Name: ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング法。単一軸索レベルで発生中の脳を観察し、神経回路の細胞生物学的基盤を解明する。他の神経回路研究にも応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、外植文化に関するアドバイスをしてくれたN. ÖzelとR. Hiesingerに感謝します。M. ワーグナー 二光子顕微鏡の技術的支援;トランスジェニックハエを生成するためのD.J.ルギンブール;D.フリードマンフィジーソフトウェア分析の提案;Y. Ge 飛行作業の援助のため;C. McLaughlin と K.K.L. Wong が原稿に関するコメントを募集しています。L.L.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。この研究は、国立衛生研究所の助成金1K99DC01883001(T.L.へ)とR01-DC005982(L.L.へ)によって支援されました。

1. 試薬の調製
メモ: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温 (20 ~ 25 °C) で実行されます。
<ol><li>タイムラプスイメージング中に外植体を固定化するための培養皿を準備するために、厚さ0.5cmのシルガード(使用前に2つの液体成分を10:1の比率で十分に混合する)を60mm×15mmのシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間硬化させる(図2A、以下のテキストではシルガードプレートと呼ぶ)。</li>
	<li>このプレートに外植体を固定するためのマイクロピンを準備するには、一対の鉗子を使用して、鋭利な端を片側に揃えたテープに複数のマイクロピンを貼り付けます(図2B)。一対のはさみを使用して、マイクロピンの鋭い端から約2mmを切り取ります(図2B ́)。鉗子を使用して切断したマイクロピンを保持し、既製のシルガードプレートのシルガード層に挿入します(図2C)。2つのマイクロピンを使用して、1つの外植体を固定化します。</li>
	<li>ブラシを使用して、hsFLP、小石-GAL4 / +の1時間以内に蛹を形成する白い蛹を収集します。UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8遺伝子型およびそれらを新しいバイアルに移す。37°Cの水浴中で40分間のヒートショックにより、ランダム型からまばらなORNクローンを誘導した。ヒートショック後、バイアル瓶を25°Cで30時間入れ、蛹形成後30時間で熟成させた蛹(APF)を生じた。</li>
	<li>外植用培養液を調製するには、500mLのシュナイダーショウ ジョウバエ 培地に5mLのペニシリン-ストレプトマイシン(10,000U/mL)を加える。培地をろ過し、50 mLの円錐形チューブに45 mLのアリコートを作ります。培地は、4°Cで1〜2ヶ月間保存することができる。</li>
	<li>イメージング当日、シュナイダーの ショウジョウバエ 培地45 mLのチューブを1本取り、5 mLのウシ胎児血清(10% v/v)、125 μLの4 mg/mLヒトインスリンストック溶液(10 μg/mL最終濃度)、50 μLの1 mg/mLエタノールに溶解した20-ヒドロキシエクジソンストック溶液(最終濃度1 μg/mL)を加える。よく混ぜ合わせ、15 mL のフル培地を新しい 50 mL の円錐形チューブに移します。残りのフル培地は、4°Cで1週間保存することができます。ウシ胎児血清、ヒトインスリンストック溶液および20−ヒドロキシエクジソンストック溶液を分取し、−20°Cで保存した。</li>
	<li>液面下の酸素ボンベから滅菌した5 mLピペットチップを通して酸素気泡を1 bubble/sの速度で20〜30分間ポンピングすることによって、15 mLのフル培地を酸素化します。このプロセス中にチューブの開口部を覆うためにパラフィンフィルムを使用してください。</li>
	<li>解剖ウェル表面およびシルガードプレート(シルガード層にマイクロピンを挿入し、ステップA1およびA2で調製)を70%エタノールで滅菌する。使用前に乾かしてください。</li>
</ol>2. エクスプラント解剖
<ol><li>ブラシを使用して、30時間APF(蛹形成後30時間)の蛹を紙の組織に移し、蛹の外表面を5分間乾燥させる。</li>
