Name: 初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離法。CD11bマイクロビーズを用いた細胞培養技術で、in vivoに近い条件下で高純度・高生存率の初代細胞を得られ、神経炎症研究や貪食活性評価に応用できます。

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図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。

議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。
1.単離および細胞培養のための滅菌溶液の調製
<ol><li>市販の10x溶液から、Ca2+およびMg2+(HBSS-/-)を含まない1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)50mLを調製します(材料の表を参照)。</li>
	<li>市販の組織解離キット(材料の表を参照)を用いて、表1に提供される組成に従って解離混合物を調製する。</li>
	<li>市販の10x溶液から、Ca2+およびMg 2+(HBSS+/+)を含む1x HBSSを200 mL調製します。</li>
	<li>200 mLの1x PBS + 0.5% BSA(セルソーティングバッファーと呼ばれる)を調製します。</li>
	<li>表2に従ってCD11bマイクロビーズを調製する。</li>
	<li>500 mLのマクロファージ無血清培養培地(SFM)+1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を調製します。50 mLチューブをアリコートし、4°Cで保存します。 これは、本文の後半でミクログリア培地と呼ばれます。 注:すべての単離溶液は、実験日に無菌条件下で新たに調製し、氷上に保管する必要があります。ミクログリア細胞培養培地を調製し、50 mLチューブに分注し、将来の使用のために4°Cに保つことができます。ろ過は必要ありません。</li>
</ol>2.脳解剖
<ol><li>以前の全身麻酔なしで大きなハサミを使用して子犬の頭を斬首します。</li>
	<li>矢状縫合糸(15〜20 mm)に続いて、小さなハサミで首から鼻までの皮膚を切り取ります(図1A-C)。</li>
	<li>頭蓋骨に平行な大孔内に小さなはさみの先端を挿入します。両側から目まで慎重にカットします(図1D、E)。</li>
	<li>小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します(図1F)。</li>
	<li>2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球に近づけ、下にある脳を傷つけないように注意しながら頭蓋骨を慎重に引き裂きます(図1G-I)。</li>
	<li>かみそりの刃で小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります(図1J)。</li>
	<li>脳片を30〜40 mLのHBSS-/- を含むペトリ皿に入れます(図1K)。</li>
</ol>3. 脳解離と磁気ミクログリア分離
注:すべての細胞操作および再懸濁は、1,000 μLピペットを使用して細心の注意を払って実行する必要があります。高い機械的作用を適用すると、ミクログリア細胞を活性化または死滅させる可能性があります。
<ol><li>表1に従って解離混合物を含む解離チューブあたり12個の脳片(~1.2 g)を移します。24匹の子犬には、4本のCチューブが必要でした(図2A-B)。</li>
	<li>Cチューブを解離器に置きます(加熱モードを使用)。製造元の指示に従って、機器で最適化されたNTDKプログラムを開始します(図2D)。</li>
	<li>300 x g で20秒間(4°Cで)遠心分離し、すべての細胞を回収します。1,000 μLのピペットで上下に3回ピペッティングすることにより、機械的解離を完了します(図2E)。</li>
	<li>細胞を4本の15 mLチューブ+ストレーナーに移します。ストレーナーを10 mLのHBSS+/+ ですすいでください(図2F)。</li>
	<li>300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLのHBSS+/+ で慎重に再懸濁します(図2G)。</li>
	<li>300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(ステップ1.4)(図2H)。</li>
	<li>300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。チューブあたり200 μLのCD11bマイクロビーズ溶液(ステップ1.5)を加え、慎重に再懸濁します(図2I)。</li>
	<li>チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートします。 ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2I-J)。</li>
	<li>300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを8 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2K)。</li>
	<li>セパレータのPOSSELプログラム( 材料表を参照)に従って、8つの列を準備します。細胞を1 mLずつカラムに移します。すべての細胞が通過するのを待ってから、別のmLを追加します。CD11b+細胞を滅菌溶出プレート上で1 mLのソーティングバッファーで溶出します(図2L)。</li>
	<li>CD11b+細胞を新しい50 mLチューブにプールします(図2M)。</li>
	<li>300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLの冷たいミクログリア培地で注意深く再懸濁します(ステップ1.6)(図2N)。</li>
	<li>CD11b +細胞をカウントします。P8では、脳あたり~650,000個の細胞が得られるはずです。 注:本プロトコルでは、細胞は自動セルカウンターを使用してカウントされました( 材料の表を参照)。</li>
