共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション
2021年12月8日
このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。
このプロトコルは、簡単な手順で電子顕微鏡に近い分解能で神経筋接合部の3D構造を定量的に分析するのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、筋肉サンプルが同様に処理され、共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡用に免疫標識されるため、動物モデルでの正確な神経筋接合部構造評価の時間が短縮されることです。私たちが開発した形態定量は、他の細胞内構造の解析に容易に適応させることができます。
私のチームの科学者であるマルティナ・マリネッロ博士を紹介し、筋肉のからかいと免疫染色がどのように行われるかを示し、このプロトコルの適用を成功させるための推奨事項をいくつか紹介できることを嬉しく思います。Genethonのイメージングプラットフォームからジェレミー・コゼット博士を紹介し、共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡を使用した画像の取得と分析を展示します。安楽死後、2つの細かい鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1ミリメートルの小さな繊維束で前脛骨筋をからかい始めます。
次に、これらの筋肉束をPBSで調製した1%Triton X-100を含む24ウェルプレートに移し、室温で1時間、または摂氏4度で5時間穏やかに攪拌します。室温でPBSでサンプルを3回5分間洗浄した後、穏やかな攪拌下で摂氏4度で4時間、1%Triton X-100を含むPBSで調製した4%BSAからなるブロッキング溶液でサンプルをインキュベートします。次に、ニューロフィラメントMまたはシナプス小胞糖タンパク質2のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含む同じブロッキング溶液でサンプルを一晩インキュベートし、シナプス前軸索末端または活性ゾーンをそれぞれ標識します。
翌日、ラベルを付けた筋肉束を穏やかな攪拌下でPBSで5分間3回洗浄します。次に、それらを適切な二次抗体とともに、室温で2時間シェーカーに置いてインキュベートします。筋肉の束をもう一度洗った後、封入剤を入れたスライドの上に置きます。
次に、上部に1.5グレードのガラスカバースリップを置き、続いてスライドの両側に円筒形の磁石を置いて圧力をかけ、筋肉を平らにします。共焦点顕微鏡を使用して画像を取得するには、顕微鏡ソフトウェアを起動し、構成モードとしてマシンを選択し、テキスト原稿に記載されている設定に従って、各実験グループの神経筋接合部の画像スタックを収集します。セッションの最後に、[3Dビューアで開く]をクリックし、実験グループを代表する神経筋接合部を選択して、3Dラベリングを視覚化します。
シナプス後神経筋接合部とプレートの体積、最大強度投影面積、および相対的な曲がり角を計算するには、神経筋接合部の体積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、マクロが2番目のウィンドウで開いたら、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。分析するジャンクション サブフォルダーを含むネイティブ フォルダーを選択し、[選択] をクリックします。次に、保存フォルダのポップアップメニューで、ストレージフォルダを選択し、[選択]をクリックします。
「画像タイプ」という新しいポップアップメニューで、Z スタック取得のフォーマットを選択します。目的の染色に対応するRGBチャンネルを選択し、X、Yピクセルサイズ、Zステップを示します。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。
シナプス前神経フィラメントの蓄積を定量化するには、神経筋接合部の蓄積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。ジャンクション サブフォルダー、ストレージ フォルダー、および前述のように Z スタック取得の形式を選択します。次に、染色情報ポップアップで、シナプス前およびシナプス後のラベルと色を指定し、[ピクセルサイズ]ポップアップ OK.In をクリックして、X、Yピクセルサイズを0.072マイクロメートル、Zステップを0.5マイクロメートルとして示し、[OK]をクリックします。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。
アセチルコリン受容体ストライプ間の距離を計算するには、中央ウィンドウの上部にある定量メニューを選択します。[ツール]タブをクリックし、強度を選択して、ラインプロファイルアイコンをクリックします。[オーバーサンプリング] を 1 に設定し、[チャネルの並べ替え] にチェックマークを付けます。
[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、描画ラインアイコンをクリックして、複数のストライプまたはジャンクションフォールドを垂直に交差するラインをトレースします。最初のピークの上部をクリックし、マウスの左ボタンを押しながらマウスポインタを動かし、次の最大ピークに達するまで移動します。
2 つのピーク間の距離に対応する DX 値に注意してください。右側のウィンドウの画像でマウスを右クリックし、[ROIの保存]を選択します。矢印アイコンをクリックした後、ROIをクリックし、ビンアイコンをクリックして削除します。