	<li>両面テープをスライドガラスの上に置きます。乾燥した蛹を背側を上に向けてテープの粘着性のある面に慎重に取り付けます。蛹をブラシで軽く押して、蛹の腹側がテープにしっかりと付着するようにします(図3A)。蛹を傷つけないでください。</li>
	<li>一対の鉗子を使用して、頭部の背側を覆う茶色の蛹のケースを取り除きます(図3A、B)。茶色の蛹のケースと蛹の間に鉗子の鋭い先端を横から挿入し、茶色の蛹のケースを蛹の後端までの線を通して慎重に壊します(図3B、C)。茶色の蛹のケースを開けます。一対の鉗子を使用して蛹を優しく保持し、1mLの酸素化された完全培地でよく解剖する。浮遊する蛹を中程度の表面に沈めて、井戸の底に沈めるのを助けます(図3D)。 注:鉗子で蛹を傷つけるのを防ぐために、茶色の蛹のケースの中に鉗子の先端を深く挿入しすぎないでください。</li>
	<li>蛹からアンテナ脳外植体を解剖するには、鉗子を使用して片手で蛹を優しく保持し、もう一方の手で蛹の後側から小さな穴を切るために一対のマイクロハサミを使用します(図3E)。この小さな穴は、蛹内の高圧を解放します。</li>
	<li>蛹の腹側正中線を穴から頸部(頭部と胸郭をつなぐ狭い構造)までミクロはさみで切り込みます(図3F)。次に、頸部の周囲を切り裂き、頭部を蛹の体から剥離する(図3G)。体を取り外し、別の井戸に入れます。 注:脳を圧迫する可能性のある蛹の背側/腹側から直接首を切らないでください。</li>
	<li>脳の背側を覆う透明なキューティクルを切ります(図3H)。これは、脳の上に脂肪体を露出させます.網膜とアンテナが取り付けられるキューティクルを保管してください。脳の腹側に同じ手順を繰り返します. メモ:はさみの刃をキューティクルの下に深く差し込みすぎると、アンテナと脳をつなぐ触角神経が切断されますので、挿入しないでください(図3H')。</li>
	<li>P10ピペットを使用して、頭部の背側と腹側の開放領域に向かって培地をピペッティングすることにより、脳とアンテナを覆う脂肪体を優しく洗い流します(図3I)。 注:脳をキューティクルから簡単に切り離すことができるので、培地をピペッティングするときは非常に穏やかにしてください。このステップ中にすべての脂肪体が除去されていることを確認してください。ORN軸索の発達の停止は、脂肪体がよく洗浄されなかったときに観察されたが、これはおそらく培地からの酸素アクセスが悪いためである。</li>
	<li>両側ORN軸索またはORN軸索とPN樹状突起標的との相互作用を研究するために、この段階で1つまたは2つの触角神経をマイクロハサミで切断する8 (図3J)。はさみの刃をキューティクルと脳の間に慎重に置き、関心のある触角神経を切断します。</li>
	<li>解剖した外植体をシルガードプレートに移すには、酸素化された完全培地(〜200μL)の液滴をシルガード表面に置きます。幅200 μLのチップピペットチップの内面を、脂肪体を数回ピペッティングして、解剖した幹からの脂肪体でコーティングし(ステップ1.6)、移送中に外植体がピペットチップに付着するのを防ぎます。次に、この幅の広いチップピペットチップを使用して、エクスプラントを解剖ウェルから培養プレート上の培地液滴に移す(図3K)。</li>
	<li>鉗子を使用して、外植体を2つの光学ローブのシルガード層に固定します(図3L)。シルガードプレートをイメージングステーションに慎重に置き、テープでプレートを固定します。P1000ピペットを使用して、酸素化フル培地10mLをシルガードプレートにゆっくりと加えます。 注:シルガードプレートに培地を添加するときは、外植体を混乱させないでください。</li>
</ol>3. 2光子顕微鏡によるライブイメージング
<ol><li>タイムラプスイメージングを実行するには、2光子顕微鏡、Ti:サファイアレーザー、20倍の水浸対物レンズ(1.0 NA)、およびイメージングソフトウェアを使用します。GFP タンパク質のイメージングには、920 nm の励起波長を使用します。ピクセルの滞留時間を10μsに調整します。</li>
	<li>外植体がほぼ対物レンズの下になるようにイメージングステーションの位置を調整します。イメージング前にレンズを滅菌するために70%エタノールを使用してください。外植体に近い培地の下で目標をゆっくりと下げます。対物レンズに気泡がないか確認してください。<ol>
