Name: マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学ぶマウス脳海馬組織の機械的・酵素的解離法。少量の神経組織から高生存率の単一細胞懸濁液を調製し、細胞機能と治療効果の構造特異的解析を可能にする。

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Aimee Rogersが実践的なトレーニングと継続的な製品サポートを提供してくれたことに感謝します。アマンダ・バーク博士の継続的なトラブルシューティングと議論の明確化に感謝します。メレディス・ヨハイムとUAMSサイエンス・コミュニケーション・グループに対し、この原稿の文法的な編集とフォーマットに感謝します。この研究は、NIH R25GM083247およびNIH 1R01CA258673(A.R.A)によって支持された。

実験は、UAMSの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準に従って実施された。生後6ヶ月の雌性C57Bl6/J野生型マウスを購入し、一定の12時間の明暗サイクル下で集団飼育(ケージあたり4匹)した。
1. 試薬の調製
<ol><li>修正可能な生/死汚れストック溶液を準備します。蛍光染色液を20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。</li>
	<li>バイアルをホイルで包み、「再構成済み」とラベルを付け、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。</li>
	<li>ヘパリンを含む0.9%生理食塩水を調製する。1バイアルのヘパリンナトリウム(10mLあたり10,000USP単位)の内容物を1Lの二重蒸留水(ddH2O)で希釈する。</li>
	<li>1匹あたり約45mLに十分な量を用意し、4°Cで最大1週間保存してください。</li>
	<li>1%パラホルムアルデヒド(PFA)を作る。<ol>
<li>ヒュームフード内で、ホットプレートを50°Cに加熱する。 電子レンジで、ガラスビーカー中のddH2O100mLを約60°Cに加熱する。 マグネチックスターバーを加え、ホットプレートに移す。</li>
		<li>ヒュームフード内で、1gのPFAを計量し、ddH2Oのビーカーに加え、0.1125gのNaOH結晶を加え、溶解するまで混合する(5〜10分)。</li>
		<li>0.4gのNaPO4- 一塩基を添加し、溶解するまで混合する(2〜5分間)。溶液を真空ろ過し、HClおよびNaOHでpHを7.4に調整する。</li>
		<li>氷の上または4°Cで30分間冷やしてから保管してください。 注:1.5mLのアリコートは、-20°Cで1年間保存することができます。凍結融解サイクルは避けてください。解凍後に溶液が白濁したり、沈殿物が形成されたりした場合は、溶液を使用しないでください。 警告: 有毒で可燃性です。適切な個人用保護具を着用した換気フードの下でPFAを常に使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結乾燥酵素Aを1mLのバッファーAで再懸濁する。溶液を渦巻き込まないでください。 注:酵素Aおよび緩衝液Aならびに緩衝液A、Y、およびZは、市販の成人脳解離キット17の試薬である。</li>
	<li>酵素Pを50 μLのアリコートに分割し、エンザイムAを10 μLのアリコートに再懸濁する。キットの説明書に従って、-20 °C で最大 6 か月間保管してください。凍結融解サイクルは避けてください。</li>
</ol>2. 実験日
<ol><li>卓上遠心分離機を4°Cに冷却する。</li>
	<li>PFAのアリコートを冷蔵庫に入れ、徐々に解凍します。</li>
	<li>再構成された生/死んだ汚れを暗所(引き出しなど)に置き、室温で解凍します。</li>
	<li>ウシ血清アルブミン(BSA)バッファーを調製する。カルシウムとマグネシウムを含まない1x Dulbeccoのリン酸緩衝溶液(D-PBS)100 mLに0.5 gのBSAを加えます(pH 7.2)。</li>
	<li>攪拌子を加え、攪拌板上で30分間混合する。50mLの円錐管に移し、4°Cで保存する。 メモ:常に新しく調製したBSAバッファーを使用してください。</li>
	<li>生きた/死んだ汚れ作業希釈液を準備します。再構成された生/死汚れストック溶液1 μLを360 μL D-PBSに加え、室温で暗所(引き出しや箱など)に保管します。サンプルあたり50 μLの作業希釈液を調製する。</li>
</ol>3. 灌流
<ol><li>ヘパリンを含む生理食塩水を氷の上に置きます。</li>
	<li>酸素をオンにし、小動物麻酔気化器システムの流量計インジケータボールを1 L /分に設定します。適切な酸素圧力とイソフルランがあることを確認してください。</li>
	<li>気化器ダイヤルを3.5%に調整します(誘導とメンテナンス用)。</li>
	<li>灌流ポンプラインを生理食塩水/ヘパリン溶液でプライムします。速度を 6 mL/分に設定します。</li>