	<li>細胞を低温ミクログリア培地に最終濃度650,000〜700,000細胞/ mLまで再懸濁し、細胞培養プレートに分注します。 注:6ウェルプレートはウェスタンブロット用です(ウェルあたり2 mL)。12ウェルプレートはRT-qPCR分析用(ウェルあたり1 mL)、96ウェルプレートは食作用アッセイ用(ウェルあたり250 μL)用です。3つすべてがこの作業に使用されました。ただし、この原稿では、ウェスタンブロット分析の結果は示されていませんが、このプロトコルで実行することは可能です。</li>
	<li>プレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。予熱したミクログリア培地を入れた1,000 μLピペットで培地を慎重に交換します。</li>
	<li>刺激の前にプレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。 注:36匹以上の子犬からミクログリアを分離し、P9以降はお勧めしません。これにより、ミクログリアを活性化するための細胞破片の汚染と蓄積のリスクが高まります。</li>
</ol>4.細胞刺激
<ol><li>市販の試薬を用いて表 3 に従って刺激試薬を調製する( 材料の表参照)。</li>
	<li>刺激された各ウェルに適切な量を追加します。 注:適切な容量は、刺激の濃度とウェルのサイズによって異なります。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2で6時間、24時間、または48時間の刺激が終了するまで置きます。</li>
	<li>ウェスタンブロット分析では、上清を吸引し、50 μLのタンパク質溶解バッファー( 材料表を参照)をピペットで加えます。チップを使用してプレートの底を引っ掻き、溶解した細胞を剥離し、1.5 mLチューブに移します。-80°Cで保存してください。 注:培養プレートは、上清が正しく吸引されていれば、-80°Cで何年も保存できます。</li>
	<li>RT-qPCR分析6,31の場合、上清を吸引し、mRNA抽出まで培養プレートを-80°Cで直接保存します(ステップ5)。</li>
	<li>食作用アッセイについては、ステップ6を参照してください。</li>
</ol>5. mRNA抽出とRT-qPCR分析
<ol><li>製造元のプロトコルに従って、RNA抽出、RT-PCR、およびRT-qPCRを実行します(材料表を参照)。プライマー配列5、6、31については表4を参照されたい。</li>
	<li>以前に公開されたレポートに従ってRT-qPCR分析を実行します5.</li>
</ol>6.貪食アッセイ
<ol><li>細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に食作用アッセイを実行します。例えば、6時間の刺激の場合、3時間の刺激後に食作用アッセイを開始する。12時間の刺激の場合、刺激開始後9時間で貪食アッセイを開始する。</li>
	<li>比率を考慮して準備に必要なビーズの数を計算します(1セル:50ビーズ)。96ウェルプレートの1ウェルには、8.1 x 106 ビーズが必要です。 表5に従ってビーズ混合物を調製する。 注意: PBS / FBS混合物に加える前に、ビーズストックバイアルを注意深くボルテックスします。</li>
	<li>37°Cの水浴中で1時間インキュベートします。 10分ごとに渦を流します。</li>
	<li>各ウェルに追加する溶液量を計算します。溶液を加え、3時間インキュベートする。</li>
	<li>1x PBSでウェルを3回すすぎます。550 nm(Cy3発光波長)の蛍光発光を読み取ります。</li>
</ol>7. 純度の品質管理
<ol><li>フローサイトメトリー(FACS)によるCD11b磁気単離の純度(細胞選別前後)を評価し、RT-qPCRを実行します。<ol><li>細胞をカウントし、FACSバッファー(PBS + 2 mMのEDTA + 0.5%ウシ血清アルブミン)に再懸濁して、ステップ3.5およびステップ3.14の後に10 x 106 細胞/mLの希釈液を取得します。</li>
		<li>従来のFcブロッキング32,33を15分間行った後、マウスCD45、CD11b、CX3CR1、ACSA-2、O4またはそれらに対応するコントロールアイソタイプ32,33に対する生存率プローブ(FVS780)および蛍光色素標識抗体を用いて、細胞をメーカーが推奨する濃度で15分間インキュベートします(材料の表を参照)。</li>
		<li>細胞をFACSバッファーで洗浄し、固定し、市販の透過処理キットで透過処理します(材料の表を参照)。</li>
		<li>透過処理した細胞で再度Fcブロッキングを行い、NeuN( 材料の表を参照)またはそのコントロールアイソタイプに対する蛍光色素標識抗体とともに15分間インキュベートします。</li>
		<li>FACSバッファーで洗浄した後、FACS分析を実行します。</li>
		<li>形態学的パラメータおよびFVS780染色に基づいてダブレットおよび死細胞をそれぞれ除外した後、陽性細胞の割合の分析のために、CX3CR1(ミクログリア)、ACSA-2(星状細胞)、O4(希突起膠細胞)、およびNeuN(ニューロン)の細胞内存在の表面発現のためのゲーティング戦略を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ5に続いて、mRNAを抽出し、RT-qPCRを実行して、 Itgam (CD11b)、Cx3cr1、Olig2、シナプトフィジン、 および Gfap mRNAを定量します。レポーターとして Rpl13a mRNAを用いてCqを正規化し、 Itgam mRNAに対する相対発現を行う。</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。
古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービタルシェーカーを使用して機械的に分離されます。ミクログリアをin vitroで単離して培養する方法は、1990年代の終わりに新生児ラットの脳から初めて記載された40,41。それ以来、活性化/休止ミクログリアや炎症誘発性/抗炎症性ミクログリアなどのミクログリア表現型の分析に広く使用されています。さらに、この実験は、ミクログリアをニューロンと共培養した神経毒性細胞として定義するための基礎となっています。しかし、2014年に、Biberと共同研究者は、古典的な方法を使用してin vitro<...

ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。
脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ないため、困難な場合があります。したがって、ミクログリアに関するin vitro研究は、毒性7、8、9、神経保護戦略5、10、11、12、13、14、および共培養15、16、17、18、19、20、21に広く使用されています。.インビトロ研究では、ミクログリア細胞株、幹細胞由来のミクログリア、または初代ミクログリア培養のいずれかを使用できます。これらすべてのアプローチには長所と短所があり、選択は最初の生物学的問題によって異なります。初代ミクログリア培養を使用する利点は、均質な遺伝的背景、病原体のない履歴、および動物の死後にミクログリアが刺激される時間の制御です22。
長年にわたり、新生児と成人の両方のげっ歯類から一次ミクログリアを培養するためのさまざまな方法(フローサイトメトリー、振とう、または磁気標識)が開発されました23、24、25、26、27、28、29。本研究では、マウス新生児仔からのミクログリア単離を、マイクロビーズコーティング抗マウスCD11b25,27,29を用いた既述の磁気活性化細胞選別技術を用いて行う。CD11bは、ミクログリアを含む骨髄系細胞の表面に発現するインテグリン受容体です。脳内に炎症性の問題がない場合、ほとんどすべてのCD11b +細胞はミクログリア30です。以前に発表された他の方法23、24、25、26、27、28、29と比較して、本プロトコルは、即時のex vivoミクログリア活性化分析および一般的なin vitro初代ミクログリア培養のバランスをとる。したがって、ミクログリアは、(1)ミエリン除去なしで(P)8生後日に単離され、(2)血清なしで培養され、(3)脳単離後わずか48時間でsiRNA、miRNA、薬理学的化合物、および/または炎症刺激のいずれかに曝露されます。これらの3つの側面のそれぞれは、現在のプロトコルを関連性があり迅速なものにします。まず第一に、小児ミクログリアの使用は、インビトロでミクログリア反応性を潜在的に改変する可能性のある追加の脱髄ステップを必要とせずに、培養中の動的で反応性の生存細胞を得ることを可能にする。本プロトコルは、ミクログリアの生理学的環境にできるだけ近づけることを目的とする。実際、ミクログリアは血清に遭遇することはなく、このプロトコルも血清の使用を必要としません。さらに、培養後48時間という早い時期にミクログリアを曝露することで、ミクログリアが生理学的能力を失うことを防ぎます。

