形成の...

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の3D培養には、この培養フォーマットによってもたらされる改善された多能性および分化能のためにかなりの関心がある1、2、3。hPSCは、典型的には、バイオリアクター、マイクロウェル、ヒドロゲル、およびポリマー足場4、5、6によってスフェロイドまたは他の3D培養フォーマットに成形される。カプセル化は、単一のhPSCを回転楕円体に編成するための別の手段を提供する。一旦カプセル化されたhPSCスフェロイドは、容易に取り扱い、分化、疾患モデリング、または薬物検査実験のためにマイクロタイタープレートに移され得る。ヒドロゲル層にhPSCを包み込むと、剪断損傷から細胞を保護し、バイオリアクター内でスフェロイドを高い攪拌速度で培養することができます7。
幹細胞カプセル化のための私たちの方法論は、時間の経過とともに進化しました。まず、固体ヒドロゲル微粒子に着目し、マウス胚性幹細胞(mESC)の内包・培養に成功したことを実証しました8。しかし、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、このようなヒドロゲル微粒子に封入した場合の生存率が低いことが注目されたが、これはおそらく、これらの細胞が封入後に細胞間接触を再確立する必要性が大きいためである。我々は、水性コアを有する不均一なマイクロカプセルが、細胞間接触の迅速な再確立に依存する細胞のカプセル化に適している可能性があると推論した。水性コア/ヒドロゲルシェルマイクロカプセルを製造するための同軸流集束マイクロ流体装置の概念は、He et al.9から適応されたが、元のアプローチで採用されたアルギン酸塩の代わりに、PEGベースのヒドロゲルがシェルに組み込まれた。我々はまず、コアシェル型マイクロカプセル10 における初代肝細胞のカプセル化およびスフェロイド形成の成功を実証し、最近ではhESおよびiPS細胞のカプセル化7について説明した。 図1Aで概説されているように、カプセルは、シェルおよびコアの流れが油相に放出される前に、左右から同軸の流れに移行するフロー集束装置内で製造される。コアフローには溶液の粘度を増加させる細胞および添加剤(非反応性PEG MW 35kDおよびイオジキサノール - 商品名OptiPrep)が含まれ、シェルストリームには反応性分子(PEG-4-Mal)が含まれています。連続的な同軸流流は、コアシェルアーキテクチャを保持する液滴に離散化される。コアシェル構造は、クリック化学 を介して PEG-4-Malと反応し、薄い(〜10μm)ヒドロゲルスキンまたはシェルの形成をもたらすジチオール架橋剤(DTT)への曝露によって恒久的になる。エマルジョンが破壊され、カプセルが水相に移された後、PEGの分子はコアから拡散し、水分子によって置き換えられる。これは、水性コアおよびヒドロゲルシェルマイクロカプセルをもたらす。
以下に、マイクロ流体デバイスの製造方法、細胞の調製方法、およびhPSCのカプセル化方法に関するステップバイステップの手順を示します。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m シリンジフィルター</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ ルアーロックチップ</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Corning</td><td>23220003</td><td></td></tr><tr><td>4アーム PEG マレイミド, 10kDa</td><td>Laysan Inc.</td><td>164-68</td><td></td></tr><tr><td>5 ml シリンジ ルアーロック チップ</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル ノントリートメント プレート</td><td>USA サイエンティフィック</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>アクアペル アプリケーター パック</td><td>アクアペル ガラス トリートメント</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>CAD ソフトウェア</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD v2020</td><td></td></tr><tr><td>CELL STRAINER 100 & micro;m孔径</td><td>枢機卿335583</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロトリメチルシラン</td><td>アルドリッチ</td><td>386529-100mL</td><td></td></tr><tr><td>伯爵夫人II FL自動セルカウンターライフ</td><td>テクノロジーA27974</td><td></td><td></td></tr>デジタル<tr><td>ホットプレート</td><td>データプレート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルボルテックスミキサー</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>215370</td><td></td></tr>蒸留<tr><td>水Gibco</td><td></td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>ジチオテリトール (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培地</td><td>gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td><td>live</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光電動顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス IX83</td><td></td></tr><tr><td>ローレル スピンコーター</td><td>ローレルテクノロジー</td>ズ <td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>生/死んだ哺乳類染色キット</td><td>フィッシャー</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>マジックテープ</td> ステー<td>プル</td><td>483535</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメディカルチューブ (0.015インチ I.D. x 0.043インチ O.D.)