	<li>マウスを誘導チャンバーに入れ、ブリーザーをオンにして、マウスが反応しなくなるまで数分待ちます。有害なピンチへのペダルの引き抜きがないことを通して麻酔の十分な深さを確認してください。</li>
	<li>マウスを背中に乗せて解剖トレイの上に置き、鼻をノーズコーンに入れます。有害なピンチへのペダル離脱の不在による完全な麻酔の二次確認を行う。4本の足をトレイに固定します。</li>
	<li>動物の腹部に20%エタノールをスプレーする。</li>
	<li>鉗子を使用して、下腹部をつまみ、皮膚を持ち上げます。はさみを使用して、毛皮や皮膚を胸郭の底まで切り取ります。</li>
	<li>胸郭の下から各肩に向かって2つの斜めの切開を行います。</li>
	<li>横隔膜を慎重に切除する(肺と心臓を避ける)。胸郭を切除して心臓を露出させます。</li>
	<li>心臓の周りの結合組織を慎重に切断します。 注: ステップ 3.10-3.11 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。</li>
	<li>はさみを使って右心房(心臓の左上にある暗い葉)をクリップします。ブリーザーへのイソフルランの流れをオフにします。</li>
	<li>鉗子で心臓をしっかりと保持します。蝶の針の斜めを上に向けて、針を水平に保ちながら左心室を突き刺し、動物と平行にします。</li>
	<li>針を所定の位置に保持し、ポンプをオンにし、心臓を離れる液体が不透明になり、肝臓と肺の色が薄くなるまで、少なくとも30mLの生理食塩水/ヘパリン溶液を灌流します。 注: ステップ 3.13-3.14 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。</li>
	<li>ポンプの電源を切り、針を外し、マウスを解剖領域に移します。</li>
</ol>4. 解剖
<ol><li>大きな外科用はさみを使用して、頭を斬首します。</li>
	<li>毛皮を頭の後ろから目まで切ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がします。</li>
	<li>頭蓋骨を目の間にクリップで留めます。頭蓋骨の後ろ、10時と2時の位置で2つの切り傷を作り、頭蓋骨の矢状線に沿って目の間の元の切り傷まで1つの長い切り傷(脳を傷つけないように先端を上に保ちます)。</li>
	<li>鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの半分を側面に剥がします。ヘラを使って脳を摘出し、冷たいD-PBSで満たされた氷の上の60mmガラスのペトリ皿に入れます(図1)。</li>
	<li>メスまたはカミソリを使用して各半球を分離します。その後、嗅球と小脳を取り除きます。</li>
	<li>鉗子を使用して、海馬が露出するまで中脳を除去します。</li>
	<li>鉗子で脳を固定します。第2の鉗子セットを用いて、各半球から海馬を優しくからかい、両方の海馬を冷たいD-PBSを含む標識された1.5mLチューブに移す。</li>
	<li>マウス由来の2匹の海馬を入れたサンプルチューブを氷の上に置く。</li>
</ol>5.各サンプルの酵素ミックス1と2を準備する
注: 2 mL を超える容量の場合は、10 mL の血清学的ピペットを使用してください。容量については、200 μL-2 mL、1000 μLピペットを使用する。容量21~199 μLの場合は、200 μLのピペットを使用します。容量の場合は、2-20 μL、20 μLのピペットを使用します。2 μL 未満の容量の場合は、0 ~ 2 μL のピペットを使用してください。
<ol><li>各サンプルについて、酵素Pおよび酵素Aのそれぞれ1つのアリコートを室温で解凍する。</li>
	<li>酵素ミックス1の場合、標識Cチューブに50 μLの酵素Pと1900 μLのバッファーZを混ぜ合わせます(材料表)。</li>
	<li>酵素ミックス2の場合、解凍した10 μLの酵素Aアリコートに20 μLのバッファーYを加えます。</li>
</ol>成人脳解離プロトコル17
メモ: サンプルを扱う場合、特に断りのない限り、BSA および D-PBS が氷上に残っている間、チューブは室温でチューブラックに入れる必要があります。
<ol><li>解離器のスイッチを入れます。</li>
	<li>鉗子を使用して海馬組織片をCチューブに移す。</li>
	<li>30 μL の酵素ミックス 2 を C チューブに移します。張力が感じられるまでキャップをひねり、カチッと音がするまで締めます。</li>
	<li>Cチューブを逆さまにして解離器の位置に置きます。サンプルには [選択済み] ステータスが割り当てられます (図 2)。ヒーターをCチューブの上に固定します。</li>
	<li>フォルダアイコンを押し、 お気に入り フォルダを選択し、スクロールして 37C_ABDK_02 プログラムを選択します。[ OK] をクリックして、選択したすべてのCチューブにプログラムを適用し、[ スタート ]をタップします(図2)。</li>
	<li>サンプルごとに 1 本の 50 mL 円錐形チューブにラベルを付けます。</li>
	<li>各50 mL円錐管に70 μmのセルストレーナーを置き、2 mLのBSAバッファーで濡らします。</li>
