マイクロ流体デバイスを用いたsiRNA搭載脂質ナノ粒子の製造
2022年3月22日
マイクロ流体ベースの脂質ナノ粒子(LNP)生産方法は、RNA送達を含む薬物送達システム(DDS)において注目されている。このプロトコルは、iLiNPという名前の当社独自のマイクロ流体デバイスを使用した製造、LNP(siRNA搭載LNP)生産、およびLNP評価プロセスを記述しています。
脂質ナノ粒子サイズは、生体分布、抗腫瘍効果、および遺伝子サイレンシング性能に影響を及ぼす。したがって、LNPサイズ制御法は、RNA送達系を含むナノ医薬品を製造するための有効な技術である。iLiNPデバイスと名付けられたこのオリジナルのマイクロ流体デバイスは、10ナノメートル間隔で20〜100ナノメートルの範囲のLNPサイズを制御することができました。
iLiNPデバイスは、siRNA搭載LNPだけでなく、すべてのmRNA搭載LNPS、およびリボヌクレオタンパク質搭載LNPも産生することができる。まず、脂質エタノール溶液を採取し、DOTAP、DSPC、コレステロールおよびDMG-PEG2k溶液を50〜10〜38.5〜1.5のモル比で混合することによってsiRNA負荷LNPを生成する。総脂質濃度を8ミリモルに調整する。
次いで、pH4で154ミリモルの生理食塩水および25ミリモルの酢酸緩衝液の水溶液を採取し、0.2マイクロメートルのメンブレンフィルターまたはシリンジフィルターを通して濾過する。70マイクログラムのsiGL4を1ミリリットルの25ミリモル酢酸緩衝液に溶解してsiRNA緩衝液を調製する。1ミリリットルのガラスシリンジにそれぞれ脂質および水溶液を充填する。
シリンジコネクタを使用してガラスシリンジをピークキャピラリスに接続し、脂質および水溶液の流量を設定し、シリンジポンプを使用して脂質および水溶液を別々にiLiNP装置に導入する。LNP懸濁液をiLiNP装置の出口からマイクロチューブに集める。LNP懸濁液を、それぞれPOPC LNPsおよびsiRNA搭載LNPsについて生理食塩水またはDPBSに対して摂氏4度で分画分子量12〜14キロダルトンの透析膜を用いて一晩透析する。
透析したLNP懸濁液をマイクロチューブに集め、次にLNP懸濁液20〜30マイクロリットルをマイクロ石英セルにピペットする。最後に、動的光散乱によりLNPサイズ、LNPサイズ分布およびポリ分散度指数を測定する。総流量や流量比などの異なる流量条件で生成されたPOPC LNPサイズ分布がここに示されています。
このiLiNPデバイスを使用して、20~100ナノメートルの範囲の正確なLNPサイズを制御できます。小型LNPは、高い総流量条件で形成されます。さらに、FRR 5で形成されるLNPサイズは、総流量に関係なく、FRR 3のサイズよりも小さくなります。
siRNA搭載LNPsのサイズ分布をここに示す。siRNAは、カチオン性脂質DOTAPと負に荷電したsiRNAとの間の静電相互作用によってLNPに封入される。iLiNPデバイスは、狭い分布を有する90ナノメートルのsiRNAを装填したカチオン性LNPを産生した。
siRNAの封入効率は、カチオン性脂質と負に荷電したsiRNAとの間の静電相互作用のために95%であった。19ナノメートルsiRNA搭載LNPsの細胞毒性および遺伝子サイレンシング活性を評価した。siRNA負荷LNPsは、10〜100ナノモルのsiRNAの用量で細胞毒性を示した。
ルシフェラーゼの発現量はsiRNA濃度に依存して減少した。LNPsをロードしたsiRNAは、100ナノモルのsiRNAの用量で80%のルシフェラーゼ発現を抑制した。流れ条件の最適化は、所望のサイズのLNPを得るためのプロトコルの最も重要なステップです。
iLiNP装置を含むマイクロ流体ベースのLNP製造方法は、煩雑な手順を必要とせず、標準的なLNP製造方法として採用されることが期待されています。
概要
本記事では、iLiNPと呼ばれるマイクロ流体デバイスを用いて、siRNAを封入した脂質ナノ粒子（LNP）を作製するプロトコルを紹介します。この手法により、効果的な薬物輸送システムにおいて極めて重要となるLNPのサイズを精密に制御することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 薬物輸送システム
- 脂質ナノ粒子
- マイクロフルイディクス
背景
- 脂質ナノ粒子のサイズは、生体内分布および治療効果に影響を与えます。
- RNAデリバリーを最適化するためには、LNPサイズの制御が不可欠です。
- iLiNPデバイスにより、20から100ナノメートルの範囲でサイズ制御が可能です。
- 静電的相互作用により、LNPへのsiRNAの封入が促進されます。
研究目的
- siRNA封入LNPを製造するための信頼性の高い手法を開発すること。
- LNPのサイズが遺伝子サイレンシング効率に及ぼす影響を評価すること。
- 目的とするLNP特性を得るために、フロー条件を最適化すること。
使用方法
- LNP製造のための脂質溶液および水溶液の調製。
- iLiNPデバイスを用いた混合およびLNP形成。
- 過剰な物質を除去するためのLNP懸濁液の透析。
- 動的光散乱法によるLNPのサイズおよび分布の測定。
主な結果
- iLiNPデバイスにより、粒子径90 nanometersで封入効率95%のsiRNA封入LNPが作製されました。