</td><td>サイエンティフィック・コモディティーズ社</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスターバー</td><td>ダイガー・サイエンティフィック・サイエンティフィ</td>ック<td>・シグマ</td> EF3288E <td></td></tr><tr><td>ミリポアシグマ フィルター鉗子</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック・<td>XX6200006Pサイ</td>エンティフィック・オイル <td></td></tr><tr><td></td> シ<td>グマ</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1 基礎培地</td><td>STEMCELL TECHNOLOGY</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ニードル-ステンレススチール&nbsp; 14ゲージ</td><td>CML供給</td><td>901-14-025</td><td></td></tr><tr><td>ニードル-ステンレス鋼&nbsp; 15ゲージ</td><td>CML供給</td><td>901-15-050</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGY</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERA THERM オーブン</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン:ストレプトマイシン (10,000 U/mL ペニシリン G、10mg/mL ストレプトマイシン)</td><td>ジェミニ</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ 150X20 滅菌ベント</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>82.1184.500</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ洗浄システム</td><td>歩留まりエンジニアリングシステム株式会社</td><td>YES-G500</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>Σ</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) 35kDa</td><td>Σ</td><td>94646-250G-F</td><td></td></tr><tr><td>プレシジョングライドニードル 27G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>岩石阻害剤 Y-27632 ジヒドロクロライド</td><td>SELLECK CHEM</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウエハー 100mm</td><td>ユニバーシティウエハー</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス (75mm & 急性; 25mm)</td><td>CardinalHealth</td><td>M6146</td><td></td></tr><tr><td>Span 80</td><td>Sigma</td><td>S6760-250ML</td><td></td></tr><tr><td>SpeedMixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X 遠心分離管フィルター (0.22 & マイクロ;m)</td><td>Costar</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111069 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td><td>fisher</td><td>scientific 22-079-684</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>New Era Pump System, Inc</td><td>NE-4000</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T58300-25G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)</td><td>コールパー</td><td>マー06419-01</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ(0.04 "IDx 0.07 "OD)</td><td>コールパー</td><td>マー06419-04</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機FS20D</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CPN-962-152R</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケー</td><td>ターBel-Art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr>ツァ<tr><td>イスステミDV4実体顕微鏡8x-32x</td><td>ZEISS</td><td>435421-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>&mu;PG 101 レーザーライター</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>HI 1128</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の三次元(3D)またはスフェロイド培養は、分化転帰およびスケーラビリティの改善という利点を提供する。本稿では、コアシェルマイクロカプセル内にhPSCを閉じ込めるために同軸流集束装置を利用するhPSCスフェロイドの堅牢で再現性のある形成のための戦略を説明する。コア溶液はhPSCsの単一細胞懸濁液を含み、高分子量ポリ(エチレングリコール)(PEG)および密度勾配培地の混入によって粘性を持たせた。シェルストリームはPEG-4アームマレイミドまたはPEG-4-Malで構成され、コアストリームに沿って2つの連続したオイルジャンクションに向かって流れました。液滴形成は、シェル溶液がコアの周りに自分自身を包み込む最初のオイル接合部で起こった。シェルの化学的架橋は、これらの液滴にジチオール架橋剤(1,4−ジチオスレイトールまたはDTT)を導入することによって、第2の油接合部で起こった。架橋剤は、クリック化学 を介して マレイミド官能基と反応し、マイクロカプセルの周囲にヒドロゲルシェルを形成する。当社のカプセル化技術は、直径400μmのカプセルを毎秒10カプセルの割合で製造しました。得られたカプセルは、ヒドロゲルシェルと水性コアを有し、単一細胞が迅速に凝集体に集合し、スフェロイドを形成することを可能にする。カプセル化のプロセスはhPSCの生存率に悪影響を及ぼさず、カプセル化後3日目に>95%の生存率が観察された。比較のために、固体ゲル微粒子(水性コアなし)に封入されたhPSCはスフェロイドを形成せず、封入後3日目に<50%の生存率を有していた。コアシェル型マイクロカプセル内のhPSCのスフェロイド形成は、封入後48時間以内に起こり、スフェロイド直径は細胞接種密度の関数である。全体として、このプロトコルに記載されているマイクロ流体カプセル化技術は、hPSCsカプセル化および回転楕円体形成に適していた。