	<li>プログラムが完了したら、解離器からヒーターとCチューブを取り外します。</li>
	<li>サンプルに4 mLのBSAバッファーを加え、混合物を50 mL円錐形チューブ上のセルストレーナーに塗布します。</li>
	<li>10mLのD-PBSをCチューブに加え、それを閉じ、溶液を穏やかに旋回させる。50mLの円錐管のセルストレーナーに塗布します。</li>
	<li>セルストレーナーとCチューブを捨てます。懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 その後、上澄み液を吸引して廃棄する。</li>
</ol>7. がれきの除去
<ol><li>ペレットを1550μLの冷たいD-PBSで再懸濁し、懸濁液を標識された15mL円錐管に移す。</li>
	<li>450 μLの冷たい破片除去溶液とピペットを上下に加えます(渦を巻かないでください)。 注:破片除去溶液は、市販の成人ブライアン解離キット17の試薬である。</li>
	<li>細胞懸濁液の上に1mLの冷たいD-PBSを静かに重ね合わせ、先端を円錐管の壁に保つ。オーバーレイの合計が 2 mL になるまで繰り返します。 メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。</li>
	<li>3000 x g で4°Cで10分間遠心分離機をフル加速とフルブレーキで行います。 メモ: フェーズが明確に分離されていない場合は、手順 7.2 ~ 7.3 を繰り返します。1000 x g で最終時間を4°Cで10分間遠心分離する。</li>
	<li>サスペンションは3つの異なるレイヤーで構成されるようになります(図3)。最上層を吸引します。ピペットチップを前後に掃引して、白い中間層を吸引します。最下層の層を乱すことなく、中間層をできるだけ多く取り除きます。 メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。</li>
	<li>2 mL の冷たい D-PBS とピペットを上下に追加して混合します。</li>
	<li>1000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキをかけます。上清を吸引して捨てる。ペレットを1mLのBSA緩衝液に再懸濁する。 注:細胞を適切なバッファーに再懸濁し、磁気標識して単離し、この時点で単一細胞シーケンシングに備えます。</li>
</ol>8. セル数
<ol><li>利用可能なセルカウンタの製造元のプロトコルに従ってセルカウントを実行します(1つのオプションは 材料表に記載されています)</li>
</ol>9. 生きた/死んだ汚れ
<ol><li>残りの 900 μL (7.7 から) を 1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。</li>
	<li>サンプルが回転している間は、サンプルごとに1本のフローチューブにラベルを付け、ホイルで包んで光の露出を制限します。</li>
	<li>上清を吸引して捨てる。</li>
	<li>ペレットを50 μLの希釈生/死染み(以前に調製済み)に再懸濁する。 メモ: この手順は、暗い場所で実行する必要があります。これを実現するには、頭上の部屋の照明を消してください。</li>
	<li>各サンプルを対応する標識フローチューブに移し、室温で暗所で8〜10分間インキュベートする(例えば、引き出しまたは箱)。</li>
	<li>500 μL の BSA バッファーを加え、1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。</li>
	<li>上清を吸引して捨てる。 注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。細胞を適切な緩衝液に再懸濁し、ブロックし、この時点で細胞特異的抗体で染色することができる。サンプル・プロトコル18 については、補足ファイル 1 を参照してください。</li>
</ol>10. 固定(オプション)
<ol><li>ペレットを200μLの1%PFA(予め調製済み)に再懸濁する。4°Cで15分間インキュベートする。</li>
	<li>500 μLのD-PBSを加え、300 x g で遠心分離機で4°Cで10分間洗浄します。</li>
	<li>上清を吸引する。 注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。</li>
	<li>ペレットを200 μLのD-PBSに再懸濁し、4°Cで最大3日間保存する。</li>
</ol>11. フローサイトメトリー
<ol><li>新しいチューブのフィルターキャップにラベルを付けます。</li>
	<li>1mLピペットを用いて、各サンプルをフィルターキャップ上にピペットする。</li>
	<li>4 °C で 200 x g で短時間遠心分離し、運転を停止する前に遠心分離機が 200 x g に達するまでだけ許可します。</li>
	<li>下流分析のためにフローサイトメトリーコアに進みます。</li>
</ol>

