ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量
2021年11月4日
この記事では、熱不活性化に基づくサンプル調製方法を、後分析による分解を回避する内因性ペプチドを保存し、続いて同位体標識とLC-MSを使用した相対定量を行う方法について説明します。
ここでは、自然な細胞内ペプチドを保存し、細胞や組織の分解を避け、続いて同位体標識を用いたペプチドの相対的な定量化を行うプロテアーゼの速い熱不活性化に基づく指導方法について述べた。このラベリング方法には非常に多くの利点があります。この試薬は市販されており、安価で化学的に安定であり、1つの血清中で最大5個のサンプルの分析が可能です。
15%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMで15センチメートルの皿でヒト神経芽細胞細胞を培養することから始めます。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で細胞を維持します。PBSで細胞を2回洗い、PBSを10ミリリットル加え、細胞を掻き取り、15ミリリットルのチューブに集めます。
Gの800倍の細胞を5分間遠心し、上清を取り除きます。ペレットを80°Cの超精製脱イオン水の1ミリリットルで再懸濁し、チューブの内容物を2ミリリットルマイクロフュージチューブに移します。ゼブラフィッシュの熱不活性化後、2ミリリットルマイクロフュージチューブに脳全体を収集し、分析までマイナス80°Cで凍結します。
80°Cの超精製脱イオン水の1ミリリットルで組織サンプルを再中断し、1秒間の30パルスを使用してプローブで超音波処理します。細胞のlysateまたはホモジネート組織を摂氏80度で20分間インキュベートし、氷の上で10〜30分間冷却します。1ミリリットルのサンプル容量ごとに1モル塩酸ストック溶液10マイクロリットルを加えます。
20秒間渦を混ぜて混ぜ、氷の上で15分間インキュベートします。細胞のリセートまたはホモゲネート組織を摂氏4度で12,000倍のGで15分間遠心する。低結合タンパク質マイクロ遠心チューブに上清を収集し、マイナス80°Cで保存します。
水と遠心分離機を2,300倍Gで3分間洗浄し、その後、限外濾過装置から水を捨てます。上清を予め洗浄した10キロダルトンカットオフフィルターにピペットし、冷蔵遠心分離機で4°Cで回転します。サンプルの pH を確認します。
100%アセトニトリルの1ミリリットルでカラムを平衡化し、0.1%トリフルオロ酢酸で5%アセトニトリルの1ミリリットルで洗浄します。カラムにサンプルの完全な体積をロードし、0.1%トリフルオロ酢酸で5%アセトニトリルの1ミリリットルでカラムを洗浄します。0.15%トリフルオロ酢酸を有する1%アセトニトリルの1.8ミリリットルのカラムから、タンパク質の低結合マイクロ遠心チューブにペプチドを溶出する。
サンプルを真空遠心分離機で30°Cで完全に乾燥させ、ディスプレイ上の濃度時間を監視します。サンプルをマイナス80°Cで保存します。ペプチドサンプルを100~200マイクロリットルの超精製水とピペット2.5マイクロリットルの標準ペプチド濃度とサンプルを白色96ウェルプレートに再懸濁します。
0.2モルリン酸緩衝液25マイクロリットル、蛍光アミン12.5マイクロリットルを加えます。軌道回転器で1分間、穏やかに均質化します。次に、110マイクロリットルの水を加えた後、反応を止めます。
分光フルオロメーターの設定を調整し、プレートを読みます。1/10体積の1/10分の1のモルトリメチルアンモニウム臭化物を各ペプチドサンプルに25マイクログラムまで添加します。必要に応じて、pHが5~8個であることを確認し、塩酸または水酸化ナトリウムで調整します。
非重水素、重水素、または炭素13重水素の4マイクロリットルを加える。渦をかいて5秒間混ぜます。4マイクロリットルのシアンボロヒドリドナトリウムまたは重水素化ナトリウムをペプチドサンプルに加えます。
その後、渦をかいて5秒間サンプルを混ぜます。ペプチドサンプルをヒュームフードに室温で2時間インキュベートし、30分ごとに渦を出します。非重水素、重水素、または炭素-13の加加を繰り返し、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ナトリウムまたはシアノ水素化ナトリウム、または各添加後にボルテックスする。
室温で一晩ヒュームフードにサンプルをインキュベートします。16マイクロリットルの重炭酸アンモニウムを加え、渦を混ぜて混ぜます。サンプルを氷の上に置きます。
さらに5秒間、5%のギ酸と渦の8マイクロリットルを加えます。ペプチドサンプルを組み合わせ、2つと4の間でpHを調整し、次に前述のようにアセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を使用して逆相クリーンアップカラム上の結合サンプルを脱塩する。サンプルを真空遠心分離機で30°Cで完全に乾燥させ、マイナス20度で保管します。
標識されたペプチドは、質量スペクトルを用いて観察される。赤い矢印は、2つの異なるサンプルS1とS2の比較のために、L1およびL5の2つの同位体形態で標識された異なるペプチドのピーク対の存在を示す。3つの異なるサンプルに存在するペプチドの質量スペクトルを、それぞれL1、L3、およびL5タグで標識したS1、S2、およびS3が示されている。
4重化標識が行われました。対照試料S1及びS3をそれぞれL1及びL3で標識し、2つの実験サンプルと比較して、L2で標識したS2及びS4と、有意差 L4.No 有意な差が認められた。同位体標識は、所与のプロテアーゼまたはペプチダーゼに対するインビトロの製品の基質を示すために使用された。
神経リシン酵素の存在下で変化しないペプチドをここに示す。酵素の存在下で消失または減少するペプチドは基質であり、増加するものは製品とみなされます。この図は、3つの異なる形式のタグでラベル付けされたデータベース検索エンジンによって実行されるペプチド配列を同定する例である。
定義する前に、固い酸性化によって引き起こされるペプチド結合を壊さないように、サンプルが完全に冷却されていることを確認してください。また、限外ろ過装置の洗浄も不可欠です。質量分析法は、ペプチド質の基質を同定することにより、異なる実験条件間でペプチドを定量化し、分析研究に優れた方法です。
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概要
この記事では、熱不活性化を通じて内因性ペプチドを保存し、死後分解を防ぐ方法について説明しています。また、同位体ラベリングとLC-MSを使用した相対的定量技術についても詳しく説明しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- プロテオミクス
背景
- 内因性ペプチドは細胞プロセスの理解に重要です。
- 死後分解はペプチド分析を損なう可能性があります。
- 熱不活性化はこれらのペプチドを保存する実行可能な方法です。
- 同位体ラベリングにより、ペプチドの正確な定量が可能になります。
研究の目的
- ペプチド保存のための信頼できる方法を開発する。
- ペプチド定量の精度を高める。
- 市販の試薬を使用した費用対効果の高いアプローチを提供する。
使用された方法
- ペプチドを保存するためのプロテアーゼの熱不活性化。
- 同位体ラベリングを用いた相対的定量。
- ペプチド分析のためのLC-MS。
- DMEMでのヒト神経芽腫細胞の培養。
主な結果
