電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

脂質単層は、末梢膜タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として、そして可溶性タンパク質として長年にわたって使用されてきました。この方法は、いくつかの一体性膜タンパク質として、2D結晶化にも適用することができる。しかし、脂質単層への分割を促進するために、洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。

空気水界面に脂質単層が形成され、脂質の極性ヘッド基が水相で水和したままとなるようである。そして、空気水界面への脂質仕切りの非極性アシルテールは、表面張力を破り、水面を平らにします。脂質ヘッド基の特徴的な化学部分が電荷性質により、溶液中のタンパク質に対する親和性を提供します。

結合を促進し、原則として2Dアレイ形成を行う。脂質単層上に形成された任意の2D結晶は、脂質層上の結晶アレイを持ち上げ、支持するために使用される炭素被覆EMグリッド上の電子顕微鏡に容易に移すことができる。この原稿では、極低温電子顕微鏡イメージングのための脂質単層方法論について述べた。

脂質単層製剤。脂質ストック調製物は、1ml当たり0.01mgを、クロロホルム、メタノールの体積に9:1体積で調製する。8.91 mlのクロロホルムと0.99 mlのメタノールと0.1 mlの1mlの脂質溶液を使用した。

テフロンプレート調製。メタノールバスでテフロンプレートを5分間超音波処理します。お湯で15分洗い、蒸留水で洗い流します。

テフロンプレートを乾燥させて30分間乾燥させ、使用するまで真空状態に保ちます。緩衝槽上の脂質単層の形成推定運転時間は1時間半です。

ペトリ皿にタイプ1のフィルターペーパーを入れ、濾紙の上にテフロンブロックを並べます。テフロンプレートのウェルに60マイクロリットルのバッファーを充填します。慎重にバッファー表面のドロップの上に液体混合物を追加します。

理想的には、ハミルトンシリンジを使用して1滴あたり1マイクロリットル。フィルターペーパーを蒸留水で濡らし、ペトリ皿の湿度を保ちます。室温で60分間インキュベートすると、クロロホルムが蒸発し、バッファーの表面に脂質の単層が形成されるべきである。

脂質単層上のEMグリッドの適用推定運転時間 1 時間半。各バッファーリザーバーの表面にカーボンサイドを排出するグローなしで、カーボンコーティングされたEMグリッドを穏やかに配置します。

慎重にサイド注入によくタンパク質を注入し、1つのマイクロモルの周りのウェルで最終的なタンパク質濃度を使用します。室温で60分インキュベートします。約 20 ~ 30 マイクロリットルのバッファーをサイト注入ポートに静かに注入し、グリッドを Teflon ブロックの表面の上に上げます。

これにより、ピンセットでグリッドを拾い上げ、液滴から垂直に持ち上げます。代表結果。EMグリッド上に堆積した脂質単層は、コントラスト染色を行うことなく透過型電子顕微鏡下で可視化することができます。

この単層存在は、そのビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率を有する領域は、カバレッジのない領域よりもコントラストが低い。空の穴を通る電子ビームは散乱しないため、明るい照明を示します。

結論として、脂質単層法は、その単純性のためにタンパク質構造を研究する機会を提供する。2D結晶化のプロセスを容易にする代替アプローチを提供してもよい。