モスキートAedes aegyptiにおける高解像度メルト分析を用いたCRISPR/Cas9突然変異誘発に続くインデル検出
2021年9月10日
この記事では、CRISPR/Cas9によって誘導されるインデルの迅速な同定と、高解像度の溶融分析を用いた蚊 Aedes aegypti の突然変異線の選択のためのプロトコルについて詳しく説明します。
このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術によって生成された変異体を多数の個人から検出する非常にシンプルで効率的な方法です。この技術の2つの主な利点は、それが数時間で行うことができることと、それが多数の生物に適用できることです。プライマー設計は、特定の遺伝子に対して挑戦的であり、複数のプライマー設計と検証がHRMAを効率的にするために必要とされる場合がある。
勾配 PCR を実行するには、マスター ミックスを準備して開始します。次に、非テンプレートコントロール用のマスターミックスの19マイクロリットルまたは96ウェルプレートのNTCを取り除きます。次に、残りのマスター ミックスにテンプレートを追加します。
サンプルのアリコート20マイクロリットルは、96ウェルプレートに混合する。サイクリングパラメータに従ってPCRを実行し、原稿に記載されているパラメータを使用して熱溶融プロファイルを生成します。必要な材料をすべて集めた後、0.5マイクロリットルのDNA放出試薬と20マイクロリットルの希釈バッファーを遺伝子型にしてマスターミックスを調製します。
マルチチャネルピペットを使用して、20マイクロリットルの混合液をPCRプレートに組み込み、PCRプレートを氷の上に残します。次に、麻酔したG1蚊をガラスのペトリ皿に入れて鎮静させ、2番目のペトリ皿に8匹の野生型蚊を入れます。70%エタノールでピンセットのペアを拭き、消毒されたピンセットを使用して蚊の後ろ足の1つを取り除きます。
次いで、DNA放出試薬溶液中に脚を沈下する。対応するバイアルに蚊を入れ、スポンジでバイアルを閉じます。完了したら、ピンセットを70%エタノールで拭き取ってから、次の蚊から脚を取り除き、96ウェルプレートが完成するまで進みます。
その後、プレートを光学PCRプレートシールで密封し、脚を含むPCRプレートを室温で2〜5分間インキュベートし、続いて摂氏98度で2分間インキュベーションします。プレートを室温まで冷却します。PCRの場合は、好ましい成分を含むマスターミックスを準備し、マルチチャンネルピペットを使用して、マスターミックスの19マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに転送します。
以前に調製した蚊のDNAを含むDNA放出溶液の1マイクロリットルをプレートに移し、光学PCRプレートシールでプレートを密封する。適切なサイクリングパラメータを使用してPCRを実行し、原稿に記載されているパラメータに従って熱溶融プロファイルを生成し、次に野生型制御を参照クラスタに割り当てることで溶融プロファイルを調べます。96 ウェル テンプレートで、対応する色を使用して異なるクラスターをマークします。
次に、目的の曲線を持つ個人を選択し、選択した個人をチューブから取り除き、クロスを戻します。血液はそれを女性にし、続いてG2Aを採取した。代表的な分析では、Aedes aegyptiのZIP11変異体の配列解析が示されている。
Aedes aegypti ZIP11ヘテロ接合体からのエレクトロフェログラムは、インデルが発生したヌクレオチド位置を示した。インデルは、多形の位置が両方のヌクレオチドを併発して示すように、単一から二重のピークへのシフトによって表される。実行の最後に、削除または挿入された基本ペアの数は、単一のピークをカウントして計算されました。
Aedes aegypti ZIP11およびmyo-fem遺伝子に変異を含む蚊は、HRMAの高解像度メルト分析を用いて遺伝子型および配列化が検証された。サンプルの蛍光シグナルを1~0の相対値に正規化した。さらに、各曲線を野生型の参照から差し引き、対応する倍率を示しました。
グループ間で適切な区別が行われなかった代表的な結果には、失敗した自動クラスター割り当てが表示されます。また、各試料を個別に分析し、ヘテロ接合量、ホモ接合体、およびトランスヘテロ接合体のサンプルを参照する類似性に基づいて正しいグループに割り当てた。HRMを行った後、突然変異した個体からのDNAのシーケンシングは、インデルを分析し、標的配列内の他の突然変異を同定するために必要である。
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概要
本記事では、高解像度融解分析（High-Resolution Melt Analysis）を用いて、蚊の Aedes aegypti における CRISPR/Cas9 導入によるインデル（挿入・欠失）を迅速に同定し、変異系統を選別するためのプロトコルを詳しく説明します。この手法は効率的であり、さまざまな生物種に適用可能で、変異体の迅速な検出を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝学
- 分子生物学
- 昆虫学
背景
- CRISPR/Cas9技術は、遺伝子編集に広く利用されています。
- 変異を効率的に同定することは、遺伝学的研究において極めて重要です。
- 高解像度融解分析（HRMA）は、迅速な検出手法を提供します。
- プライマー設計における課題が、HRMAの効率に影響を及ぼす可能性があります。
研究の目的
- CRISPR誘発変異を同定するためのプロトコルを提供する。
- さまざまな生物におけるHRMAの適用可能性を実証する。
- 変異株の選抜プロセスを効率化する。