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著者らは開示するものは何もありません。

この神経解離プロトコルのいくつかのステップは、熟練した技術と器用さ - 灌流、上清吸引、およびミエリン除去を必要とする。灌流プロセスを通して、内臓は無傷のままでいなければなりません(横隔膜を取り除き、心臓をクリッピングすることを除いて)。これには、蝶の針で心臓の上部室を避けることが含まれます。必要なヘパリンを含む生理食塩水の量はさまざまですが、心臓から流れる透明な液体はプロセスが完了したことを示します。脳は完全かつ適切に灌流されなければならず、その時点で脳は白く見えます(図1)。灌流では、赤血球除去ステップは余計なものになり、細胞損失をもたらす可能性のあるサンプルの過剰な操作を排除します。続いて、破片除去工程は、安定した手を必要とする。遠心分離の結果、D-PBSオーバーレイ(図3)の後に明確に定義された層を得るためには、輸送中またはピペッティング中に層が乱されてはなりません。さらに、上の2つの層を吸引するときは、十分な大きさのサンプルを残したまま、過剰な細胞破片を除去するのに十分な懸濁液を除去する必要があります。死細胞...

海馬は、1500年代にボローニャの解剖学者ジュリオ・チェーザレ・アランツィオによって最初に記述されました。この新しく発見された構造に名前を付ける際に、アランツィオはおそらく 海馬1属のタツノオトシゴとの奇妙な類似性に触発されました。海馬はストレス反応に関与していますが、学習と記憶におけるその役割で広く知られています。より具体的には、海馬は、宣言的および空間的記憶1の符号化および検索を担当する。
海馬、または適切な海馬は、CA1(cornu ammonis)、CA2、およびCA3サブフィールド1に分けられます。神経系の他の部分と比較して、海馬は、その可塑性および進行中の神経新生の可能性を含むいくつかのユニークな定義的特徴を有する2。神経新生は、神経幹細胞の増殖および分化のプロセスであり、続いて既存のニューロンネットワークへの統合が続く。神経新生は、歯状回および側脳室(および嗅球)の脳室下帯の顆粒下帯に限定される3。神経新生は胚発生に豊富ですが、それは生涯にわたるプロセスです3,4。したがって、この議論は海馬における成体の神経新生に焦点を当てる。
脳室下および顆粒下帯は、上衣細胞および血管細胞、ならびに神経幹細胞5の未熟および成熟系統を含む神経原性ニッチである。ミクログリアは、神経新生を調節する免疫細胞としてこれらのニッチに寄与する6。神経前駆細胞は、神経幹細胞7の非幹細胞後代である。脳室下帯には3種類の神経前駆細胞が存在する:放射状グリア様B型細胞、C型トランジット増幅前駆細胞、およびA型神経芽細胞3、8。脳室下帯でゆっくりと分裂するB型神経前駆細胞は、急速に分裂するC型細胞8に分化することができる。続いて、C型細胞はA型細胞8に分化する。これらの神経芽細胞は、吻側移動流を通って嗅球に移動し、その後、介在ニューロンまたは希突起膠細胞に分化する9。これらの嗅球介在ニューロンは、嗅覚短期記憶、および連想学習の鍵であり、一方、希突起膠細胞は脳梁9の軸索を髄鞘化する。成体神経新生の大部分は、歯状回亜顆粒帯で起こり、そこでは放射状タイプ1および非放射状タイプ2の神経前駆細胞が見出される3。ほとんどの神経前駆細胞は、歯状顆粒ニューロンおよびアストロサイト10になる運命にある。ギャップ接合部によって接続されたアストロサイトは、可塑性、シナプス活性、およびニューロン興奮性を調節するためにネットワークを形成する5。歯状回の主要な興奮性ニューロンとして、顆粒細胞は嗅内皮質からCA3領域11への入力を提供する。
神経幹細胞集団は、免疫磁気または免疫蛍光単離戦略を用いて単離することができる12、13。神経組織は解離することが特に困難です。そのための努力は、しばしば、細胞生存率の低いサンプルおよび/または下流分析に必要な単一細胞懸濁液の製造に失敗する結果となる。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、または技術の組み合わせを介して行うことができる14、15。神経解離法を評価する研究では、ピペット粉砕による手動機械的解離の生存率および品質を、ピペット粉砕および様々な酵素による消化の組み合わせと比較した15。品質は、調製した懸濁液15中の細胞凝集塊およびDNAまたは細胞内破片の量に基づいて等級付けした。単独で手動機械的解離を行ったグリア腫瘍の懸濁液は、ディスパーゼまたはDNase、コラゲナーゼ、およびヒアルロニダーゼの組み合わせによる処理よりも有意に低い細胞生存率を有していた15。Volovitzらは、異なる方法間の生存率および品質のばらつきを認め、不十分な解離が下流分析の精度を低下させる可能性があることを強調した15。
別の研究では、著者らは培養神経細胞の解離の60以上の異なる方法と組み合わせを比較した14。これらの方法には、ピペット粉砕による手動機械的解離の8つの異なるバリエーション、3つの異なる間隔での5つの個々の酵素とのインキュベーションの比較、および酵素消化による機械的解離の様々な組み合わせ、または2つの酵素の組み合わせ14が含まれていた。いずれの機械的方法も、単一細胞懸濁液14を生じた。4つの単一酵素処理、10の組合せ酵素処理、および4つの組合せの機械的解離と酵素消化は、単一細胞懸濁液14を得た。TrypLEによる酵素消化に続いてトリプシン−EDTAが最も効果的に解離したサンプル14。なお、TrypLEおよび/またはトリプシン-EDTAで処理した試料は、ゼラチン状凝集塊14を形成する傾向があった。この研究は培養細胞に対して実施されましたが、ピペットの粉砕または酵素消化のみの欠点を物語っています。
手動解離と自動機械的解離の並列比較は欠けている。しかしながら、1つのグループはフローサイトメトリーを実行して、市販のパパインまたはトリプシン酵素解離キット16と組み合わせてマウス脳全体の手動および半自動機械的解離を比較した。解離器による処理により、より一貫して生細胞16を得た。解離後、著者らはまた、プロミニン-1細胞、ニューロン前駆細胞、およびミクログリア16を単離した。3つの単離された細胞集団のうちの2つについて、単離された細胞の純度は、サンプルを解離剤で処理したとき、手動の16と比較してわずかに高かった。Reißらは、ピペッティング技術における人的変動が、組織解離における生細胞集団収量の再現性を妨げることを指摘した16。著者らは、自動化された機械的解離がサンプル処理16を標準化すると結論付けた。
