Name: スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶレポーターベースの細胞アッセイを用いたスプライシング効率の監視法。HeLa細胞で疾患関連スプライスサイト変異の影響を評価し、治療的U1 snRNAによるスプライシング欠損の回復方法を確立する。

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この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)および米国癌協会(Institutional Research Grant 74-001-34-IRG)からのS.S.およびW..Mへの資金と、Valley Research Partnership Program(P1-4009およびVRP77)からのS.S.およびW.への資金によって支援された。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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著者らは開示するものは何もありません。

このアッセイは、HeLa以外の細胞株におけるスプライシング分析に適合させることができますが、細胞のコンフルエンシーやDNAの量など、トランスフェクション効率に影響を与える要因を最適化する必要がある場合があります。レポーター対U1構築物比は、他の細胞型で観察される発現レベルに応じて決定する必要があるかもしれない別の重要なパラメータである。抽出されたRNAの品質は、スプライシング分析にとって非常に重要です。したがって、RNaseフリーの水を使用し、RNase不活性化剤による表面の除染を強くお勧めします。
プライマー伸長または蛍光RT−PCRのいずれかによるレポーター転写産物の分析は、同様の結果をもたらし、したがって、成熟転写産物中のエクソン2の包含の変化をモニターするために、いずれの技術も採用することができる。蛍光PCR反応は、初期RNA濃度に依存する増幅の指数関数的な段階で停止し、定量する必要があります。したがって、増幅サイクルの数は、ここで記載したものとは異なるトランスフェクション条件を有するアッセイのために決定されなければならないかもしれない。非放射性の性質による使いやすさは、R...

プレmRNAスプライシングは、非コードイントロンを除去し、コードエクソンを正確にライゲーションして成熟mRNAを形成する重要なプロセシングステップです。5'-スプライス部位および3'-スプライス部位と呼ばれるエクソン-イントロン接合部におけるコンセンサス配列の認識は、スプライシング機構の構成要素によって開始される。U1小核リボヌクレオタンパク質(snRNP)は、U1 snRNAとプレmRNA1との塩基対形成によって5'-スプライス部位を認識する。5'スプライス部位配列を変化させる遺伝的に遺伝する変異は、多くの疾患と関連している2,3。U1 snRNAと変異型5'スプライス部位との塩基対形成が失われると、異常なスプライシングが発生し、影響を受ける転写産物の翻訳が損なわれる可能性があると予測されています。スプライシング欠損を補正するための潜在的な治療的アプローチは、5'-スプライス部位と塩基対するその5'-領域に代償性ヌクレオチド変化を有する修飾U1 snRNAによる変異の抑制を含む。エクソン特異的U1 snRNAとも呼ばれるこのような修飾U1 snRNAは、スプライシング欠陥を逆転させるのに有効であり、救助されたmRNA4、5、6、7、8からのタンパク質発現の増加をもたらすことが見出されている。
ここでは、エクソンのスプライシングに対する5'-ss変異の効果の評価を可能にし、エクソンインクルージョンのレスキューを可能にする修飾U1 snRNAの開発にも使用できるレポーターベースの細胞スプライシングアッセイであるU1 snRNP相補アッセイについて説明します。また、プライマー伸長およびRT-PCRによるスプライシングされたレポーター転写産物のモニタリング、およびプライマー伸長およびRT-qPCRによる修飾U1 snRNAの発現を決定するためのプロトコルも提供しています。