上記のプロトコルに従うことによって、読者はマイクロ流体デバイスを作製し、細胞運搬マイクロカプセルを製造することができるであろう。 図3A は、マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルの例を示す。PEG−4−Malの異なる製剤は、様々な形態のカプセルをもたらした - しわのあるカプセルは、貧弱なゲル化、低い機械的完全性、および撹拌バイオリアクターでの培養に耐えられなかった。PEG含量&gt;6%で観察された滑らかなカプセルは、所望のカプセル形態を表し、細胞培養に十分堅牢であった。コアシェル構造は、マイクロビーズをコアに、蛍光部分をマイクロカプセルのシェルに組み込むことによって確認した。 図3B に見られるようにカプセルの中央におけるビーズの凝集は、コアが水性であり、ビーズが自由に動き回っていることを示すものとして使用された。 図3C で観察された蛍光環状は、ヒドロゲルシェルの存在を示し、シェルの厚さを決定するために使用した。カプセル...

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

この領域は、この培養物が形成した多能性および分化能の向上によるヒト多能性幹細胞の3D培養において興味深いと考えられる。我々は、ヒト多能性幹細胞スフェロイドの再現性のある形成をもたらす我々のカプセル化戦略を説明した。一旦封入されると、これらの幹細胞スフェロイドは、マルチウェルプレートまたは撹拌バイオリアクターのいずれかで、培養に適している。私たちのカプセル化戦略は、スフェロイド形成の疫病の生存性と高効率を最適化することです。カプセル化されたスフェロイドは、攪拌または揺動に関連するせん断または機械的エネルギーから保護される。細胞療法から誘導された幹細胞の開発は、スケーラブルで効率的かつ費用対効果の高い方法で所望の細胞産物を生成する能力に部分的に依存する。ここで説明するカプセル化技術は、この方向への一歩を表しています。ここで説明するカプセル化技術は、おそらく他の細胞から他の多能性幹細胞まで様々な細胞型の3D培養に適用できるだろう。まず、4.8グラムの35キロダルトンPEG、10.2ミリリットルの密度勾配媒体、および19.8ミリリットルのDMEM/F-12媒体を混合することによって、30ミリリットルの2倍のコアストック溶液を調製することから始めます。次に、このコア溶液を0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してろ過します。次に、48.5ミリリットルの鉱物油と1.5ミリリットルの界面活性剤を混合することによって、50ミリリットルの鉱物油と3%の界面活性剤を調製する。次いで、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターに通すことによって溶液を滅菌する。次に、テキスト原稿に記載されているように、1モルDTT、1モルTEA、および1%PF127溶液を調製する。次いで、4.5ミリリットルの鉱物油を3%の界面活性剤および300マイクロリットルの1モルDTTと混合することによって架橋剤エマルジョンを調製する。溶液を2分間ボルテックスした後、摂氏20度の超音波浴中で45〜60分間超音波処理し、27ゲージ針で5ミリリットルのシリンジにロードする。次に、鉱物油に0.5%の界面活性剤を27ゲージ針を備えた5ミリリットルのシリンジに装填して遮蔽油溶液を調製する。シェル溶液を調製するために、400マイクロリットルのDPBSに32ミリグラムのPEG4マレイミドを加える。次いで、6マイクロリットルの1モルTEAを加える。溶液を2分間渦巻きにし、スピンフィルターを通して遠心分離する。溶液をロッカーの暗闇に30分間保持してから、27ゲージの針で1ミリリットルのシリンジにロードします。最後に、2,000万hPSCを200マイクロリットルの媒体に再懸濁し、30マイクロリットルの1%PF127および200マイクロリットルの2倍コア溶液と混合することによって、最終的なコア溶液を調製する。小さなスターラーバーを1ミリリットルのシリンジに挿入します。次に、コア溶液を含むセルを27ゲージの針でシリンジにロードします。まず、結合されたPDMS液滴装置、長さ20センチメートルの4本、長さ5センチメートルの入口マイクロチューブ1本、出口チューブ1本、および0.5センチメートルのフィッティングチューブ6個を殺菌光源の下に30分間置いて滅菌します。次に、長さ20センチメートルの入口マイクロチューブ4本を、鉗子を使用してシェル、オイル、架橋剤エマルジョン、および解離装置入口に合わせます。