この原稿に概説されている解離の方法は、市販の成人脳解離キット17に付随する溶液を使用する、完全に自動化された機械的解離および酵素的消化の組み合わせである。標準的なプロトコルとは異なり、この最適化されたプロトコルは、サンプル操作を減らし、生存率の高い単一細胞懸濁液を生成し、最小限の開始組織を処理することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>02-682-003</td><td>バシックス、アソートカラー</td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>ベクトン・ディキンソン・ラボウェア ヨーロッパ</td><td>352009</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>25 mL 血清ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレン試験管</td><td>ファルコン</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 真空フィルター/ 保管ボトルシステム</td><td>コーニング</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>成人脳解離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp;130-107-677</td><td>酵素P、緩衝液Z、緩衝液Y、酵素A、緩衝液A、破片除去液</td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td>ル フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>抗ACSA-2-PE-Vio770、マウス、クローン REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>抗ミエリン塩基性タンパク質</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>抗PSA-NCAM-PE、ヒト、マウス、ラット、クローン 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue、マウス、クローン REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>CD31 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>セラミックホットプレートスターラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Pharmcoグリーンフィールドグローバル</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン50mL円錐形遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ - シャープ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td>灌流</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD(</td><td></td><td>v10.7.0)</td></tr><tr><td>gentleMACS C チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS オクト ディスソシエーター ヒーター付き</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>フレゼニウス カビ</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能なアクア デッド セル ステイン キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>マグネティック スター バー</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>ノイズ スプリング シザース</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15012-12</td><td>解剖</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-3KG</td><td>プリル、95%</td></tr><tr><td>ピペットチップ GP LTS 20 & マイクロ;L 960A/10</td><td>レイニン</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ GP LTS 250 &micro;L 960A/10</td><td>レイニン</td><td>30389277</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ RT LTS 1000 &micro;L FL 768A/8</td><td>レイニン</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>レイニン ピペット ライト XLS (2, 20, 200, 1000 &mu;L)</td><td>レイニン</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>丸型アイスバケツ 蓋付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>丸底チューブ セルストレーナーキャップ</td>付き <td>ファルコン</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 ピペットフィラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>9541</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ &プローブ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10090-13</td><td>解剖&灌流</td></tr><tr><td>Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"</td><td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td><td>バタフライニードル</td></tr><tr><td>試験管ラック</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>販売終了</td><td>またはその他の標準的な卓上遠心分離機</td></tr><tr><td>可変流量蠕動ポンプ</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>低流量モデル</td></tr><tr><td>マウス用VetFloスターターキット</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td>麻酔マスク、チューブ、誘導チャンバー、チャコールキャニスター</td></tr><tr><td>VetFlo 気化器 シングルチャンネル麻酔システム</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>VetFlo-1210S</td><td>0.2&ndash;4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer</td><td>ベックマン・コールター ライフサイエンス</td><td>731196</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR サンプルバイアル4袋</td><td>ベックマン・コールター ライフサイエンス</td><td>383721</td><td>細胞計数</td></tr></tbody></table>

マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

この神経解離プロトコル(市販の成人脳解離キットに付随するプロトコルの適応)は、フローサイトメトリーや単一細胞シーケンシングなどの詳細な下流分析の準備として組織処理を最適化します。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、またはそれらの組み合わせを介して行うことができる。神経細胞の繊細な性質は、単一細胞分析に必要な最小限の細胞破片で、生存率の高い真の単一細胞懸濁液を得るための努力を複雑にする可能性があります。このデータは、自動化された機械的解離と酵素消化のこの組み合わせが、前述の困難を克服し、常に生存率の高い(>90%)単一細胞懸濁液を生成することを実証する。いくつかのステップでは手作業による器用さが必要ですが、これらのステップはサンプルの取り扱いと潜在的な細胞損失を軽減します。この原稿では、下流の分析に備えて少量の神経組織を首尾よく解離させるために他の研究室を装備するためのプロセスの各ステップを詳述しています。

サンプルをコア施設でフローサイトメーターで処理し、得られたデータをフロー分析用のソフトウェアパッケージで評価しました。以前は、補正コントロール(ライブ/デッドシミとネガティブコントロール)が分析されていました。複数の蛍光色素を使用する場合は、蛍光マイナス1(FMO)コントロールとシングル染色コントロールを抗体ごとに調製する必要があります。実験サンプルについてのスペクトルオーバーラップの補償は、分析された対照に基づいて計算した。細胞集団の同定のために、階層的ゲーティング戦略が使用された。一次ゲートは、前方散乱(セルサイズ)対側散乱(粒度)プロット19、20において破片を除外した。続いて、死細胞を除外した(図4、図5、図6、補足図1、補足図2、補足図3、および補足図...

この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

少量の神経組織の解離に成功すれば、ラボは治療の有効性、細胞機能、疾患や治療の作用機序に関する構造特異的な洞察を得ることができます。この神経解離プロトコルは、一貫して、非常に生存可能で実際の単一細胞懸濁液をもたらす。さらに、市販のキットが意図しているもののほんの一部にすぎないサンプルを処理できます。適切な計画と準備は、この手法を成功に導くための鍵です。プロトコルに慣れるためにいくつかの練習ラウンドを実行することは有益です。生後6ヶ月の雌性C57BL/6Jマウスに麻酔をかけた後、下腹部をつまみ、鉗子で皮膚を持ち上げます。その後、はさみを使用して、毛皮と皮膚を胸郭の底に切り込みます。胸郭の下から始まり、各肩に向かって移動する2つの斜めの切開を行います。その後、横隔膜と胸郭を慎重に切除して心臓を露出させます。心臓の周りの結合組織を慎重に取り除いた後、はさみを使って右心房をクリップします。その後、ブリーザーへのイソフルランの流れをオフにします。鉗子で心臓をしっかりと保持し、蝶の針の斜めを上に向けて、針を水平に保ちながら左心室を突き刺し、動物と平行にします。次に、針を所定の位置に保持し、ポンプをオンにし、心臓を離れる流体が不透明になり、肝臓および肺の色が薄くなるまで、少なくとも30ミリリットルの生理食塩水またはヘパリン溶液を灌流する。灌流後、ポンプをオフにし、針を外し、マウスを解剖領域に移す。斬首後、頭の後ろから目まで毛皮を切り取り、皮膚を剥がして頭蓋骨を露出させます。次に、頭蓋骨を目の間にクリップし、頭蓋骨の後ろに10時と2時の位置で2つの切り傷を作ります。次に、頭蓋骨の矢状線に沿って目の間の元の切り傷まで1つの長い切り傷を作ります。次に、鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの半分を側面に剥がします。