- 高い全流速条件下で、小型のLNPが形成されました。
- siRNA封入LNPは、細胞毒性と効果的な遺伝子サイレンシングを示しました。
- 目的のLNPサイズを達成するには、最適化された流速条件が極めて重要でした。
結論
- iLiNPデバイスを用いたマイクロ流体法により、LNPの製造が簡素化されます。
- このアプローチにより、研究におけるLNP製造の標準化が期待されます。
- 今後の研究により、さまざまなRNAデリバリーシステムにおける本手法の応用を検討することが可能です。
よくある質問
業界における実用的意義
脂質ナノ粒子（LNP）のサイズを精密に制御することは、RNAベースの薬物配送システムにおける生体内分布、治療効果、および遺伝子サイレンシング能を最適化する上で極めて重要です。iLiNPマイクロ流体デバイスは、20から100ナノメートルの範囲でサイズ調整可能な再現性の高いLNP製造を可能にし、初期段階のターゲットバリデーションおよびリード化合物同定のワークフローを支援します。この機能により、ナノ粒子の性能におけるばらつきが低減され、前臨床モデルにおける予測信頼性が向上するため、トランスレーショナル研究を推進する際のリスク軽減に重要な役割を果たします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：標的バリデーションアッセイにおいて、siRNA封入LNPのサイズ依存的な生物学的活性の解析を可能にする。
- 実用的価値：標準化されたLNP処用を提供することで、表現型スクリーニングやメカニズム的なリスク低減研究におけるノイズを減少させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定義されたサイズと95%の封入効率を持つ単分散siRNA-LNPを生成し、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
- 実用的価値： iLiNPデバイスにおける流速調整による再現性のあるLNPサイズ制御を通じて、アッセイの標準化を支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： LNPのサイズと、疾患関連システムにおける遺伝子サイレンシング効率および細胞毒性との相関関係の解明を促進します。
- 実用的価値： 前臨床研究の継続性を確保するため、mRNA、siRNA、およびリボ核タンパク質を封入したLNPのスケールアップ可能な製造を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
iLiNPマイクロフルイディクス法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床開発に至るディスカバリーの連続的なプロセスに適合します。これは特に、サイズ依存的なデリバリーが有効性に影響を与えるRNA治療薬において有用です。
- 探索生物学：LNPのサイズを系統的に変化させ、細胞への取り込みやターゲットへの結合への影響を評価することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：一定のサイズ分布と高いsiRNA封入率を持つ、アッセイ ready なLNP製剤を提供し、再現性のある化合物スクリーニングを実現します。
- 分析：動的光散乱法により、サイズ、多分散指数、ゼータ電位の定量的データを提供し、Go/No-go判断の根拠とします。
- トランスレーショナルリサーチ：標準化されたサイズ制御ナノ医薬品を通じて、探索段階のLNP最適化を前臨床評価へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトにわたり、さまざまなRNA搭載LNP（siRNA、mRNA、RNP）を製造するための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：LNPの物理化学的特性と遺伝子サイレンシングなどの機能的結果を関連付けることで、ターゲットに対する信頼性を向上させます。
- 運用の価値：マイクロフルイディクスの精密制御により、LNP製造の再現性とスケールアップ能を高めます。
- 戦略的価値：デリバリーベクターの性能を早期に検証（デリスキング）することで、後段階における生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：デリバリー効率に基づいた、リスク調整後のRNA治療薬候補の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 脂質製剤の調製、マイクロ流体デバイスの操作、および核酸の封入に関する専門知識が必要です。
- LNP精製のために、シリンジポンプ、ガラスシリンジ、および透析設備に依存します。
- チーム間での流速比および総流速条件の標準化が必要です。
- 脂質組成やRNAカーゴの種類を変更する際は、適応に関する検討が必要です。
- 品質管理のために、製造後の透析および動的光散乱法による測定が必要であるという制約があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
