Name: 自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ 自家製ミニバイオリアクターを用いたiPSC由来脳オルガノイドの作製法。低接着性デバイスでスフェロイドを形成し、分化誘導因子と栄養培地の循環条件で成熟させることで、中枢神経系疾患モデリングに適した高品質な3D組織を大量生産する技術を解説する。

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この研究は、ロシア連邦科学高等教育省からの助成金075-15-2019-1669(RT-PCR分析)とロシア科学財団からの助成金No.19-15-00425(他のすべての仕事のために)によって支えられました。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。

メモ:手順1.2と1.3を除いて、プロトコル全体で無菌技術を使用してください。細胞またはオルガノイドに塗布する前に、すべての培養培地と溶液を37°Cに温めます。CO2インキュベーターで、湿度80%で5%CO2で37°Cで細胞を培養します。プロトコル スキームを図1に示します。
1. ペトリ皿をミニバイオリアクターに変える
<ol><li>高さ7-8ミリメートルのリングで滅菌15 mL遠心分離チューブをカット;リングをオートクレーブします。</li>
	<li>低接着、未処理または微生物学的なペトリ皿をパン粉に分解します。10mLのクロロホルムに約1gのプラスチックパン粉を一晩溶かし、液体プラスチックを調製する。 注意:ヒュームフードで作業してください。</li>
	<li>得られた液体プラスチックがピペット処理に十分な粘性であることを確認してください。その落下は球形を保持し、表面に広がりません。それは非常に液体である場合は、より多くのプラスチックパン粉を追加します。厚い場合はクロロホルムを加えます。</li>
	<li>無菌超低接着6cmペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。以下に詳しく説明する 2 つの適切な方法があります。<ol>
<li>オートクレーブプラスチックリングを中央に置き、液体プラスチックをリングの内側に落とします。</li>
		<li>プラスチック製のリングがない場合は、ペトリ皿の中央に液体プラスチックを落とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>乾燥するまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。乾燥した食器を15~20分間紫外線で処理します。</li>
</ol>2. iPSCの神経分化誘導
<ol><li>細胞外タンパク質からなるマトリックスをあらかじめコーティングした35mmペトリ皿で、最大75~90%の合流度合流を可能にする多能性幹細胞用培地でiPSCを培養します。</li>
	<li>中程度のA-SRを準備します。詳細については 、表 1 を参照してください。</li>
	<li>培養培地を吸引し、0日目の分化時にA-SR培地の2mLを加える。</li>
	<li>メディア A を準備します ( 表 2 を参照)。</li>
	<li>2~14日目から2週間、1日おきにペトリ料理で培地をリフレッシュし、培地Aで細胞を培養します。</li>
</ol>3. 14日目の神経上皮前駆細胞からのスフェロイドの形成
<ol><li>14日目に、各ウェルに約1,200のマイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを用いて神経上皮前駆細胞からスフェロイドを作る(図2C)。以下の手順に従ってください。 注:この分化段階では、35 mmのペトリ皿は通常3-3.5 x 106 神経上皮前駆細胞を含む。したがって、神経上皮前駆細胞を有する1つの35mmペトリ皿は、マイクロウェルを有する24ウェル培養プレートの3〜4ウェルで十分である。</li>
	<li>マイクロウェル付きの24ウェル培養プレートを準備する:各井戸に、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターで5分間、1,300 x g で1mLのミディアムA.遠心分離機を短時間追加します。マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。</li>
	<li>媒体Bを準備する (表 3)。</li>
	<li>ペトリ皿から神経上皮前駆細胞を除去する。DMEM/F12の2 mLで細胞を洗浄してください。細胞剥離の場合、PBSで調製した0.48 mM EDTA溶液の1.5 mLで細胞を処理します。顕微鏡下で細胞剥離を制御します。</li>
	<li>細胞を15 mLチューブに収穫します。チューブに5mLのDMEM/F12を加えて、細胞を洗浄します。200 x g で 5 分間遠心分離機。上清を取り除き、培地Bの2mLで細胞を再懸濁する。</li>
	<li>トリパンブルー染色と血球計で細胞の濃度と生存率を確認します。合計で1 x 106 の生存細胞を含むために必要な懸濁液の量を計算します。</li>
	<li>1 x 106 個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェル付き24ウェルプレートの各ウェルに移します。各ウェルに最大2 mLの培地Bを加え、ピペット細胞を数回上下に軽くピペットし、遠心分離機を1分間100 x g にしてマイクロウェル内の細胞を捕捉します。 注:ウェルあたりのセルの数は1 x 106を超えてはならない。それ以外の場合は、隣接するマイクロウェルからのスフェロイドが融合します。</li>
	<li>顕微鏡下で、細胞がマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。細胞が不均一に分布している場合は、ピペット処理と遠心分離を繰り返します。</li>
	<li>プレートを一晩インキュベートし、細胞をスフェロイドに凝集させます。</li>
</ol>4. オルガノイドの入手と栽培
<ol><li>翌朝(15日目)、顕微鏡下でのスフェロイドの品質を確認する。正常であれば、透明で滑らかであることを確認します(図2A、B)。慎重に15 mLチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2〜3分間重力で沈殿するためにスフェロイドを残し、その後、上清を除去します。</li>
	<li>氷上で同時に解凍したマトリックスの2mLの回転楕円体に加えます。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>マトリックスの余分を洗浄するには、ミディアムB.ピペットのチューブ8 mLにそっと加え、100 x gでチューブを1分間遠心します。 注: 回転楕円体の不可逆的な凝集を避けるために、遠心分離の時間と速度を超えないでください。</li>
	<li>上清を取り除く。ミディアムBのチューブ2 mLに、ピペットをそっと加えます。スフェロイド懸濁液を2つのミニバイオリアクターに分割し、それぞれに4mLの媒体Bを含み、ミニバイオリアクターを15cmのペトリ皿に入れて水の蒸発を防ぎ、汚染を避けます。</li>
	<li>軌道シェーカーにミニバイオリアクター付きのペトリ皿を置きます。オルガノイドを70~75rpmの回転速度で栽培します。</li>
	<li>16日目に、中程度のCを準備します(表4)。</li>
	<li>オルガノイドを15mLチューブに移します。5分間、底に落ちるようにし、上清を吸引し、5 mLの培地Cを加え、オルガノイドをミニバイオリアクターに戻します。 注:透明でほとんど見えない回転楕円体を失わないように注意してください。</li>
	<li>スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。この2週間の終わりに、ミニバイオリアクターあたり約100個のスフェロイドを残し、次の栽培を行う。液体窒素中の凍結媒体中の過剰なスフェロイドを凍結する。</li>
	<li>30日目に、中程度のD(表5)を準備します。</li>
	<li>成熟培地である培地Dに栽培培地を変更する。3週間2〜3日ごとに培養培地をリフレッシュし、BDNFおよびGDNFなしで培地Dを使用する。</li>
</ol>