使用方法
- PCR用マスターミックスの調製。
- 96ウェルプレートにおけるノンテンプレートコントロール（NTC）の使用。
- 条件最適化のためのグラジエントPCR。
- インデル検出のための高解像度融解曲線分析（HRM分析）。
主な結果
- このプロトコルにより、変異体の迅速な同定が可能になります。
- HRMAは数時間で完了させることができます。
- 効率を高めるために、プライマー設計を複数回繰り返す必要がある場合があります。
- 本手法は、異なる種にわたって汎用的に利用可能です。
結論
- このプロトコールにより、変異体検出の効率が向上します。
- 蚊の遺伝学研究において有用なツールとなります。
- 今後の研究において、この手法を基にさらに幅広い応用が期待できます。
よくある質問
産業界における重要性
CRISPR/Cas9によって誘発されたindels（挿入・欠失）を迅速に検出することで、ベクター制御研究における効率的なターゲット検証が可能となり、機能遺伝子研究の期間を短縮できます。高解像度融解分析（High-resolution melt analysis）を用いれば、個体を犠牲にすることなくスケーラブルなジェノタイピングが可能となり、その後の表現型解析や遺伝的交雑を促進できます。この手法は、最小限の組織サンプルから定量的な変異検出を可能にすることで、初期探索における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：CRISPRによる変異導入後の迅速なindel検出を通じて、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用上の価値：個体を犠牲にすることなく変異アレルを特定できるため、生物学的なリスク低減を支援し、後続のアッセイに向けてサンプルを保存できます。
- ポートフォリオへの影響：ターゲット検証のワークフローを加速させ、疾患関連システムにおける遺伝子ターゲットの優先順位付けを迅速に行うことができます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 野生型および変異型遺伝子型の定量的な比較を可能にする、正規化された蛍光融解曲線を作成します。
- 運用的価値： 96ウェルプレート形式に対応しており、編集個体の中スループットスクリーニングをサポートします。
- アッセイの準備状況： ヘテロ接合体、ホモ接合体、およびトランスヘテロ接合体で区別可能な融解プロファイルを生成し、信頼性の高いクラスター割り当てを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性：ジェノタイピングに続いてフェノタイピングや吸血を行うことができ、疾患モデルにおける遺伝子改変と機能的結果を関連付けることが可能です。
- メカニズム的なリスク低減：後続のシーケンシングによるインデル解析を容易にし、オンターゲット効果の確認および潜在的なオフターゲット改変の特定を可能にします。
- 前臨床モデルの支援：アルボウイルスの伝播研究における主要な媒介生物であるAedes aegyptiにおける変異株ラインの確立を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、CRISPRによる変異導入からリード化合物の同定に至る発見の連続的なプロセスに組み込まれており、機能的な検証を行う前のジェノタイピングのチェックポイントとして機能します。
- 探索生物学：標的パスウェイにおける遺伝子機能を損なうインデルを迅速に特定することで、仮説検証を支援する。
- スクリーニング：正規化された融解曲線分析とリファレンスベースのクラスタリングを通じて、アッセイの標準化を可能にする。
- 解析：インデルサイズと相関する定量的な融解プロファイルシフトを生成し、サンプル間の比較解析を可能にする。
- トランスレーショナルリサーチ：ジェノタイピング後の生体への適用を可能にすることで、遺伝子改変と表現型評価を的に結びつける。
- 汎用的な再利用：プライマー設計の適応性により広範な標的に適用でき、さまざまな生物種や遺伝子にわたって再利用可能である。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 遺伝子編集の結果を直接的に証明することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高めます。
- 運用上の価値： コントロールを組み込んだ標準的なPCRおよび融解曲線分析プロトコルにより、再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 変異体のスクリーニングに要する時間とリソースを削減し、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 表型解析に投資する前に変異の存在を確認することで、リスク調整済みの研究推進を可能にします。
実施上の注意点
- 効率的なHRMAを行うために、特定の遺伝子では設計を複数回繰り返す必要があるため、プライマー設計と最適化の専門知識が必要です。
- 高解像度融解分析のためには、精密な温度ランプ制御と蛍光検出機能を備えた装置への依存度が高くなります。
- 入力品質を一定に保つため、脚組織とDNA放出試薬を用いた標準的なサンプル調製が必要です。
- 正確なクラスター割り当てと融解プロファイルの正規化には、野生型リファレンスサンプルが必要です。
- インデルを完全に特性解析し、標的配列内のさらなる変異を検出するには、HRMA後のシーケンシングが必要であるという制限があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