<table><tbody><tr><td>反マウスACSA-2 PE Vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>反マウスCD11b BV421</td><td>ソニーバイオテクノロジー</td><td>1106255</td><td></td></tr><tr><td>反マウスCD45 BV510</td><td>ソニーバイオテクノロジー</td><td>1115690</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCX3CR1 PE Cy7</td><td>ソニーバイオテクノロジー</td><td>1345075</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスNeuN PE</td><td>Milli-Mark</td><td>FCMAB317PE</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス O4 Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-016</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 透過化キット</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td><td>Dutscher</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Fcブロッキング試薬(マウスCD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon ECLIPSE TE300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)+CaCl2 +MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14065049</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液(HBSS)-CaCl2 -MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185045</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp;Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1725006CUST</td><td></td></tr><tr><td>Iscript c-DNA synthesis</td><td>Bio-rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>ラテックスビーズ、アミン変性ポリスチレン、蛍光赤色</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2776-1mL</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類 (LPS) from&nbsp;大腸菌&nbsp;O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>マクロファージ-SFM 無血清培地</td><td>Thermo Scientific</td><td>12065074</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA ストックソリューション</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu;m)、4 x 25個</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG1 PE</td><td>Millipore</td><td>MABC002H</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG2a PE Cy7</td><td>ソニーバイオテクノロジー</td><td>2601265</td><td></td></tr><tr><td>マウス IL1 ベータ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-684</td><td></td></tr><tr><td>Multi-24 カラム ブロック</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-691</td><td></td></tr><tr><td>MultiMACS Cell24 セパレーター</td><td>MiltenyiBiotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>神経組織解離キット - Papain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Nucleocounter NC-200</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA Plus XS</td><td>Macherey Nagel</td><td>740990.5</td><td></td></tr><tr><td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>OPTILUX ペトリ皿 - 100 x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>P&eacute;nicilline-streptomycine (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2603230</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) PE vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-616</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-445</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIFN-γタンパク質</td><td>R&D System</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-10 タンパク質</td><td>R&D System</td><td>417-ML</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-4タンパク質</td><td>R&D System</td><td>404-ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>生存率プローブ (FVS780)</td><td>BD Biosciences 565388</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。

ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状態を特徴付けるために一般的に使用されます。ここでは、磁気結合ビーズを用いて幼若期の初代ミクログリアを単離するアプローチを提示する。
in vitroでのミクログリア活性化の簡単な読み出しは、炎症誘発性表現型(Cd86、Nos2、Ptgs2、Tnf)または抗炎症表現型(Cd206、Igf1、Arg1、Lgasl3)<sup class="...