<ol><li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside+out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
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<li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li>
<li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li>
<li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li>
<li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region%E2%80%93specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li>
<li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li>
<li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned%2C+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820(2021).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

記載されたプロトコルは、均一なサイズの高品質オルガノイドの生成を可能にする2つの重要なステップを有する。まず、オルガノイドは、細胞数と細胞成熟度がほぼ同じスフェロイドから成長する。第二に、自家製のバイオリアクターは、オルガノイドが群がったりくっつくりしない均一な環境を各オルガノイドに提供します。
細胞の品質と細胞成熟の状態は、プロトコルを実行するために不可欠です。iPSCの75~90%合流で神経分化を開始することが重要です。細胞密度が低すぎると、iPSCは非神経方向に分化することができます。後に神経前駆物質が脆弱になるため、iPSCの2週間を超えないことが重要です。分化の間、飢餓はオルガノイドの質の急激な低下につながるので、細胞およびオルガノイドは、定期的に新鮮な培地と一緒に供給されるべきである。動的栽培では、短期休憩のみが許可されます。
プロトコルの一部の変更が許可されます。任意の不活性生物材料は、ミニバイオリアクターの中央部にノブを作るために適用することができます:フッ素樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン。微生物学用のペト...

ヒトiPSC由来モデルは、神経発達および神経変性疾患の研究に広く使用されている。過去10年間で、3D脳組織モデル、いわゆる脳オルガノイドは、本質的に伝統的な2Dニューロン培養2を補完した。オルガノイドはある程度胚性脳の3Dアーキテクチャを再現し、より正確なモデリングを可能にする。大脳皮質3、4、5、小脳6、中脳、前脳、視床下部7、8、9、海馬10の異なる脳領域を表すオルガノイドの生成のために多くのプロトコルが公開されています。ヒト神経系疾患11を研究するためにオルガノイドを使用する複数の例がある。また、オルガノイドは、薬物発見12に実施され、感染症の研究に使用され、SARS-Cov-213,14を含む。
脳オルガノイドは直径数ミリメートルまで達することができます。だから、オルガノイドの内領域は、低酸素症や栄養失調に苦しみ、最終的に壊死的になることがあります。したがって、多くのプロトコルは、特殊なバイオリアクター8、シェーカー、またはマイクロ流体システム15を含む。これらの装置は、大量の高価な細胞培養培地を必要とするかもしれない。また、このような機器のコストは通常高いです。一部のバイオリアクターは、再利用のために殺菌することが困難になる多くの機械的な部品で構成されています。
ほとんどのプロトコルは、同一のiPSCから得られたオルガノイド間で有意な変動性を生み出す「バッチ効果」16に苦しんでいる。この変動は、薬物検査または均一性を必要とする前臨床試験を妨げる。オルガノイドの収率が高いため、均一なサイズのオルガノイドを選択できるほど、部分的にこの問題を解決できる。
時間係数も重大な問題です。松井ら(2018)は、脳オルガノイドが成熟17に達するまでに少なくとも6ヶ月を要することを示した。Trujilloら(2019)はまた、6ヶ月の培養18の後にのみオルガノイドで電気生理活性が起こったことを実証した。オルガノイド成熟時間が長いため、研究者はしばしば前の分化を完了する前に新しい分化を開始します。分化の複数の並列プロセスには、追加の費用、設備、および実験室スペースが必要です。
我々は最近、主に19上記の問題を解決するミニバイオリアクターを開発しました。この自家製バイオリアクターは、中央にプラスチックノブを備えた超低接着または未処理のペトリ皿で構成されています。このプラスチックノブは、シェーカーの回転によって引き起こされるペトリ皿の中央にオルガノイドとその凝集の混雑を防ぎます。この安価でシンプルな自家製ミニバイオリアクターが、高品質の脳オルガノイドを大量に生成する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>24ウェル培養プレート、マイクロウェル付き</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>ニューロンサプリメント B</td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 mM L-アラニル-L-グルタミン</td></tr><tr><td>ヒト BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>ヒト GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト 血清交換</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>血清交換</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>多量性幹細胞培地</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>ニューロベースル培地</td><td>ギブコ</td><td>21103049</td><td>神経細胞維持のための基礎培地</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>ギブコ</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>プラズモシン</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>抗菌剤</td></tr><tr><td>プルモルファミン</td><td>EMD ミリポア</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS ドルソモルフィン</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-104-466</td><td>ドルソモルフィン</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション</td><td>ギブコ</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>バーセン ソリューション</td><td>ギブコ</td><td>15040066</td><td>0.48 mM EDTA含有PBS</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

iPSC由来の脳オルガノイドは、イン ビトロで 神経系の病理と薬物スクリーニングをモデル化するための有望な技術です。この技術は最近登場しました。それはまだ初期段階にあり、まだ未解決のいくつかの制限があります。現在のプロトコルは、オルガノイドを得ることを薬物発見および前臨床試験のために十分に一貫することを可能にしていない。オルガノイドの成熟には最大1年かかる可能性が高く、研究者は複数の分化プロセスを同時に開始する。それはスペースおよび装置の点で実験室のための付加的な費用を課す。さらに、脳オルガノイドは、多くの場合、栄養と酸素欠乏症に苦しむ中心に壊死領域を持っています。したがって、ほとんどの現行プロトコルは、栄養を改善するために培養培地の循環系を使用する。
一方、オルガノイド栽培のための安価な動的システムやバイオリアクターはありません。本論文では、小型で安価な自家製ミニバイオリアクターで脳オルガノイドを製造するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、大量に高品質のオルガノイドを得ることができます。

プロトコル スキームを図1に示します。このプロトコルには、iPSCが少なくとも1ヶ月間に脳オルガノイドに分化する5つのメディアが含まれていました。分化が開始された後、iPSCは75-90%の合流点に達した(図2A、B)。細胞が「ロゼット」に集まり始めた時、ニューロンに対する分化の最初の兆候は、10~11日目に、細胞が「ロゼット」に集まり始めた時に、A培地でのiPSC培養の10~11日目に観察された(図2C)。14-15日目に、iPSCは神経上皮前駆細胞に分化した。細胞の99%は、神経上皮マーカーSOX1に陽性であり、多能性細胞マーカーTRA-1-81およびOCT4を発現しなかった(補助図S1)。次に、EDTA含有溶液を用いて細胞を採取し、ミディアムBでマイクロウェルを有する特殊な24ウェル培養プレートに移した(図2D)。<strong...