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液とともにシリンジ針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスコア入口と解離デバイス出口とを5センチメートルのマイクロチューブで接続する。1本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバに入れます。次に、デバイスを顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動きを避けます。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します。メーカーのプロトコルに従って各ポンプをテキスト原稿に記載されている流量にプログラムし、すべてのポンプでフローを開始します。各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。カプセル形成が安定したら、収集チューブの反対側の端を、5ミリリットルのmTeSR媒体を含む新しい円錐形チューブに入れます。十分なカプセルが集められたら、それらを10分間インキュベートする。油相に存在するカプセルはチューブの上部にあり、チューブを軽く叩くと底に沈降します。カプセルを取り出すには、まず回収チューブから油を取り除きます。次に、100マイクロメートルの孔径のセルストレーナーにカプセルを置き、大量の培地でストレーナーを洗浄します。6ウェル培養プレートのウェルの上にフィルターを反転させ、フィルターに2ミリリットルの培地を通すことによってマイクロカプセルを集める。幹細胞カプセルを6ウェル培養皿に入れ、摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートする。1日おきに、カプセルをセルストレーナーフィルターで回収し、余分な培地で洗浄し、2ミリリットルの培地を含む6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁することによって、培地を交換します。2マイクロリットルの滅菌DPBSに4マイクロリットルの2マイクロモルのエチジウムホモダイマー−1および1マイクロリットルの4マイクロモルのカルセイン−AM溶液を加えることによって生存率アッセイを行う。完全な混合を確実にするための渦。セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから媒体拡散できるようにします。エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAMを含む調製溶液1ミリリットルを用いて、それらを12ウェル培養プレートに再度収集し、摂氏37度で20分間インキュベートする。蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルは、シェル中のPEG4−マレイミド含量の関数としてのカプセル形態に違いを示した。明るいエッジを有する滑らかなカプセルは、所望の機械的完全性に関連する。カプセルの中央におけるビーズの凝集は、コアが水性であり、ビーズが自由に動き回っていたことを示している。蛍光環状はヒドロゲルシェルの存在を示し、シェルの厚さを決定するために使用した。H9細胞を封入してから6時間後の生染色または死染色は、細胞が封入実行中に日常的に95%以上の生存率を達成したことを示した。カプセル化スフェロイドと非カプセル化スフェロイドの増殖速度および分化能を比較した。カプセル化のプロセスはhPSCに悪影響を及ぼさないことが決定された。コアシェルとオイルストリーム間の最適な流量比を確立することが重要です。これを行わないと、カプセルが機械的に強くならず、取り扱い中に破裂する可能性があります。このカプセル化技術は、ヒト多能性幹細胞以外の細胞型に対するものであったことを指摘しておきたい。我々は、同様の戦略を用いて、主に仮説上の癌細胞株および間葉系幹細胞をカプセル化した。現在、私たちのチームは次世代のマイクロキャプチャを開発しています。これらのマイクロキャプチャーは生理活性であり、幹細胞のカプセル化された分化のための交差因子を負荷してもよい。

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Bioengineering

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ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

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