その後、ヘラを使用して脳を取り除き、冷たいDPBSで満たされた60ミリメートルのガラスペトリ皿に入れ、氷の上に保ちます。メスまたはカミソリを使用して、各半球を分離し、嗅球と小脳を取り除きます。その後、海馬が露出するまで中脳を取り除きます。次に、鉗子で脳を固定します。次に、2組目の鉗子を使用して、各半球から海馬を優しくいじめます。両方の海馬を冷たいDPBSを含むラベルの付いた1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。鉗子を使用して、海馬組織片をCチューブに移し、30マイクロリットルの酵素ミックス2をチューブに加える。キャップをひねり、カチッと音がするまで締め付けた後、チューブを解離器に入れ、適切なプログラムを実行します。プログラムの実行中に、50ミリリットルの円錐形チューブの上に置かれた70ミクロンのセルストレーナーを2ミリリットルのBSAバッファーでプリウェットします。解離プログラムが完了したら、解離した組織に4ミリリットルのBSAバッファーを加え、50ミリリットルの円錐管上の細胞ストレーナーを通して混合物をろ過する。次に、10ミリリットルのDPBSをCチューブに加えます。その後、チューブを閉じ、溶液を静かに旋回させ、50ミリリットルの円錐形チューブ上のセルストレーナーを通して濾過する。濾過した細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を捨て、ペレットを保管する。破片を除去するには、ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいDPBSで再懸濁し、懸濁液をラベル付き50ミリリットルの円錐形チューブに移す。次に、450マイクロリットルの冷たい破片除去溶液とピペットを上下に加えます。細胞懸濁液を1ミリリットルの冷たいDPBSで静かに重ね合わせ、先端を円錐管の壁に保ちます。オーバーレイの合計が 2 ミリリットルになるまで、この手順を繰り返します。次に、懸濁液を3,000倍のGで10分間遠心分離し、完全な加速と完全なブレークを行います。最上層を吸引し、ピペットチップを前後に掃引して白い中間層を吸引します。最下層の層を乱すことなく、中間層をできるだけ多く取り除きます。次に、2ミリリットルの冷たいDPBSとピペットを上下に追加して混合します。その後、懸濁液を1,000倍のGで10分間遠心分離し、完全な加速と完全なブレークを行います。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルのBSA緩衝液に再懸濁する。細胞計数後、残りの細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを50マイクロリットルの希釈生死染色液に再懸濁する。次いで、試料を標識されたフローチューブに移し、暗所で室温で8〜10分間インキュベートする。インキュベーション後、500マイクロリットルのBSAバッファーを加え、遠心分離工程を繰り返す。その後、上清を捨て、チューブに少量の緩衝液を残します。一次ゲートは前方散乱対側散布図の破片を除外し、その後死細胞は除外した。第2のゲートは、ミエリン塩基性タンパク質に対して陽性の細胞を除外した。そして残りの細胞のうち、各蛍光色素に対して陽性の細胞の密度プロットが作成された。各神経細胞集団の頻度は、第3ゲート外で計算した。手動機械的解離および酵素消化で処理されたサンプルは、目的の細胞集団が実質的に低かったのに対し、自動機械的解離および酵素消化で処理された新鮮および固定サンプルの両方が、目的の細胞集団の数倍高いことを示した。灌流と破片の除去手順は最初は困難な場合がありますが、滑らかで安定した手を維持することは成功を確実にするのに役立ちます。

