Name: DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶDNAカーテン法によるEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング。転写因子の相分離をリアルタイムで可視化し、DNAモチーフ数と凝縮体形成の関係を解明。ユーイング肉腫の発がん機構理解に貢献する手法です。

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<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
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<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
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著者には利益相反はありません。

単一分子アプローチは反応系の内容に非常に敏感であるため、DNAカーテン実験中のすべての材料と溶液、特にセクション1と2で調製された脂質とセクション5で使用されるバッファーの品質を確保するために特別な努力を払う必要があります。バッファーの調製には高純度の試薬を使用し、単一分子アッセイ用にバッファーは新たに調製する必要があります。
500 nM mCherry標識EWS-FLI1をチャンバーに流すと、25× GGAA配列を含むラムダDNAにいくつかのマゼンタプンクタが現れました。ブランクバッファーで10分間洗浄した後でも、DNA全体にマゼンタシグナルの連続した非特異的分布があったことに注意してください(図1B、C)。興味深いことに、EWS-FLI1分子は、バッファーフローなしで10分間のインキュベーション中にDNA上で再配列され、いくつかの点状突起に集められました(図1D、E)。これらの点状突起の1つ...

転写調節は、生細胞における正確な遺伝子発現のための重要なステップです。染色体修飾、転写因子(TF)、ノンコーディングRNAなどの多くの要因が、この複雑なプロセスに関与しています1,2,3。これらの因子の中で、TFは、プロモーターまたはエンハンサーとして知られる特定のDNA配列を認識して結合し、続いて転写を活性化または抑制するために他の機能タンパク質を動員することにより、転写調節の特異性に寄与する4,5,6,7。これらのTFがヒトゲノム内の標的部位を検索し、ヒストンおよび非ヒストンDNA結合タンパク質でコーティングされたDNAと相互作用する方法は、何十年にもわたって科学者を困惑させてきました。過去数年間で、TFの標的検索メカニズムに関するいくつかの古典的なモデルが構築され、TFがDNA鎖に沿ってどのように「スライド」、「ホップ」、「ジャンプ」、または「セグメント間移動」するかを説明してきました8、9、10、11。これらのモデルは、単一のTF分子のDNAに対する検索挙動に焦点を当てています。しかし、最近の研究では、一部のTFは、核内で単独で、またはメディエーター複合体12とともに液-液相分離(LLPS)を受けることが示されています。観察されたTFの液滴は、プロモーターまたはエンハンサー領域に関連しており、転写および三次元ゲノムにおける生体分子凝縮物形成の役割を強調している13、14、15。これらの生体分子凝縮物は、in vivoおよびin vitroで膜欠損コンパートメントに結合しています。それらはLLPSを介して形成され、モジュール式の生体高分子とタンパク質の天然変性領域(IDR)が多価相互作用の2つの主要な原動力です16。したがって、TFはDNAを検索するだけでなく、これらの縮合物内で相乗的に機能します4,17,18。今日まで、DNA上のこれらの転写縮合物の生物物理学的特性は不明のままです。
そこで本研究では、1分子法であるDNAカーテンを適用して、TFがDNA上で形成する転写凝縮物の形成と動態をin vitroで直接イメージングすることを目的としていました。タンパク質とDNAの相互作用を研究するためのハイスループットインビトロイメージングプラットフォームであるDNA Curtainsは、DNA修復19、20、21、ターゲットサーチ22、およびLLPS17、23、24に適用されています。DNAカーテンのフローセルは、ビオチン化脂質二重層でコーティングされており、表面を不動態化し、生体分子を表面に拡散させます。ナノ加工されたジグザグパターンは、DNAの動きを制限します。ビオチン化Lambda DNA基質は、バリアエッジに沿って整列し、配向したバッファー流によって引き伸ばすことができます。すべての分子の同じ開始配列と終了配列により、DNA上のタンパク質の追跡が可能になり、結合イベントの位置分布が記述されます25,26。さらに、DNAカーテンと全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)の組み合わせにより、バックグラウンドノイズを最小限に抑え、単一分子レベルでシグナルを検出できます。したがって、DNAカーテンは、DNAモチーフ上の転写凝縮物形成のダイナミクスを調査するための有望な方法である可能性があります。本論文では、染色体転座によって生成されたFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリー融合癌タンパク質EWS-FLI1の例について説明します。EWS-FLI1分子がDNA上でLLPを受ける様子を観察するためのDNAカーテン実験では×EWS-FLI1分子が27-の結合配列である25GGAAを含むラムダDNAをDNA基質として使用しました。本稿では、実験プロトコルとデータ解析手法について詳細に論じている。