初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

このプロトコルにより、in vivo特性を厳密に模倣する条件でミクログリアを培養することができます。磁気セルソーティング技術を使用して、私たちのプロトコルは、培養培地に血清を使用せずに、in vitroでわずか2日間ミクログリアを刺激することを可能にします。まず、小さなハサミを使用して、15〜20ミリメートルの矢状縫合糸に従って、首から鼻までの皮膚を切ります。頭蓋骨と平行な大孔で先端を挿入します。両側から目まで切ります。小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します。2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球の近くでつかみ、慎重に頭蓋骨を引き裂きます。かみそりの刃で、小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります。カルシウムとマグネシウムを含まない40ミリリットルのHBSSを含むペトリ皿に脳片を置きます。この表に従って解離混合物を調製する。12個の脳片をCチューブに移し、解離チューブあたり総重量1.2グラムにします。次に、加熱しながらCチューブをディソシエーターに置きます。最適化された NTDK プログラムをディソシエータで起動します。20秒間遠心分離します。ピペッティングを3回行うことで機械的解離を完了します。ストレーナーが取り付けられた4本の15ミリリットルチューブにセルを移します。カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSでストレーナーをすすぎます。10分間遠心分離し、10ミリリットルのピペットで上清を除去する。カルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのHBSSを慎重に加え、ペレットを再懸濁します。再度、遠心分離し、上清を除去する。ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てる。次に、200マイクロリットルのCD11bマイクロビーズ溶液を加え、摂氏4度で15〜20分間チューブをインキュベートします。インキュベーション後、ペレットを6ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。遠心分離を繰り返し、ペレットを8ミリリットルのソーティングバッファーで再懸濁します。次に、セパレーターのポッセルプログラムに従って、8つの列を準備します。一度に1ミリリットルの細胞懸濁液を加えることによって細胞をカラムに通す。1ミリリットルのソーティングバッファーで、滅菌溶出プレート上でCD11b陽性細胞を溶出します。細胞を50ミリリットルのチューブにプールします。遠心分離し、ペレットを10ミリリットルの冷たいミクログリア培地で再懸濁します。CD11b陽性細胞をカウントします。細胞を冷たいミクログリア培地に再懸濁して、ミリリットルあたり650, 000〜700, 000細胞の最終濃度を得ます。懸濁液を細胞培養プレートに分注します。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。翌日、培地を予熱したミクログリア培地と交換し、一晩インキュベーションを繰り返します。このステップの前に細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に貪食アッセイを実行します。この表に従って、セルあたり50ビーズの比率でビーズの数を計算します。ビーズ混合物を調製する。チューブを摂氏37度の水浴中で1時間インキュベートする。10分ごとに渦を巻きます。各ウェルに、計算された量のビーズ溶液を加え、3時間インキュベートします。このアプローチを使用して、インターロイキン-1ベータ、インターフェロンガンマ、またはリポ多糖などの炎症誘発因子による刺激後にミクログリアの食作用活性を評価しました。6〜24時間の刺激後、蛍光Cy3ミクログリアビーズを共焦点顕微鏡で分析した。6時間後、ミクログリアはインターロイキン-1ベータとインターフェロンガンマ条件下でのみCy3ビーズを貪食し始める。24時間後、両方の種類の刺激でCy3蛍光が増加し、食作用活性の増加が強調されました。ミクログリア培養物の純度はフローサイトメトリーによって上昇し、選別後の細胞生存率の増加を示しました。フローサイトメトリーおよびRT-qPCR細胞集団マーカーを用いて、生後8日目にマウス脳からCD11b陽性細胞を選別する前後を分析した。これらの解析により、ミクログリアのCX3CR135、希突起膠細胞のO4またはOLIG2、ニューロンのNeuNまたはシナプトフィジン、星状細胞用のACSA-2またはGFAPなど、さまざまな脳細胞集団が区別されました。CD11b抗体を用いた細胞選別後、ミクログリアのみが得られた。カラムに懸濁液を添加しながら非常に穏やかにピペットでピペットを装着することは、目詰まりを防ぎ、機械的細胞死を避けるために重要です。この方法の後、ミクログリア刺激の効果を確認するために、西洋血液やLuminexなどのトランスクリプトームプロテオミクス、さらには免疫化学を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。...

新生仔ラットの脳組織の混合グリア細胞培養物から主要なミクログリアの分離

このビデオでは、磁気活性化細胞ソーティングを使用してマウスの子犬の脳からミクログリアを含むCD11b細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。脳組織をホモジナイズして単一細胞懸濁液を得ると、抗CD11b抗体でコーティングされたマイクロビーズとインキュベートした後、磁気カラムベースの分離によりCD11b+細胞集団を精製します。...

マウスの仔脳からのミクログリアの磁気分離

このビデオは、磁気細胞ソーティングを使用してマウス脳の脱髄病変からミクログリア細胞を抽出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、ミクログリア細胞を含む病変のある脳組織を解剖し、特定の酵素で組織を処理して単一細胞懸濁液を取得し、ミクログリア受容体特異的磁気ビーズを利用してミクログリア細胞を単離することを含みます。...

磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

ビデオは、新生児マウスの脳から細胞を分離して培養する方法を示しました。これには、脳の酵素的および機械的解離が含まれ、続いてニューロン成長因子を欠く成長培地で培養して、混合グリア集団が得られました。...

新生児マウス脳からの混合グリア細胞培養物の取得

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。...

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。...

強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット...

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。...

脱髄の動物モデルにおける磁気活性化細胞選別によるマウス原発性ミクログリアの単離

私たちは、磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して、マウスの視床下部(または同等の小さな脳構造)からミクログリア細胞を比較的短時間で単離するためのプロトコルについて説明します。MACSで選別された視床下部ミクログリアは、 ex vivo 分析に使用でき、 in vitro...

磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離  

学ぶ新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離法。CD11bマイクロビーズを用いた細胞培養技術で、in vivoに近い条件下で高純度・高生存率の初代細胞を得られ、神経炎症研究や貪食活性評価に応用できます。

初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離

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