<li>その場合は、目標を媒体の上に持ち上げ、バブルがなくなるまでこれを繰り返します。接眼レンズを使用して外植体を見つけ、フィールド内の1つの外植体の中心に配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タイムラプスイメージング用にまばらにラベル付けされたいくつかのORNを有する外植体を確実にするために、毎回〜10個の外植体を解剖し、培養プレート上のy軸上に位置合わせする。Y軸に沿って対物レンズを動かしてすべての外植体をスクリーニングし、いくつかの単一のORN軸索がイメージングのために触角葉に到達したばかりの外植体を選択します(図4A)。<ol>
<li>触角葉は、その楕円形と、それを一周し始めているORN軸索によって認識する。xy 平面内の約 150 μm x 150 μm の領域を画像化します (20 倍の対物レンズで 3 倍ズーム)。2つの触角ローブの境界を推定し、それらを撮像領域の中心に配置する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スキャンの下部セクションと上部セクションを定義して、z 軸に沿った初期イメージング領域を選択します。Z軸に沿ってイメージング領域を設定します。ORN軸索信号を有する最深部を最初のイメージングセッションとして設定し、セッションを100μm上(より表面側)を最後のイメージングセッションとして設定します(図4B)。 注:これにより、ORN軸索の上部(表層側)にいくつかの切片が残り、培養中の脳の成長によるORN軸索の画像領域外への上方へのシフトが回避される。<ol>
<li>2μm間隔での画像。イメージングソフトウェアを使用して、20分ごとの周波数で自動イメージングスキャンを設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最初の4時間の撮像後に、撮像領域をz軸に沿って20μm上方に、16時間撮像後にz軸に沿って別の20μm上方にシフトする。これは、イメージングソフトウェアでスクリプトと異なるzスタックを設定することによって実現できます。</li>
	<li>固定前に外植体を画像化後(最大24時間 エクスビボ)のさらなる期間培養し、ニューロピルマーカーであるN−カドヘリンで染色し、糸球体による各単一ORNの遺伝的同一性を明らかにすることを標的とする。</li>
</ol>4. 画像処理
<ol><li>フィジーのソフトウェアを使用して各時点で撮影されたセクションシリーズのzスタック画像を処理するには、画像セクションシリーズを開き、[ 画像]|スタック|Z プロジェクト [/]。</li>
	<li>培養中のサンプルの横方向のドリフトを修正するには、フィジーに TurboRegプラグイン をインストールします。<ol>
<li>Z スタック イメージ シリーズと、そのシリーズから 1 つの z スタック イメージを開きます。 プラグインを開く |参加登録|ターボレッグ。</li>
		<li>「ソース」で z スタック・イメージ系列を選択し、「ターゲット・イメージ」で単一の z スタック・イメージを選択|翻訳。バッチボタンをクリックして、開いたzスタック画像シリーズからすべての画像を登録します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像化されたサンプルの有用性を最大限に引き出すために、3D画像セクションに続くzスタック画像から、互いに近傍のまばらにラベル付けされた単一の軸索を分離する。<ol>
<li>同じ画像内のいくつかの軸索から単一のORN軸索を抽出するには、画像セクションシリーズを開き、[プラグイン]|セグメンテーション|セグメンテーションエディタ [/]。ブラシツールを選択し、各画像セクションの「+」または「-」ボタンを選択して、セグメンテーションエディタの作業ウィンドウで関心のあるORN軸索をマスクします。</li>
		<li>[プロセス|]をクリックします。画像計算機 [/].画像1の「画像X」、操作の「乗算」、画像2の「画像X.ラベル」[/]を選択します。これにより、関心のある軸索のみを含む新しい画像系列ファイルが生成されます。ステップ 4.1 を実行して、z スタック・イメージを処理します。すべてのタイム ポイントに対してこの手順を繰り返して、時系列イメージ ファイルを生成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>同じ画像から異なる軸索を擬似色化するために、まずステップ4.3を実行して、各軸索の時系列画像ファイルを別々に生成する。同じ生データ画像から異なる単一軸索の時系列画像ファイルを開きます。 画像|をクリックします。カラー|チャンネルをマージします。異なるカラーチャンネルで異なる時系列画像ファイルを選択し、「 OK」をクリックします。</li>
</ol>