- この方法は効果的に内因性ペプチドを保存します。
- 同位体ラベリングにより、複数のサンプルの分析が可能になります。
- 市販の試薬は効果的で安定しています。
- この技術は様々な生物学的サンプルに適用可能です。
結論
- この方法はペプチド分析のための堅牢なアプローチを提供します。
- 熱不活性化はペプチドの完全性を保存する重要なステップです。
- 将来の研究では、より広範な応用のためにこの方法を基に構築することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust peptidomics workflows are essential for identifying and quantifying endogenous peptides as biomarkers or mechanistic indicators in disease and stress models. The described protocol leverages heat inactivation and reductive methylation-based isotopic labeling to enable multiplexed, quantitative LC-MS analysis of peptides from complex biological samples. This approach supports high-confidence target validation and comparative studies across experimental conditions, directly impacting early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables preservation and quantitation of native peptides for mechanistic pathway interrogation.
- Supports identification of peptide biomarkers relevant to disease or environmental stress.
- Facilitates functional target validation by distinguishing substrate and product peptides in enzyme assays.
- Improves predictive confidence in biological models by minimizing post-sampling degradation artifacts.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible peptide quantitation across multiple samples.
- Enables multiplexed analysis of up to five samples in a single LC-MS run, increasing throughput.
- Delivers quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative studies.
- Supports assay scalability and platform reuse with commercially available, stable reagents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns peptide quantitation with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving endogenous peptide profiles.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative peptide changes in response to interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable peptide quantitation for hypothesis testing, target validation, and biomarker identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of proteolytic pathways and peptide dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, multiplexed quantitative data for comparative analysis.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based readouts for robust statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Facilitates alignment of peptide biomarkers with disease models and intervention studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across diverse biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in peptide-centric studies.
- Operational Value: Streamlines sample preparation and quantitation with cost-effective, stable reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling high-throughput, quantitative peptide analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and biomarkers for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sample handling, heat inactivation, and mass spectrometry-based quantitation.
- Needs access to LC-MS instrumentation and validated isotopic labeling reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and labeling protocols.
- Adaptable to various cell and tissue models with attention to protease activity and peptide stability.
- Careful control of pH and temperature is critical to prevent peptide bond cleavage and ensure data integrity.