アセチルコリン受容体ストライプの幅を計算するには、左上のパネルの[ツール]タブで強度を選択し、[FWHMの決定]アイコンをクリックして、ソートチャネルにチェックマークを付けます。次に、[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、右側のウィンドウのトップメニューにある長方形の描画アイコンをクリックします。
水平または垂直のストライプを選択し、ストライプに対して垂直に長方形を描画します。中央のウィンドウにプロファイルが表示されます。左側のパネルにある[平均投影]メニューの垂直または水平のいずれかをクリックし、ストライプの向きが垂直か水平かによって異なります。
中央のウィンドウの統計をクリックしてFWHM値を読み取り、前に示したようにROIを保存および削除します。蛍光α-ブンガロトキシンで標識されたシナプス後運動エンドプレートは、2つのマウス系統の変異体でより小さく、断片化して現れました。カスタマイズされたImage Jマクロを使用して神経筋接合部Zスタックを定量化したところ、対照と比較して、両方の疾患モデルでエンドプレート体積、最大強度投影、および相対的な曲がり角が著しく減少し、神経筋接合部の成熟障害が示されました。
Image Jカスタムマクロを使用してシナプス前軸索末端分岐分布を定量化すると、免疫標識が増加した2つの動物モデルでニューロフィラメントM分布のパターンが変化していることが明らかになりました。シナプス小胞糖タンパク質2染色により、Smn 2B/マウスにおいて、隣接する神経終末活動ゾーンを有するアセチルコリン受容体含有領域の占有率の43%低下が観察された。神経筋接合部シナプス後終末板の様相は、蛍光α-ブンガロトキシン標識および強度プロファイル解析によって明確に視覚化された。
神経筋接合部パラメータを評価すると、変異体の腓腹筋におけるアセチルコリン受容体ストライプの接合部襞距離と幅の増加が明らかになりました。信頼できる結果を得るには、筋肉の束を分離するために適用される強度に特に注意を払いながら、筋肉を適切にいじめることが重要です。このプロトコルは、以前は透過型電子顕微鏡などの複雑で時間のかかる手順によってのみ説明されていた神経筋接合部のより詳細な形態学的特徴付けを取得するのに役立ちます。
STEDイメージング手順は、神経筋接合部に影響を与える疾患の病態生理に寄与するシナプス前後のマーカーに関する新しい洞察の調査への道を開いた。
概要
本プロトコルでは、共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡を併用して神経筋接合部の形態計測解析を行う方法について説明します。この手法は、脊髄性筋萎縮症（SMA）およびColQ関連先天性筋無力症候群（CMS）のマウスモデルにおける病理学的変化を定量化するために設計されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 神経筋接合部解析
- 顕微鏡技術
背景
- 神経筋接合部は、運動ニューロンの信号伝達において極めて重要です。
- これらの接合部における病理学的変化は、さまざまな運動障害で観察されます。
- 共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡は、構造解析のための高解像度イメージングを提供します。
研究目的
- 神経筋接合部の形態を解析するための効率的なプロトコルを確立すること。
- 筋疾患のマウスモデルにおける構造的な変化を評価すること。
- 他の細胞内構造の評価に向けた今後の応用を容易にすること。
使用した手法
- 本プロトコルでは、イメージングのための筋肉サンプルの調製および免疫標識を行います。
- SMAおよびColQ関連CMSのマウスモデルを使用しました。
- 主な手順には、筋線維の分離、ブロッキング、一次抗体および二次抗体の適用が含まれます。
- 共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡を用いて画像取得を行い、続いてImage Jマクロを用いて画像解析を実施しました。
主な結果
- 定量解析により、変異マウス系統においてポストシナプス運動終板の体積減少と断片化が明らかになった。
- カスタム作成したImage Jマクロを用いて、最大強度投影および屈曲度の変化を観察した。
- これらの結果は、SMAおよびCMSに関連する神経筋接合部の構造的欠損の理解に寄与するものである。
結論
- 本研究では、神経筋接合部の変化を定量化するための効果的な手法を提示します。
- 本プロトコルにより、研究者は遺伝子変異が神経筋機能に及ぼす形態学的影響を評価することが可能になります。
- 得られた知見は、神経筋疾患の理解および治療戦略に寄与することが期待されます。
よくある質問
産業界への重要性
本プロトコルでは、マウスモデルにおける神経筋接合部の定量的な3D形態計測解析が可能となり、前臨床疾患モデルにおける構造的病理を評価するためのスケーラブルなアプローチを提供します。共焦点顕微鏡と超解像STED顕微鏡を組み合わせることで、標的の検証や神経筋疾患研究におけるメカニズムのリスク低減を支援する高解像度の構造データが得られます。この手法は、NMJ形態における疾患関連の変化を定量化することで、治療介入の前臨床評価を容易にし、早期の創薬パイプラインにおける予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：疾患モデルにおけるシナプス前および後構造の変化を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：神経筋接合部（NMJ）の体積、面積、および屈曲度の標準化され再現性のある定量化を通じて、生物学的リスク低減を支援する。