<table><tbody><tr><td>488 nm ダイオード励起固体レーザー</td><td>Coherent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 nm ダイオード励起固体レーザー</td><td>Coherent</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>ΣA7030</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>コーティングElectra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>導電性保護コーティング</td></tr>デ<tr><td>オキシリボヌクレアーゼIウシ</td><td>グマ</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>アバンティ</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Σ</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>ラムダ DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>ラムダ パッキン エキス</td><td>震源</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Σ</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>ニコン倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM ブロス</td><td>シグマ</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 ドープ</td><td>アバンティ</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>アムレスコ</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K、ETHYL LACTATE 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K、ANISOLE 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Scientific CMOSカメラ</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>シリカガラススライド</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6方向注射弁</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>ddH2O</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>で希釈 Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 ヨウ化物 (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>DMSO で希釈</td></tr></tbody></table>

dna上に集合したews-fli1凝縮体の1分子イメージング

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

染色体転座に起因する融合遺伝子は、多くの固形腫瘍または白血病で発見されています。融合癌タンパク質のFUS/EWS/TAF15(FET)ファミリーに属するEWS-FLI1は、ユーイング肉腫において最も頻繁に関与する融合遺伝子の1つです。これらのFETファミリー融合タンパク質は、通常、N末端にFETタンパク質の低複雑性ドメイン(LCD)を、C末端にDNA結合ドメイン(DBD)を持っています。EWS-FLI1は、LCD-LCDおよびLCD-DBD相互作用により、その標的結合遺伝子座で生体分子凝縮物を形成することが確認されており、これらの縮合物はRNAポリメラーゼIIを動員して遺伝子転写を増強することができます。しかし、これらの縮合物が結合部位でどのように組み立てられるかは不明である。最近、EWS-FLI1凝縮物のこれらの組み立てプロセスを視覚化するために、単一分子生物物理学的方法であるDNAカーテンが適用されました。ここでは、標的DNA上に集合する生体分子凝縮物の研究におけるDNAカーテンの適用について、詳細な実験プロトコルとデータ解析アプローチについて説明します。

DNAカーテンの概略図を図1A、図1B、および図1Dに示します。GGAAの25の途切れのないリピートを含むクローニングされた標的配列は、ユーイング肉腫のNORB1プロモーターに見られます。この標的配列は、EWS-FLI1の募集にとって非常に重要です28。EWS-FLI1分子は、561 nmレーザーで得られたmCherry標識EWS-FLI1シグナルを検出することによって視覚化されました(図1Cおよび図1E)。DNAカーテン実験をセットアップした後、DNA基質の25×GGAAサイトでのEWS-FLI1の生体分子凝縮物のin vitro形成を直接視覚化することができました(図1B-E</s...