<table><tbody><tr><td>試薬グレード 脱イオン水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート (DEPC)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (DMEM) パウダーパケット</td><td>ギブコ</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS),オーストラリアのソース、熱不活化</td><td>オメガサイエンティフィック</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、標準溶液1.0N</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>塩酸、認定ACSプラス、36.5〜38.0%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てPESボトルトップフィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩二水和物</td><td>アムレスコ</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2.5%トリプシン(10x)、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-212</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>二ナトリウムリン酸水素七水和物</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP332-1</td><td></td></tr>カリウム<tr><td>リン酸二水素</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション媒体 - Opti-MEM&trade;I 還元血清中、フェノールレッドなし</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Transfection 試薬 - Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade;試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム(防腐剤として約0.75%エタノール/分子生物学)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対(200プルーフ)、分子生物学グレード、フィッシャーバイオ試薬、フィッシャーバイオ試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr> サーモ<tr><td></td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除豆 -セファデックス&reg;G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>サイズ排除ミニカラム</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>低分子量マーカー、10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 不活性化試薬 - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM ea)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade;組換えリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>逆転写酵素 - M-MLV 逆転写酵素</td><td>プライマー伸長に使用される</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー (50 &micro;M)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRミックス - SYBR&trade;「Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript」を選択&trade;cDNA調製に使用されるIII逆転写酵素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr>ジ<tr><td>チオスレイトール(DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X First-Strand Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド(&ge;99.5%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP228-100</td><td>レビュー 製品安全データシート</td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルーナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース (白色結晶または結晶性粉末/分子生物学)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸 (結晶/電気泳動)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr>アクリル<tr><td>アミド:ビスアクリルアミド19:1(40%溶液/電気泳動)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>レビュー製品安全データシート</td></tr><tr><td>尿素(無色から白色の結晶または結晶性粉末/分子バイオル)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキソ二硫酸アンモニウム (APS) &ge;98%、プロピュア、プロテオミクスグレード</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED) &GE;99%、超高純度</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>レビュー材料安全データシート</td></tr><tr><td>調整可能なスラブゲルシステム、Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>垂直ゲルラップ&貿易;ガラスプレートセット、16.5 x 14.5cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>垂直ゲルラップ&貿易;ガラスプレートセット、16.5 x 22.0cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>垂直ゲルラップ&貿易;ガラス板セット、16.5 x 38.7cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GEストレージ蛍光体スクリーン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade;FLA 7000 生体分子イメージャー</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 液体シンチレーションカウンター</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

遺伝子発現中、プレmRNAスプライシングの重要なステップは、スプライス部位の正確な認識と、成熟mRNAの細胞質的輸出前にエクソンを結合し、イントロンを除去するためのスプライソソーム複合体の効率的な組み立てを含む。スプライシング効率は、スプライス部位における変異の存在、トランス作用型スプライシング因子の影響、または治療薬の活性によって変化させることができる。ここで、任意の所与のエクソンのスプライシング効率をモニターするために適用することができる細胞アッセイのためのプロトコルを記載する。アッセイは、3-エクソン/2-イントロンミニジーンレポーターにコードされる適応性プラスミドを使用し、これは一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞で発現させることができる。トランスフェクション後、全細胞RNAが単離され、レポーターmRNAにおけるエクソンスプライシングの効率は、プライマー伸長または半定量的逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のいずれかによって決定される。我々は、5'スプライス部位変異に関連する疾患の影響が、レポーターにそれらを導入することによってどのように決定され得るかを記述します。これらの変異の抑制が、プレmRNAのエキソン-イントロン接合部の5'-スプライス部位と塩基対する5'領域に代償性変異を有するU1小型核RNA(snRNA)構築物との同時トランスフェクションによって達成され得る方法。したがって、レポーターは、変異体5'スプライス部位の認識を改善するための治療用U1粒子の設計に使用することができる。スプライシングエンハンサーまたはサイレンサー配列などの シス作用調節部位のレポーターへの挿入は、特定の選択的スプライシング因子によって媒介される調節におけるU1 snRNPの役割を調べるためにも使用され得る。最後に、レポーター発現細胞を小分子と共にインキュベートして、構成的プレmRNAスプライシングまたは変異体5'スプライス部位を有するエクソンに対する潜在的な治療薬の効果を決定することができる。全体として、レポーターアッセイは、基本的なスプライシングメカニズムおよびスプライシング関連疾患を研究するために、様々な条件下でのスプライシング効率をモニターするために適用することができる。

スプライシングレポーターDup51は、3つのエクソン−2イントロンミニ遺伝子であり、ヒトβグロビン遺伝子に由来し、以前に記載した(図1A)11、12。我々は、プロトカドヘリン15(PCDH15)遺伝子のエクソン3に生じる5'-スプライス部位変異に関連するアッシャー症候群を導入することにより、変異レポーターDup51pを作成した13。エクソン2-イントロン2接合部における5'-スプライス部位配列をCAG/GUGUGUAUCからAUG/GUGUGUAUC(/はエクソン-イントロン境界)に変更した(図1B)14。これらの配列変化は、内因性U1 snRNAとの5'-スプライス部位の塩基対形成の予測パターンを変化させ、成熟転写産物中のエクソン2のスキップももたらします(<strong class="x...