<ol><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li>
<li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm%3A+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721(2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+cell+in+its+native+state%3A+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li>
<li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li>
<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
<li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ショウジョウバエのアンテナ脳外植体は、嗅覚回路の正常な標的を保持している。我々は、開発がin vivoと比較して2倍遅いex vivoであることに気付きました。外植系は、6種類のORNを宿主とする上顎触診を保持しないことに留意されたい。正常な発達がエクスビボで反復されることを確実にするために、外植体解剖中に触角神経の伸張を避ける必要がある。エクスビボ培養細菌増殖の間、通常、嗅覚回路の発達停止を引き起こす。そのため、イメージング前に培養皿やピンを徹底的に滅菌し、イメージング室を清潔で隔離しておくことが大切です。
このエクスプラントは、タイムラプスイメージングに基づく長期的な2光子顕微鏡法をサポートします。単一ORNのまばらな標識のために新しく開発されたレポーターと組み合わせることで、外植システムは単一の軸索末端からの高解像度イメージングを可能にします。このシステムは、嗅覚回路アセンブリ8の動的プロセスを支える細胞生物学的メカニズムを研究するのに強力...

ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。100年以上にわたり、神経科学者は、神経突起が中間および最終標的に向かって非常に正確にどのように拡張するかを理解しようとしてきました。その結果、彼らはニューロンプロセスを発達させるためのガイダンス手がかりをコードする重要な遺伝子を同定した1。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、嗅覚受容体ニューロン(ORN、一次感覚ニューロン)がステレオタイプなサイズ、形状、相対位置を持つ50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の2次突起ニューロン(PN)の樹状突起とシナプス結合を形成し、それぞれが樹状突起を50個の糸球体2 の1つに送信するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供します(図1A).したがって、フライ嗅覚系におけるシナプス(糸球体)分解能で変異表現型を同定することは比較的容易である。これにより、嗅覚回路アセンブリ3を調節する重要な遺伝子の発見につながった。
フライ嗅覚回路の組み立ては、時間的および空間的に調整された発生プロセスに依存する3。ORNとPNは、配線の特異性のためにプログラムを設定する別個のセル運命を獲得します。次に、PNデンドライトが触角ローブを予めパターン化する(図1B)。その後、ORNの軸索は同側触角葉を周回し、脳の正中線を横切って対側触角葉に到達する。続いて、ORN軸索は、イプシ側および対側触角葉の両方に侵入し、特定の糸球体におけるパートナーPNの樹状突起とシナプスを形成する。嗅覚回路アセンブリのためのこの粗いモデルは、開発中の中間時点からの固定サンプルの特性評価に基づいて提案された。時間分解能が低く、固定組織からの発生全体にわたって同じニューロンプロセスに従うことができないため、回路アセンブリプロセスの機構的理解が制限されます。
蛹のケース内で触角葉が不透明な脂肪体に囲まれている場合、配線プロセスは蛹期の前半に起こるため、生体内で生きている画像ORNおよびPNプロセスを行うことは技術的に困難です。したがって、無傷の蛹から発達中の嗅覚回路を直接画像化することは不可能である。エクスビボで培養された解剖された組織は、組織の不透明度を回避することができ、神経発達の研究に首尾よく使用されている4、5、6。同様のエクスビボ外植体培養戦略を使用して、蛹脳内のニューロン配線を研究することの課題は、それが培養条件下で標的化される正確なニューロンを反復するかどうかである。フライアイ-脳複合体7の既報のエクスビボ培養条件に基づいて、蛹脳全体、アンテナ、および接続する触角神経をそのまま含む外植体が最近開発され、嗅覚回路の正確な標的を保持し、20分ごとの頻度で最大24時間の2光子顕微鏡ベースのライブイメージングに供することができる8.ここでは、外植体培養および画像化の詳細なプロトコールが説明される。外植システムは、中枢脳における嗅覚回路および潜在的に他の回路の集合を研究するための強力な方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>20-ヒドロキシエクジソン</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>カメレオン Ti:サファイアレーザー</td><td>コヒーレント</td><td>コヒーレント MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>ヒトインスリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>プレーリー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>酸素ボンベ</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>シュナイダー's ショウジョウバエ Medium</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 シリコーンエラストマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>2光子顕微鏡</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浸対物レンズ (20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