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

現在までに、多能性幹細胞から分化した大脳オルガノイドは、ヒトの脳組織に最も近い3D型のvitroモデルである。さらに、大脳オルガノイドは、様々な中枢神経系の病態のモデル化、薬理学的活性物質の試験、再生医療への使用にも同様に適しています。一方、この技術は開発の初期段階にあります。このプロトコルは、分化を伴う凝集体の取得方法とさらなる栽培に応じて2つのグループに分けることができる。最初の分化のプロトコルとスキームを含みます, 市場のチューブやプレートのような特別な低接着デバイスでシェーカーでオルガノイドのその後の成熟と栽培時間と分化誘導器で異なります.別のグループには、特殊なバイオリアクターの使用が含まれます。様々なプロトコルの分析は、オルガノイドが循環栄養培地と条件下で栽培されるべきであることを示しています。しかし、標準サイズと形態を有するオルガノイドを得るための簡単で安価なシステムがない場合、プロセスをスケーリングするためのそのようなデバイスの開発が必要である。本研究では、高品質のオルガノイドを大量に得ることを可能にする、簡素で安価なミニバイオリアクターの入手と試験を行う方法を説明する。無菌15ミリリットルの遠心管をリングに切り込み、高さ7~8ミリメートル。リングをオートクレーブします。処理されたまたは微生物学的なペトリ皿の低凝集をパン粉に分解する。一晩クロロホルムの10ミリリットルに約1グラムのプラスチックパン粉を溶解し、液体プラスチックを調製します。滅菌超低接着6センチメートルペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。2つの同様に適切な方法があります。最初に、オートクレーブを中央のプラスチックリングに入れ、リングの内側に液体プラスチックの半ミリリットルを塗布します。第二に、プラスチックリングなしでペトリ皿の中央に液体プラスチックの半ミリリットルを落とします。完全な乾燥がするまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。多能性幹細胞用培地中に誘導多能性幹細胞を培養し、ペトリ皿35ミリメートルで最大75または90%合流し、冷たいダルベックコ改変イーグル培地に溶解したマトリックスで前塗りし、フィッシャー-12培地を行う。培地Aプラス血清交換を準備します。血清置換を用いて培地中で1日間、誘導多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞の培地を分化ゼロ日の血清置換培地に変更する。培地A.分化2日目に培地Aに変更します。培地Aで2週間培養し、2日ごとにペトリ皿に培地をさわやかにします。14日目に、各ウェルに約1,200マイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを使用してスフェロイドの形成を開始します。マイクロウェルで24ウェルの培養プレートを準備します。各ウェルにミディアムA1ミリリットル、遠心分離機を1,300gで5分間、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターに加えます。マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。中ミディアムB.ペトリ皿から培地を取り出します。細胞剥離の場合は、PBSで調製した1.5ミリリットルのEDTA溶液で細胞を治療します。顕微鏡下で細胞剥離を制御します。細胞を15ミリリットルのチューブに収穫する。5ミリリットルの混合ダルベッコとフィッシャー培地をチューブに加えて細胞に向かって入れ.200gで5分間遠心分離機。上清を取り除き、2ミリリットルの培地Bで細胞を再懸濁させ、10億個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェルを備えた24ウェルプレートの各ウェルに移す。ピペット細胞を数回上下に軽くし、遠心分離機は100gを1分間短くしてマイクロウェル内の細胞を捕捉する。細胞がマイクロウェルに均等に分布することを顕微鏡で制御する。