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

特定の組織型から解離し細胞が組織aggitationのための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS...

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

このビデオは、自動化された機械的解離と酵素の混合物を組み合わせて酵素消化を助けることにより、マウスの脳海馬から生存率の高い単一細胞懸濁液を得るためのプロトコルを示しています。...

マウス海馬組織からの単一細胞懸濁液の取得

このビデオは、磁気細胞ソーティングを使用してマウス脳の脱髄病変からミクログリア細胞を抽出するためのプロトコルを示しています。このプロトコルは、ミクログリア細胞を含む病変のある脳組織を解剖し、特定の酵素で組織を処理して単一細胞懸濁液を取得し、ミクログリア受容体特異的磁気ビーズを利用してミクログリア細胞を単離することを含みます。...

磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

このビデオは、ニューロン、星状細胞、ミクログリアなどのラット海馬から細胞を分離するプロトコルを示しています。...

ラット海馬から種々の神経細胞集団を得る

このビデオは、孤立した海馬におけるリズミカルなニューロンネットワーク活動、別名シータ振動の記録を示しています。電極は、シータ振動を検出および分析するために、さまざまな層と空間位置に挿入されます。これは、海馬の異なる層にわたるニューロンネットワークのユニークなニューロン組成と接続性を示しています。...

マウス海馬におけるシータ振動のin vitro記録

虚血性細胞死経路を研究するための性層別ニューロン培養

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。...

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。...

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

本プロトコルは、成体マウスから初代海馬ミクログリアを単離し精製する方法を説明し、続いて、これらの急性に単離された細胞の全細胞パッチクランプ記録を実施するための指示が続きます。...

成体マウスからの海馬ミクログリアの単離と全細胞パッチクランプ記録

学ぶマウス脳海馬組織の機械的・酵素的解離法。少量の神経組織から高生存率の単一細胞懸濁液を調製し、細胞機能と治療効果の構造特異的解析を可能にする。

マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

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