DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

私たちのような堅牢なプレートリーダーアッセイは、潜在的なメチルトランスフェラーゼ阻害剤の初期スクリーニングに非常に役立ちます。リアルタイムでデータを収集できることは、連続エンドヌクレアーゼ共役アッセイの大きな利点です。まず、氷上のマイクロ遠心チューブに20マイクロモルと50マイクロモルの化合物を別々に含む600マイクロリットルのアッセイ条件を準備します。

これを行うには、二重蒸留水と5Xメチル化バッファーを各チューブに追加して、最終濃度1Xメチル化バッファーを達成します。次に、各サンプルに3.15マイクロリットルの20ミリグラム/ミリリットルウシ血清卵白(BSA)を加えます。次に、2マイクロリットルの3.15マイクロモルのヘアピンDNA基質と1.33マイクロリットルの4.75マイクロモルのS-アデノシルメチオニン(SAM)を各サンプルに追加します。

適切なサンプルに阻害剤を添加して、最終濃度21マイクロモルまたは52.5マイクロモルと等量のジメチルスルホキシド(DMSO)をコントロールサンプルに添加してから、毎分3, 000回転で3秒間ボルテックスして溶液を混合します。次に、サンプルをテーブルテーブルミニ遠心分離機で1, 200倍Gで数秒間回転させ、溶液がチューブの底に確実に収集されるようにします。各アッセイ溶液95マイクロリットルを黒半分領域96ウェルプレート中の6つの連続したウェルに分注する。

75マイクロリットルのGla IまたはDNMT1とGlaI酵素溶液を前述のようにマイクロ遠心チューブに調製し、終濃度のワンタイムバッファーにします。次に、1マイクロリットル当たり10単位のGla Iを1.2マイクロリットル添加して、1マイクロリットル当たり0.16単位の最終濃度を達成する。DNMT1とGla I溶液に0.6マイクロリットルの5マイクロモルRFTS欠損DNMT1を加え、最終濃度を40ナノモルにします。

穏やかに混合した後、サンプルを卓上ミニ遠心分離機で1, 200 Gで数秒間回転させて、溶液がチューブの底に確実に収集されるようにします。次いで、各酵素溶液12マイクロリットルを円錐底96ウェルプレート内の6ウェルに分注する。DNAサンプルのメチル化アッセイでは、プレートリーダーを摂氏37度に予熱します。

次に、アッセイ溶液を入れた黒色プレートをプレートリーダーに挿入します。プレートを425CPMで振とうした後、励起波長485ナノメートル、発光波長528ナノメートルで蛍光を測定します。次に、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。

プレートリーダーからアッセイプレートを取り出し、各ウェルに5マイクロリットルの酵素溶液を加え、続いて上下にピペッティングして溶液を混合します。プレートをプレートリーダーに挿入し、プレートを振ってから、53秒ごとに30分間蛍光を記録します。各条件について、三重のGlaIコントロールアッセイの平均蛍光を取得し、RFTS欠損DNMT1の存在下で得られた三重の痕跡から平均Gla I含有対照反応トレイを差し引きます。

次に、補正された反復の平均と標準誤差を求めます。平均補正反応トレースをプロットし、初期線形部分を線に当てはめて初速度を決定します。化合物の存在下で観察された速度をDMSO含有対照反応で観察された速度で割り、100を掛けることにより、活性率を決定します。

不連続エンドヌクレアーゼ共役アッセイの結果は、完全にメチル化された産物DNAが切断から保護されていることを示し、RFTS欠損DNMT1が活性であり、ヘミメチル化基質DNAをメチル化できることを裏付けました。蛍光ベースのアッセイでは、Gla Iの非存在下では、DNMT1または緩衝液のみの添加はバックグラウンド蛍光に影響しなかった。その後、すべてのアッセイにGla Iを添加すると、DNMT1を含むアッセイでのみ蛍光が生成されました。

RFTS欠損DNMT1とGla Iを3つのアッセイに同時に添加すると、堅牢な蛍光生成が得られました。Gla Iのみを添加しても蛍光は生じなかった。潜在的な阻害剤をスクリーニングするために、RFTS欠損DNMT1のDNAメチル化活性を、DMSO、化合物1、化合物2、または化合物3の存在下で20および50マイクロモル濃度で調べました。

この結合アッセイで蛍光生成を低減する化合物は、さらに検証する必要があります。化合物がカップリング酵素を阻害していないことを確認することは、重要な次のステップです。