スフェロイド中の細胞凝集のためにプレートを一晩インキュベートします。翌朝、15日目は、健康であれば透明で滑らかなスフェロイドの品質を顕微鏡で確認してください。慎重に15ミリリットルのチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2と3分間重力によって沈殿するスプフェロイドを残し、その後、上清を除去します。マトリックスの2ミリリットルの回転楕円体に加え、解凍し、氷の上で元テンポを付ける。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。マトリックスの過剰を洗浄するには、穏やかにミディアムB.ピペットのチューブ8ミリリットルに追加し、100gで1分間チューブを遠心します。上清を取り除く。ミディアムBのチューブ20ミリリットルに加え、ピペットを穏やかに、ミニバイオリアクター間でスプフェロイド懸濁液を分割する。その後、ミニバイオリアクターを15センチメートルのペトリ皿に入れ、水の蒸発と汚染を防ぎます。軌道シェーカーにミニバイオリアクターとペトリ皿を置きます。オルガノイドを回転速度70、75rpmで栽培する。16日目に、50ミリリットルチューブに中程度のC.トランスファーオルガノイドを調製する。5分間、底に落ちるようにします。上清を吸引し、ミニバイオリアクター内のオルガノイドに再結合する培地C.の5ミリリットルを加える。スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。これらの2週間の間に、次の栽培のためのミニバイオリアクターごとに約100スフェロイドを選択する。30日目に、成熟培地である培地Dに培地D.チェンジ培養培地を調製する。栽培培地を2~3日ごとに3週間リフレッシュします。次に、FとGDNFに溶解した培地Dを使用する。1ヶ月連続して培地A及びBで培養した後、サイズ及び形態で標準化されたオルガノイドが得られる。成長するにつれて、彼らはより頻繁に培地を変更する必要があります、週に4回までも増加します。2ヶ月の栽培後、直径4、5ミリに達する。そして、さらに1ヶ月後、5と6ミリメートルと成長が停止します。図は、ヘマトキシリンとエオジンで塗られたオルガノイド酵素、明確な部分の外観を示しています。1ヶ月間の免疫物質化学的分析は、中枢部を含む前駆細胞のSOX2陽性クラスターの存在を示す。オルガノイドの末梢では、グリアフィブリリン酸性タンパク質、微小管関連タンパク質2、およびチアジンヒドロラーゼ陽性。細胞は濃縮され、これは成熟した形態のニューロンに対応する。いくつかのケースでは、壊死領域上の白人のクラスターが中央部に形成されています。これは、より大きなオルガノイドを得るためのこのプロトコルの限界を示す。最も可能性の高い, 成長の制限要因は、栄養素と酸素の拡散率です。.様々なメディアや細胞タイプのスフェロイドと、オルガノイドのいくつかの種類のシステムをテストします。脳およびレチナの多くは、肝臓癌細胞と間葉系幹細胞からのオルガノイドを組み合わせたもので、資本芽球間葉系幹細胞呼び出しからのオルガノイドと、人工多能性幹細胞および腸オルガノイドからの造血幹細胞分化を組み合わせた。細胞の初期組成では可変でしたか?分化因子、培養、培地、細胞外マトリックス、およびおそらくガス混合物組成、プラットフォーム回転の速度、および他のパラメータも挙げている。様々な臓器や組織において同じ形状、大きさ、または形態モデルを有するオルガノイドを得ることが可能となる。ミニバイオリアクターの使用は、この研究に提案しました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、人工多能性幹細胞からヒトの脳オルガノイドを生成する方法を示しています。これは、ニューロスフェアが神経外胚葉層を形成し、それが他の胚葉の形成を抑制する方法を示しています。ニューロスフェアは3Dゲルマトリックスに埋め込まれ、ニューロ上皮芽を形成します。オルガノイド培地とインキュベートすると、これらの神経上皮芽は特定の脳領域に分化し、成熟した脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト脳オルガノイドを作製するためのIn Vitro法