〜ニューロンは正確に相互接続され、脳の適切な機能に不可欠な回路を形成します。 ショウジョウバエ の嗅覚系は、触角および上顎触診からの50種類の嗅覚受容体ニューロン(ORN)が軸索を触角葉の50個の識別可能な糸球体に投影し、50種類の二次突起ニューロン(PN)からの樹状突起とのシナプス接続を形成するため、このプロセスを調査するための優れたモデルを提供する。これまでの研究では、主に、固定組織を用いて嗅覚回路における正確な標的化を調節する重要な分子を同定することに焦点を当てていた。ここでは、培養における嗅覚回路アセンブリの重要な発達マイルストーンを反復するアンテナ脳外植システムについて説明する。外側のキューティクルを解剖し、発達中の蛹の脳を覆っている不透明な脂肪体を洗浄することで、生きた脳からの単一のニューロンの高品質の画像を2光子顕微鏡で収集することができます。これにより、生組織からの単一のORN軸索ターゲティングのタイムラプス画像化が可能になる。このアプローチは、以前に同定された重要な遺伝子の重要な細胞生物学的背景と機能を明らかにし、回路アセンブリの動的プロセスを支えるメカニズムを特定するのに役立ちます。

ORN軸索は、18時間から36時間APFの間の触角葉に到着する。その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を神経支配します。ビデオ1は、20分毎の頻度で24時間撮影された、個々に識別可能ないくつかの軸索の全プロセスを示す代表的な ビデオ である。TurboRegを使用して登録する前に、軸索は脳が発達するにつれていくらかの横方向の漂流を示す(ビデオの前半)。登録後、ドリフトが補正されます(動画の後半)。
同じ外植体からいくつかのORN軸索を分離するために、1つの例が図5に示されている。ステップ4.3の手順に従って、図5Aに示す外植体からVA1dおよびVA1v軸索を抽出し、これら2つの軸索のみを含む新しいzスタック画像を生成した(図5B)。同様に、VM2およびVM3軸索(図5B ́)およびDL2軸索(<st...

