Caenorhabditis elegansにおける凝集定量の自動化
October 14th, 2021
以下のプロトコルは、プロテオスタシスの変化の評価として、ワーム培養、蛍光イメージング、およびポリグルタミン凝集体を定量するための自動画像処理のためのハイスループットワークフローの開発と最適化について説明しています。
ポリグルタミン凝集を評価し、ハイスループットアプリケーションに使用できるフレームワークを提供することにより、プロテオスタシスの変化を監視するための簡単なアプローチが取られました。集計数などの表現型をスコアリングすることで主観的になり得る。集計カウントを自動化することで、このようなバイアスを排除し、スループットと再現性を向上させることができます。
この方法は、宿主プロテオスタシス破壊に寄与する細菌遺伝子を同定するのに役立つ。個々の細菌遺伝子の寄与を理解することは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの疾患の病因におけるその影響を理解するのに役立ちます。まず、ワームを含むプレートを冷凍庫から取り出し、室温で解凍させます。
その後、余分な結露を拭き取り、フタを外してからイメージングを行います。画像キャプチャ中に、露光時間500ミリ秒、倍率40 X、0.63 Xカメラアダプター、GFP強度を100%に設定した顕微鏡設定を使用します。次に、ワームが暗い背景と比較して明るく照らされて表示されるまで、透過光コントロールを調整して、露出過多を回避します。
10マイクロリットルのピペットチップを使用してワームを目的の位置に穏やかに押し込むことにより、ウェル内のワームの位置を変更して過度の凝集を防ぎます。チャンネルをGFPフィルタに設定して、両方の画像の焦点面を確立します。明視野画像をキャプチャします。
プレートを乱すことなく、または顕微鏡の焦点を変えることなく、対応する蛍光画像を撮影します。次に、画像を評価するには、まず CellProfiler をダウンロードします。ソフトウェアを開き、目的の画像を画像ボックスにドラッグアンドドロップします。
ファイルリスト内の画像をクリックして開きます。拡大鏡ガラスを選択して関心領域を強調表示し、矢印アイコンを選択してワームと凝集体の両方の長さを測定します。目的のオブジェクトにカーソルを合わせると、画面の下部に表示される強度の値が表示されます。
CellProfiler画像解析パイプラインを利用するには、公式WebサイトからCellProfilerをダウンロードした後、テキスト原稿の説明に従って画像ペアに適切な名前を付けます。パイプラインをダウンロードし、ファイル、インポート、およびファイルからのパイプラインを選択して、CellProfiler にアップロードします。もつれのないワームモジュールを選択して設定を開き、もつれのないワームモジュール内のワームを識別するために使用されるトレーニングセットをロードします。
次に、トレーニングセットのファイル名を特定します。ファイルのアップロードアイコンを選択し、補足ファイルもアップロードします。左上隅にある画像モジュールを選択して、画像をアップロードします。
そして、適切な名前の画像をドラッグアンドドロップします。画像を分析する前に、プログラムの左下隅近くにある出力設定ボタンをクリックして、結果を保存するために使用される目的の出力フォルダを選択します。次に、デフォルトの出力の右側にあるフォルダアイコンを選択して、目的の出力場所を選択します。
[画像の分析] アイコンを選択して、画像分析を開始します。分析の完了に時間がかかりすぎて、1 つのイメージの処理が停止している場合は、実行を中止し、出力フォルダーを並べ替えて、見つからないイメージ名を書き留めて、未処理のイメージを識別します。完全な分析の後、ソフトウェアは、列Nの個々のワームと列K.Downloadの集計のそれぞれの数を含むExcelスプレッドシートに結果を整理し、CellProfilerからの出力CSVファイルからのデータを便利に整理します。
Windows OSの場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて目的の場所に解凍します。gui_Windowsos_64xという名前の抽出されたフォルダーを見つけて開きます。GUIアプリケーションアイコンをクリックしてアプリケーションを起動します。