このビデオでは、人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するアッセイを実演しています。ヒトiPS細胞は、胚様体(EB)を形成するように誘導されます。EBは、誘導媒体を使用してポリマー足場上で培養され、神経幹細胞、前駆細胞、未成熟ニューロンへの分化を促進します。最後に、EBはマトリックスに埋め込まれ、脳オルガノイド形成のための維持培地に移されます。...

人工多能性幹細胞由来脳オルガノイドの作製

このビデオでは、シングルユースの3Dバイオリアクターを使用して、人工多能性幹細胞(iPSC)から成熟した小脳オルガノイドを生成する技術を示しています。このバイオリアクターはiPS細胞凝集体の形成を促進し、その後、成長因子とケモカインを豊富に含む一連の培地で処理することで、iPS細胞凝集体の成熟小脳オルガノイドへの分化を誘導します。その後、オルガノイドを回収し、さらなる分析のために凍結保存します。...

シングルユースバイオリアクターを用いた人工多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドの作製

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。...

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。...

ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。...

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

学ぶ 自家製ミニバイオリアクターを用いたiPSC由来脳オルガノイドの作製法。低接着性デバイスでスフェロイドを形成し、分化誘導因子と栄養培地の循環条件で成熟させることで、中枢神経系疾患モデリングに適した高品質な3D組織を大量生産する技術を解説する。

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

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