このプロトコルは、嗅覚回路アセンブリの研究のためのアンテナ - 脳外植システムの解剖手順、培養状態、およびライブイメージングを記述する。

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

このプロトコルは、画像を生き、発達中の脳から単一の軸索レベルで嗅覚回路アセンブリを飛ばす方法を提示する。発達中の脳を覆っている組織をきれいに解剖し、脳内部から高画質な画像を収集することができます。この方法は、回路開発の細胞生物学的基盤に関する貴重な洞察を提供します。他の回路の開発を研究するためにも簡単に変更できます。人が微小解剖で安定した手の制御を行うには時間がかかります。より多くの練習が役立ちます。まず、厚さ0.5センチのシルガードをシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間養生させることで、タイムラプスイメージング中に外植体を動員するための培養皿を準備します。このプレートに鉗子を使って外植体を固定するためのマイクロピンを用意するには、鋭利な端を片側に揃えたテープに複数のマイクロピンを貼り付け、はさみで2ミリの鋭利な端を切ります。次に、鉗子を使用して、切断したマイクロピンを既製のシルガードプレートのシルガード層に挿入する。ブラシを使用して、1時間以内に蛹を形成する白い蛹を集め、それらを新しいバイアルに移す。蛹を摂氏37度で調温した水浴中で40分間インキュベートし、ランダム型からまばらなORNクローンを誘導する。ヒートショック後、バイアルを摂氏25度で30時間置き、蛹形成後30時間で蛹を老化させる。次に、本文原稿に記載されているように外植用の培地を準備し、摂氏4度で保存する。イメージング当日、ウシ胎児血清、ヒトインスリンストック溶液、および20ヒドロキシエクジソンストック溶液をエタノールに溶解し、45ミリリットルのシュナイダーショウジョウバエ培地を含む50ミリリットルのバイアルに加える。よく混ぜて、15ミリリットルのフル培地を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移し、残りのフル培地を摂氏4度で1週間保存します。次いで、完全な培地を含むチューブ開口部をパラフィンフィルムで覆い、滅菌された5ミリリットルのピペットチップを通して液面下の酸素気泡を毎秒1個の気泡の速度で20〜30分間ポンピングすることによって培地を酸素化する。次に、解剖井戸表面を滅菌し、予め用意しておいたシルガードプレートを70%エタノールで乾燥させてから使用してください。ブラシを使用して、APF蛹をティッシュペーパーに30時間移し、蛹の外面を5分間乾燥させる。スライドガラスに両面テープを貼った後、乾燥した蛹を背側が上を向くようにテープの粘着面に丁寧に貼り付けた。蛹をブラシで優しく押して、蛹を傷つけることなく腹側をテープに正しく取り付けます。茶色の蛹ケースと蛹の間に鉗子の鋭い先端を横から挿入し、蛹の後端までの線を通して茶色の蛹ケースを慎重に壊します。茶色の蛹のケースが開いたら、鉗子を使用して、蛹を静かに保持し、1ミリリットルの酸素化された完全な媒体を含む解剖井戸に移す。蛹を培地に浸して井戸の底に沈める。アンテナ脳外植体を蛹から解剖するには、片手で鉗子と一対のマイクロハサミを使用して蛹を優しく保持し、蛹の後側から小さな穴を作り、蛹の内部に高圧を放出します。穴から始めて、腹側の正中線を通って首まで切り取り、次に首の円周を切り開いて頭を蛹の体から切り離し、体を別の井戸に置きます。次に、脳の背側を覆う透明なキューティクルをカットして脳の上の脂肪体を露出させ、網膜とアンテナが取り付けられているキューティクルを保持するようにし、同様に脳の腹側からキューティクルをカットします。P10ピペットを用いて頭部の背側および腹側の開放領域に向けて培地をピペットし、脳およびアンテナを覆う脂肪体を穏やかに洗い流す。両側ORN軸索またはORN軸索とPN樹状突起ターゲティングとの相互作用を研究するには、キューティクルと脳の間にマイクロハサミの刃を慎重に配置し、関心のある触角神経を切断することによって、ステージ中に触角神経を切断する。解剖した外植体をシルガードプレートに移すために、約200マイクロリットルの酸素化された完全培地の液滴をシルガード表面に置く。解剖した体幹に由来する脂肪体を数回ピペットは、内面をコーティングするための200マイクロリットルのピペットチップを介して、解剖ウェルからシルガードプレート上の培地液滴への移送中に外植体がピペットチップに付着するのを防止する。鉗子を使用して外植体を2つの光学ローブのシルガード層に固定し、シルガードプレートをイメージングステーションに慎重に置き、プレートをテープで固定し、P1000ピペットを使用して酸素化されたフル培地10ミリリットルをシルガードプレートにゆっくりと加えます。ORN軸索は、APFで18時間から36時間の間に触角葉に到着し、その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を革新する。登録前は、脳が発達するにつれて軸索はいくらかの横方向の漂流を示し、登録後、漂流は矯正された。抽出されたORN軸索の糸球体同一性は、ニューロピルマーカーおよびカドヘリンの免疫染色によって明らかにされた。内部ローブマップと比較することにより、各糸球体の同一性を決定することができた。エクスビボ培養の間、細菌の増殖は、通常、嗅覚回路の休止発達を引き起こす。そのため、イメージング前に文化的な皿やピンを徹底的に滅菌し、イメージングルームを清潔で隔離しておくことが重要です。より高い空間時間分解能を達成するために、この外植系は、より高度な顕微鏡、適応光学格子光学顕微鏡を用いて画像化することができる。ここでは工場回路の開発を例に挙げて示したが、このシステムは、発達中の中枢脳における他の回路や発達過程の研究にも拡張できる可能性がある。

an-explant-system-for-time-lapse-imaging-studies-olfactory-circuit

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

メゾスコピック蛍光トモグラフィは、組織切片の蛍光顕微鏡の浸透の制限を越えて動作します。技術は、マルチプロジェクション照明と光子輸送記述に基づいています。我々は、生体内でのGFP発現翼成虫ディスクの形態形成の全身3次元可視化を実証...

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

このプロトコルは、無傷の麻酔とイメージングのための信頼性の高い方法を説明します...

サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫からの脳外植片の解剖と取り付けを示しています。眼椎間板に付着した中枢神経系(CNS)を幼虫から抽出し、生理食塩水中のスライドガラスにマウントします。...

ショウジョウバエ幼虫の脳外植片の解剖と取り付け

出典:Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations.J. Vis. Exp.

マウス網膜外植片における神経細胞樹状細胞ダイナミクスのタイムラプス共焦点イメージング

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。...

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

ショ ウジョウバエ 幼虫の嗅覚ニューロンのカルシウムイメージングプロトコルを提示し、固定化に局所組織接着剤を使用します。この方法により安定性が向上し、信頼性の高い in vivo および ex vivo 実験が容易になります。カスタム R...

3齢ショウジョウバエmelanogaster幼虫における嗅覚回路ニューロンの生体内および生体外カルシウムイメージング

学ぶショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング法。単一軸索レベルで発生中の脳を観察し、神経回路の細胞生物学的基盤を解明する。他の神経回路研究にも応用可能です。

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

さらに動画を探す