実行の許可を要求するプロンプトが開くことがあります。詳細情報を選択し、[実行]をクリックします。これで、メタデータ オーガナイザーは、CellProfiler 出力 CSV ファイルをドラッグ アンド ドロップする準備ができました。
Mac OS の場合は、ダウンロードしたファイルを見つけて、ファイル・メタデータ・オーガナイザー・アプリケーション・ファイルを抽出します。ダウンロードで見つかった抽出されたフォルダを開きます。GUIアプリケーションを右クリックし、[開く]を選択します。
公式ライセンスがないために、開く許可を求めるプロンプトが表示されます。[開く] を選択します。メタデータオーガナイザーアプリケーションがそれぞれのOSで開いたら、ここにファイルをアップロードするか、目的のCellProfiler CSVファイルをドラッグアンドドロップします。
整理ボタンをクリックすると、ファイルのダウンロードボタンで新しい画面にユーザーが表示されます。ボタンをクリックして、出力ファイルを保存する場所を選択します。出力ファイルは、ファイル名に拡張子が追加された元のファイル名_organized表示されます。
FUDRの存在下では、様々な細菌を与えられたワームは、より均一な正確なワーム検出を可能にし、したがって過密の問題を解決する、より一貫した体の大きさを有していた。ワームを凍結すると、バックグラウンド蛍光を排除することでpolyQ凝集体検出が向上し、手動カウントに匹敵する自動カウントの精度が向上しました。反転明視野照明は、polyQ YFP凝集体を画像化するためにC.elegansおよびGFPチャネル全体を検出するために使用した。
各ワームのワーム検出、もつれの解除、および凝集の定量化は、最適化されたCellProfiler画像処理パイプラインを適用して行われ、個々のワームあたりの凝集体数を取得できます。自動凝集定量とCellProfilerパイプラインの使用の有効性の差は最小限であり、自動化された方法を大規模なスクリーンに適用できることを示しています。試験した90の細菌株のうち、1つの候補によるC.elegans腸のコロニー形成は、凝集体の数の有意な減少を示した。
手動計数による確認実験により、凝集体の数を有意に減少させたものを含む変異体のいずれもpolyQ凝集に影響しないことが明らかになった。このフレームワークを使用することを決めた研究者は、概説されている手順が絶対的ではないことを理解する必要があります。CellProfiler の操作方法の変更と基本的な理解は、成功に不可欠です。
ウェスタンブロッティングなどの追加の生化学的アプローチを使用して、polyQ凝集を確認することができます。
概要
この研究では、タンパク質の恒常性変化を測定するためのポリグルタミン凝集体の定量化に、ワームの培養、蛍光イメージング、自動化された画像処理の高スループットワークフローを開発しました。この方法は、特に神経変性疾患における役割を探索する際、これらの凝集体の評価を強化します。
主要な研究要素
研究分野
- タンパク質の恒常性
- 神経変性疾患
- 高スループットスクリーニング
背景
- ポリグルタミン凝集体はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの疾患と関連しています。
- タンパク質の恒常性破壊における細菌遺伝子の寄与を理解することが重要です。
- 従来の凝集体のスコアリング方法には主観性が伴う可能性があります。
使用した方法
- CellProfilerを使用した高スループットイメージングと分析
- 生物学的モデルとしてのC. elegans
- ポリグルタミン凝集体の自動化された定量化
主な結果
- 自動化された画像処理により、凝集体のカウントにおけるバイアスの排除と再現性の向上が可能になりました。
- ワームの凝集体数に有意な結果をもたらす、宿主のタンパク質の恒常性を影響する細菌遺伝子を特定しました。
- 検証された結果は、自動化が手動カウントに匹敵することを示し、大規模なスクリーニングをサポートしています。
結論
- この研究は、ポリグルタミン凝集体を通じてタンパク質の恒常性を研究するための信頼できる枠組みを提供します。
- この方法から得られた洞察は、神経変性疾患のメカニズムを理解する上で関連性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