ここでは、1分子イメージング法であるDNAカーテンを使用して、DNA上に集合するEWS-FLI1凝縮物の生物物理学的メカニズムを研究します。

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

DNA上の転写因子の相分離を観察するための単一分子アッセイを提供します この技術により、転写因子がDNA上に液滴として集合する動的なプロセスをリアルタイムで実現できます。EWS-FL1は、ユーイング肉腫腫瘍形成において最も頻繁に関与する融合遺伝子の1つです。私たちの研究は、DNAモチーフ数と、腫瘍細胞における不毛な遺伝子転写に関連するEWS-FL1凝縮物形成との関係を特定し、予後に役立つ可能性があります。この方法は、P53やMED1などの転写縮合物または複合体をin vitroで研究するために適用できます。DNAカーテン実験用のジグザグナノ加工バリアを備えたフローセルを調製するには、入力チューブと出力チューブを正しい方向に接続します。次に、2つの3ミリリットルのシリンジを使用して2.5ミリリットルの脂質バッファーでフローセルを洗浄し、フローセルに気泡がないことを確認します。シリンジを出力から取り出し、各注射の間に5分間のインキュベーションを行いながら、1ミリリットルのリポソーム溶液を3回注入する。治癒のために、フローセルを2.5ミリリットルの脂質バッファーでゆっくりと再洗浄し、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション中に、テキスト原稿に記載されているようにBSAバッファーを調製します。次に、30分間の治癒後、フローセルを出力側から2.5ミリリットルのBSAバッファーで洗浄します。次に、800マイクロリットルのストレプトアビジンバッファーを入力側からフローセルに2段階で注入し、各ステップの後に10分間インキュベートします。次に、フローセルを2.5ミリリットルのBSAバッファーで洗浄して、遊離ストレプトアビジン分子をすべて除去します。次に、ビオチンラムダDNAをBSAバッファーを用いてクローニングモチーフで希釈し、5分間隔で4回ゆっくりと注入します。注入中に、科学的な相補金属酸化物半導体システムの顕微鏡の電源を入れます。次に、チューブを10ミリリットルの二重蒸留水で洗浄し、プリズムとチューブコネクタを水、2%液体キュベットクリーナー、および99%エタノールですすいでください。次に、少なくとも20ミリリットルのイメージングバッファーを30ミリリットルのシリンジに引き込みます。顕微鏡ステージにフローセルを設置し、マイクロ流体システムに接続します。毎分0.03ミリリットルの流速を使用して、DNA分子をバリアに10分間洗い流します。次に、マイクロ流体システムのスイッチを切り、30分間インキュベートします。流れが止まり、DNAが横方向に拡散します。DNAカーテン上でEWS-FLI1凝縮形成を画像化するには、イメージングソフトウェアを開き、明視野下で9つのジグザグパターンの位置を見つけてマークします。次に、毎分0.2ミリリットルでフローをオンにして、二本鎖DNA色素でDNAを10分間染色します。次に、mCherry EWS-FLI1タンパク質をイメージングバッファーで100マイクロリットル中100ナノモルの濃度で希釈します。次に、タンパク質サンプルを100マイクロリットルのガラスシリンジでバルブに通し、流量を毎分0.4ミリリットルに変更します。488ナノメートルのレーザーをオンにした後、各領域を事前にスキャンしてDNA分布状態を確認し、DNA分子が均等に分布する領域を選択します。次に、レーザー出力を10ナノメートルレーザーの場合は488%、20ナノメートルレーザーの場合は561%に設定します。そして、パワーメーターを使用して、プリズムの近くで実際のレーザーパワーを測定します。488ナノメートルレーザーと561ナノメートルレーザーの両方で2秒間隔で画像の取得を開始します。次に、バルブを手動モードから注入モードに変更して、イメージングバッファーが60秒後にタンパク質サンプルをフローセルにフラッシュできるようにします。遊離したEWS-FLI1を除去するには、561ナノメートルのレーザーのみをオンにして、フローセルをイメージングバッファーで5分間洗浄し続けます。その後、流れを止め、摂氏37度で10分間インキュベートします。10分後、毎分0.4ミリリットルでフローをオンにして、DNAを伸長させ、異なるフレーム間で2秒間隔で画像を取得して、EWS-FLI1凝縮物形成のハイスループットデータを取得します。EWS-FLI1分子は、561ナノメートルレーザーで得られたmCherry標識EWS-FLI1シグナルを検出することにより可視化した。DNA基質中の25 GGAAリピートの部位におけるEWS-FLI1凝縮物のin vitro形成を直接可視化することができた。DNAカーテンに使用されたmCherry EWS-FLI1の特異性は、25 GGAAリピートを別々に含む場合と使用しない場合のDNAテンプレートを使用した電気泳動移動度シフトアッセイによって確認されました。EWS-FLI1濃度を20ナノモルから500ナノモルに滴定すると、EWS-FLI1強度は劇的に増加しました。一方、タンパク質がGGAAリピートをカバーするように飽和している場合、FLI 1 DBD強度の変化はごくわずかであり、EWS-FLI1がDNA上に凝縮物を形成したことが示唆されました。リポソームとDNAがフローセル上に均等に分布できるように、注射は非常に遅くて柔らかくなければなりません。MSAを実行して、精製された転写因子がin vitroで標的配列と特異的に結合することを確認することが重要です。この手法により、凝縮物が転写因子の標的検索を容易にするかどうか、およびその転写への影響を調べることができます。

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