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1 snRNA構築物をHeLa細胞で発現させ、スプライシングをプライマー伸長またはRT-PCRによって分析する。

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

このプロトコルは、適応可能な管理レポーターを使用して、スプライシング効率を監視するための細胞アッセイを記述します。このレポーターアッセイは、エクソンまたはスプライス部位における疾患関連変異の影響を研究し、5点スプライス部位への変異体の認識を改善するための治療、特に1つの粒子を設計するために使用することができる。Hela細胞での継代は、使用済み培地を吸引し、1ミリモルのEDTAを含む中で0.2 5%トリップの3ミリリットルで細胞を摂氏37度で3分間インキュベートする。7ミリリットルの新鮮なDMEMでインキュベートした後、細胞懸濁液を10ミリリットルのチューブに移した。細胞を遠心分離する。次いで、細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮なDMEMに再懸濁し、一過性トランスフェクションのために、20%コンフルエントで新しい組織培養皿上に細胞をプレートする。きれいな血液細胞計スライドでヘラ細胞を数え、1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞に2.5倍の密度の懸濁液を調製し、1ミリリットルの細胞懸濁液を12ウェルプレートの各ウェルにシードし、摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、使用済み培地を吸引し、血清を含む800マイクロリットルの新鮮なDMEMをプレートに加える。トランスフェクションミックスを準備し、それらを15秒間渦巻きます。その後、混合物を遠心分離し、室温で5分間インキュベートする。インキュベーション後、トランスフェクションミックスの200マイクロリットルすべてを12ウェルヘラ細胞プレートの1ウェルに加え、ウェルあたり1ミリリットルの最終容量を達成し、プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。調製した標識化反応をインキュベートする。分画サイズの25キロダルトン分子量排除ビーズを10秒間穏やかにボルテックスすることによって再懸濁する。次に、再懸濁ビーズ600マイクロリットルを使い捨てミニカラムに移し、1.5ミリリットルの収集チューブに入れ、ビーズストックを摂氏4度に戻した。カラムを遠心分離し、カラムを通る流れを捨てます。次いで、カラムに300マイクロリットルのRNA遊離水を加えてビーズを2回洗浄する。2回目の洗浄後、ミニカラムを新しい1.5ミリリットルの遠沈管に移し、キナーゼ反応ミックスをカラムに加えます。カラムを遠心分離し、P32標識オリゴヌクレオチドを含むフロースルーを回収する。ヘリ細胞から抽出した2マイクログラムのRNAを200マイクロリットルのマイクロ遠心管に加え、RNA遊離水を加えて体積を6.55マイクロリットルにする。次に、RNAサンプルを含む各PCRチューブにマスターミックスを1本ずつ0.9マイクロリットル加え、まずチューブを摂氏65度で5分間、次に氷上で1分間インキュベートします。次に2.55マイクロリットルで、マスターミックス2本、RNA及びマスターミックス1本を含む各チューブに対し、チューブを室温で10分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブをサーマルサイクラーに移し、まず摂氏50度で60分間、次に摂氏70度で15分間インキュベートする。インキュベーション後、各サンプルに10マイクロリットルの2倍ホルムアミドRNAローディング色素を添加し、UIAページによってフラグメントを分離する作業に進む。パーシーDNA合成。形質移入ヘラ細胞から抽出した2マイクログラムのRNAを200マイクロリットルのマイクロンシマウジターチューブに加え、RNAの自由水を加えて体積を11マイクロリットル以下にする。次に、2マイクロリットルを加え、マスターミックスを各サンプルに1つずつ加え、まず摂氏65度で5分間、次に氷上で1分間インキュベートする。次に、7マイクロリットルを加え、マスターミックスを各チューブに2本ずつ加え、チューブを室温で10分間インキュベートし、続いて摂氏50度で60分間、摂氏70度で15分間インキュベートした。次に、PCRのためにC DNA反応を希釈して1マイクロリットルあたり100ナノグラムの濃度を得、各cDNAサンプルの1マイクロリットルを新しいPCRチューブに移した。CDNAを含む各チューブに10.5マイクロリットルのマスターミックスを加え、PCRを行う。PCRが完了したらサーモサイクラーを使用した。12.5マイクロリットルの2倍ホルムアミドDNAローディング色素を各チューブに加える。サンプルを摂氏 95 度で 5 分間加熱し、UIA ページの実行に進みます。5マイクロリットルの希釈CDNAを96ウェルqpcrプレートの個々のウェルに3連のピペットで移す。次に、各ウェルに10マイクロリットルのリアルタイムPCRミックスを加え、プレートを光学フィルムで密封し、遠心分離機でウェルの底部への反応を収集し、次いで標的アンプリコンの閾値定量サイクル値を収集しながらqpcrを行う。マーカーとサンプルをロードする前に、TBEバッファーでウェルを洗い流し、落ち着いた尿素を除去します。次いで、ウェル当たり各サンプルの10マイクロリットルをロードし、ゲルを300〜500ボルトで2〜3時間、またはキシレンが底に達するまで実行した。電気泳動後、電気泳動装置からガラス板を取り出し、ゲルがいずれかのガラス表面に平らになるように2枚のプレートを慎重に分離し、次いでゲルを濾紙上に移し、プラスチックラップで覆い、ゲル乾燥機を用いてゲルを摂氏80度で30分間真空乾燥させ、 次いで、乾燥ゲルを蛍光体画像化カセット中に置き、室温で一晩インキュベーションする。ヘラ細胞で発現させると、スライスレポーターdup 51ミニジャンは、エクソン2が効率的にスプライシングされた成熟全長転写産物を発現する。5つのプライムスプライス部位変異およびdup 51Pは、エクソン2つの包含を95%から30%に減少させ、より短い転写産物の形成をもたらす。U15A SNRNAとのdup 51 Pの共発現は、エクソンの2つのスプライシングを救助し、そして全長転写産物の形成を回復させる。対照的に、野生型U1またはU15G変異体との共発現は、dup 51Pスプライシングに対して同様の効果を有しない。U15A変異体転写産物の検出は、一次拡張により、U1 SNRNAの第5位のアデニンに近い20ヌクレオチド長および塩基対である7〜26個のオリゴヌクレオチドのU1を使用する。DATP単独の存在下で、U1 7〜26は、内因性の野生型U1 SNRNAに対して2〜3ヌクレオチドを組み込むことを可能にする、22または23ヌクレオチド長の産物を生じる。U15AおよびU15G変異体の場合、伸長は単一のアデノシンを付加した後に終了し、21ヌクレオチド産物を産生する。U2 SNRNA発現への正規化後、トランスフェクトされたU1野生型U1 5gおよびU15A変異体は、内因性SNRNAにわたって3〜5倍で発現した。抽出されたRNAの品質は、スプライシング分析にとって非常に重要です。したがって、RNAフリーウォーターの使用、およびRNA不活性化剤によるサービスの除染を強く推奨する。ここで説明する報告システムは、改変型U1SN RNAを用いた遺伝子サイレンシングに対するフラッシュプライススプライシング変異の逆転効果に対するスプライシング規制におけるU1 SN RNAの役割の研究に応用することができる。

