脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

ここでは、多能性間葉系細胞の注入などの治療ステップの使用のための良好で生存可能な細胞を取得および保存するためのプロトコルを実証しました。これの主な利点は、この技術を使用して、採取した組織からの細胞の単離工程で得られた時間に対する生細胞体積を得ることができることである。この技術は、異質医療と細胞療法が適用されるすべての疾患または状態に対して拡張することができます。

この方法は、薬物検査など、長期間の細胞培養が奨励される分野での細胞ゲノム安定性試験にも適用できます。生細胞を操作するときはいつでも、落ち着いて自信を持ってください。敗血症には細心の注意を払い、科学者の目で常に注意を払い、逆境を観察し、適切な決定を下してください。

バッグの重量を量り、デジタル非接触赤外線体温計で温度を測定することから始めます。バッグを層流チャンバー内に5分間放置して、脂っこい層を沈殿させ、細胞を含む組織を分離します。カルシウム入りのDPBS100ミリリットルをトランスファーバッグに注入し、手で混ぜます。

5分間放置します。次に、バッグアダプターに取り付けられた60ミリリットルのシリンジを使用して、沈殿する基礎液のほとんどを廃棄します。このプロセスを2回繰り返します。

100ミリリットルの消化液をバッグに加え、ゆっくりと攪拌しながら37°Cで30分間放置します。次に、バッグの内容物をすべて4本の50ミリリットルのコニカルチューブに移し、摂氏22度で10分間400Gで遠心分離します。上清を廃棄し、20%ウシ胎児血清を添加した5ミリリットルのDMEM低グルコースを細胞ペレットに加えます。

10マイクロリットルのトリパンブルーの新鮮な溶液を0.05%の蒸留水と10マイクロリットルの細胞懸濁液と5分間混合します。20倍の倍率で倒立光学顕微鏡を使用し、ノイバウアー細胞計数チャンバー内の生細胞をカウントします。細胞ペレットを1ミリリットルあたり100万細胞の濃度の凍結保護培地に懸濁します。

次に、この混合物1ミリリットルをクライオバイアルに入れます。1分間に1°Cの冷却速度で冷凍容器を使用し、80°Cで1年間保管してください。1年後、液体窒素気相に浸した標準的なカセットボックスに保管してください。

9人の患者からの処置の異なるステップからのデータがこの表に示されている。初期細胞収量に従って、各試料の可変体積の細胞が決定された。細胞収量の高いサンプルは1ミリリットル、細胞収量は中間のサンプルの場合は1.1ミリリットル、細胞収量が低いサンプルは1ミリリットルです。

継代前の細胞収率は、トリプシン処理前に同じコンフルエントが観察された場合でも大きく変動した。したがって、ここで細胞は層状に成長している可能性があります。代表的な画像は、光学顕微鏡で単離した後の最初の通過におけるプラスチック付着性間葉系ADSCを示しています。

細胞は、プラスチックおよび線維芽細胞様形態への接着を示す。トリパンブルーアッセイでノイバウアーチャンバーでカウントされた生細胞をここに示します。6人の患者からのフローサイトメトリーデータをこの表に示します。

これらのCD45陰性細胞から、幹細胞マーカーの異なる組み合わせを有するADSCの割合が決定された。代表的な画像は、8ヶ月間の凍結保存後の症例9のSVFにおける幹細胞関連マーカー陽性の細胞の亜集団を示す。ここで、R1は、前方散乱対側散布図で分析された全細胞領域です。

そしてR2はCD45陰性領域である。CD73、CD90、およびCD105集団はこの地域で陽性です。軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞におけるADSC分化をここに示します。

この手順を試みるときは、癒着と水ぶくれを観察するために摂氏37度で30分間放置しながら、できれば手でゆっくりとかき混ぜることを忘れないでください。作業室の温度を摂氏25度前後に保ち、はるかに大きな温度での熱衝撃を避けてください。ここで示した技術は、多能性間葉系細胞を他の組織から首尾よく単離するために使用することができる。