- 予測的価値：SMAおよびCMSモデルにおける遺伝子変異と測定可能なNMJ病理を関連付けることで、ターゲットへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：健常組織および疾患組織における神経筋接合部（NMJ）の形態学的ベースラインを確立することで、ダウンストリームスクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを構築する。
- 運用的価値：アッセイの標準化に適した、定量的かつ標準化された出力（体積、強度投影、屈曲度、AChRストライプ幅）を提供する。
- 拡張性：適応可能なImageJマクロにより、さまざまな疾患モデルや細胞内構造にわたるプラットフォームの再利用を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：SMAおよびCMS変異マウスにおいて、神経筋接合部（NMJ）の断片化と終板体積の減少を捉えることで、疾患との関連性を実証します。
- トランスレーショナルな連続性：機能的欠損と相関する形態計測学的エンドポイントを提供することで、基礎研究と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の前進：治療候補薬に対する構造的な回復または悪化を定量化し、開発の継続（go/no-go）判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットのバリデーションから前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、疾患モデルの特性解析および介入研究を通じて、神経筋接合部（NMJ）の完全性を反復的に評価することを可能にします。
- 探索生物学：シナプス前（neurofilament、SV2）およびシナプス後（AChR、接合部ひだ）コンパートメントの変化を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：NMJ構造のわずかな構造変化を検出する、再現性と定量性の高いイメージング読み出しにより、アッセイの準備状況を保証します。
- アナリティクス：標準化された測定値（体積、面積、曲折率、FWHM、ストライプ間距離）を算出し、条件間の比較および統計的評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：運動ニューロン疾患における病態生理学的進行を反映する、疾患関連の構造的バイオマーカーを提供し、前臨床研究への継続性を繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数の神経筋疾患モデルやNMJ以外の細胞内構造に適用可能な、再利用可能なイメージングおよび解析ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：NMJ病理評価におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：標準化された試料調製、イメージング、およびマクロベースの定量化により、再現性と拡張性を高める。
- 戦略的価値：スループットの低いEMへの依存を減らし、サンプルあたりのデータ密度を高めることで、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：定量可能なNMJ構造の回復または悪化に基づき、治療候補物質のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 骨格筋組織の剥離、免疫蛍光標識、および共焦点/STED顕微鏡の操作に関する専門知識が必要です。
- 超解像STEDイメージング設備および適合する蛍光標識試薬へのアクセスが必須となります。
- 再現性のある定量化を行うには、イメージングパラメータのチーム間での標準化およびImageJマクロの実行が必要です。
- モデルシステム間で適用する場合、筋肉の種類に応じて抗体の浸透性と染色効率の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、筋線維の損傷を避け、一貫したサンプル品質を確保するための適切な筋肉解きほぐし技術への依存が挙げられます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:17
Dissection of Muscles and Immunostaining
3:21
Image Acquisition
3:58
Image Analysis to Calculate Postsynaptic NMJ Endplate Volume, MIP Area, and Relative Tortuosity
5:05
Image Analysis to Quantify Presynaptic Neurofilament Accumulation and Synaptic Vesicle Glycoprotein 2 Staining
6:04
Calculating the Distance Between Acetylcholine Receptor (AChR) Stripes and Their Width
8:22
Results: Multi Parameter Postsynaptic NMJ Characterization, STED Imaging, and Morphometric Analysis of Presynaptic Axon Terminal Distribution
10:09
Conclusion