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

堅牢な、小規模のHeLa細胞核抽出物を調製するためのプロトコルが記述されています。このプロトコルはそのような薬剤又はRNAi処理した細胞などの細胞の小集団の使用を必要とするアッセイのために貴重なものです。方法は、患者の細胞を含む遺伝子発現アッセイおよび他の細胞さまざまな種類のに適用する必要があります。...

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

タンデムスプライシングイベントは、12ヌクレオチド未満の場所で発生します。このようなスプライスバリアントの比率を定量化することは、絶対定量PCRアプローチを使用して実現可能です。この原稿では、2つのスプライシングイベントがSerine-701の包含/排除およびα/β...

STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス...

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

SINEUPs は、合成アンチセンス非コード Rna 結合ドメイン (BD) とエフェクター ドメイン (ED) 含みの翻訳を調整するターゲット mRNA。ここでは、培養細胞、西部のしみ方と半自動化されたハイスループット イメージング システムによって翻訳推進活動の分析の SINEUPs の検出方法について述べる.

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

銅成長アッセイであるACT1-CUP1アッセイは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)スプライシングと、変異体スプライシング因子がスプライソソーム機能に与える影響を迅速に読み取ることができます。この研究はプロトコルを提供し、関心のあるスプライシングの問題に対処するために可能なカスタマイズを強調しています。...

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。...

ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

学ぶレポーターベースの細胞アッセイを用いたスプライシング効率の監視法。HeLa細胞で疾患関連スプライスサイト変異の影響を評価し、治療的U1 snRNAによるスプライシング欠損の回復方法を確立する。

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

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