Name: マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶマウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化法。デジタル液滴PCRを用いて、遺伝子治療研究におけるAAVゲノムコピー数を高精度に測定し、網膜細胞への遺伝子導入効率を評価する信頼性の高いプロトコルを確立します。

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Oezkan Keles、ジョセフィーヌ・ユットナー、ボトンド・ロスカ教授(分子・臨床眼科バーゼル研究所)のAAV生産に対する支援と支援に感謝します。また、AAV8/BP2株に関しては、ペンシルベニア大学ペレルマン医学部のジーン・ベネット教授にも感謝したいと思います。ゲブゼ工科大学の動物施設で動物の作業を行います。そのために、レイラ・ディクメタスとウイガー・ハリス・タゼベイ教授に、動物の畜産に対する技術支援と支援に感謝します。また、ファトマ・オズデミール博士の原稿に対するコメントに感謝したいと思います。この作業は、TUBITAK、補助金番号118C226と121N275、およびサバンチ大学統合助成金によってサポートされています。

すべての実験議定書はサバンチ大学倫理委員会によって受け入れられ、実験は、動物の研究における使用に関する「視覚・眼科研究協会」の声明に従って行われた。
1. 小規模AAV生産12
<ol><li>培養 HEK293T細胞は、70-80%の合流までDMEM/ 10%FBSの完全な10 mLで15 cmのプレートを使用した。</li>
	<li>トランスフェクション混合物をヘルパープラスミド(pHGT1-Adeno1)20 μg、カプシドプラスミド7 μg、AAV2-CBA-tdTomato-WPREPRE 7 μg、PEI溶液(1 mg/mL)の136 μLを5mLのDMEMで調製します。</li>
	<li>5 mLのトランスフェクション混合物を10 mLの培養培地を含む細胞培養皿に加え、37°Cで48〜60時間トランスフェクトされた細胞をインキュベートする。</li>
	<li>トランスフェクション後48-60時間でメディアを収集し、37°Cで30分間の250 U/mLの最終濃度でDNase Iで消化します。</li>
	<li>消化した培地を4000 x gで遠心し、4 °Cで30分間、0.22 μmのシリンジフィルターで100kDaの予め湿った再生セルロース膜にフィルターします。</li>
	<li>再生セルロース膜を4000xgで遠心し、4°Cで30分間、培地を廃棄します。 </li>
	<li>再生セルロース膜を4000xgで3回、4°Cで30分間、0.001%プルロン酸F-68を含むPBSで再生セルロース膜を洗浄し、遠心分離します。各ステップで PBS を破棄します。</li>
	<li>再生セルロース膜の上部から濃縮されたAAVを収集し、さらに使用するためにアリコート。</li>
	<li>DNase I(0.2U/μl)で作りたてのAAVを5μL消化し、37°Cで15分間、37°Cで刺激します。これは、DNase Iを不活性化し、ウイルスキャプシドを分解する両方の95°Cインキュベーションで10分が続きます。</li>
	<li>0.05%Pluronic F-68を使用して、消化されたAAVから10倍のシリアル希釈を準備します。滴定に AAV2-ITR および WPRE プライマーを使用する (表 1)。この価子は、希釈因子を用いてdd-PCR結果を乗算して算出した。結果はゲノムコピー/mL(GC/mL)に変換された。 注:小規模AAV生産のAAV濃度は約1 x 1012 GC/mLになると予想されています。このプロトコルは、AAV13のようなメディアに AAV を効率的に放出しない AAV 株には適用されません。</li>
</ol>2. AAVの内膜注射
<ol><li>
機器の準備
	<ol>
<li>開始する前に、36 Gの鈍い針で10 μLのマイクロシリンジを準備してください。70%のEtOHで5回、ddH2Oで5回、PBSで最後に5回リンスします。</li>
		<li>適切な量のAAVをマイクロシリンジに注入するごとにロードします。</li>
		<li>手術用針(縫合糸、絹、6/0)、テープ、鉗子、はさみを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ビトリア内注射
	<ol>
<li>0.5%のトロピックアミドと2.5%のフェニレフリン塩酸塩(例えば、Mydfrin)の1滴を適用し、瞳孔を拡張するために麻酔前の眼球低下を含む。</li>
		<li>イオブルラン5%(1 L/分)でマウスを麻酔し、処置中に1.5%のイオブルラン(1 L/分)を継続する。小さなイオブルランチャンバーは、最初の誘導のために使用されます。</li>
		<li>右反射の喪失、離脱反射、尾ピンチ応答により麻酔の深さを確認します。</li>
		<li>注射手順の前に、各眼に0.3%トブラマイシンおよび0.1%デキサメタゾン滅菌眼液を塗布する。目の滴の適用は乾燥を防ぎ、抗炎症および抗菌効果を発揮する。</li>
		<li>上まぶたを安定させるために外科用フックを使用してください。わずかに引き戻して、目の背側部分を露出させます。フックをベンチにテープで貼り付け、位置に保持します。</li>
		<li>角張った虹彩はさみで結膜(1mm2未満)を取り除き、解剖顕微鏡下で眼の膜を露出させます。新鮮で無菌のインスリン注射器(30G)を使用して、スクレラを穿刺する。</li>
		<li>マイクロマニピュレーターを使用して、同じ穿刺を通してマイクロシリンジの針を挿入します。針の先端をレンズの後ろに置き、眼の中央に置きます。</li>
		<li>AAV2/BP2 および AAV2/PHP を 1 μL注入します。1.63 x 1012 GC/mLおよび1.7 x 1012 GC/mL濃度を有するSベクターは眼の膜内にゆっくりと入る。射出量制御は手動で行われます。針を1分間所定の位置に置いておき、針をゆっくりと引き出します。</li>
		<li>まぶたを放出し、0.3%のトブラマイシンと0.1%デキサメタゾンを含む抗炎症および抗菌局所ゲル処理を眼球に適用する。見た目(明るい目、手入れコート、ハンチ)、行動(活性、固定化、自己突然変異)、体重を0〜3のスケールでスコアシートに従って、次の日にマウスを監視および評価する。各条件には0-3のスコアがあり、合計スコアは3以上が終了基準です。</li>
		<li>回復後、動物をケージに入れます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 蛍光と眼炎イメージング
<ol><li>マウスをひずみ、0.5%のトロピックアミドと2.5%のフェニレフリン塩酸塩を各眼に滴下して瞳孔を拡張する。</li>
	<li>イオフルランで上記の手順で動物を麻酔します。足をつまんで麻酔の深さを慎重に評価します。</li>
	<li>画像処理段階にマウスを置き、眼管カメラを通してチェックして適切な拡張を確認します。局所ゲル(0.2%カルボマー980)を眼の表面に塗布して、麻酔下での脱水から目を保護し、イメージング用のカップリングゲルとして使用します。</li>
	<li>イメージングステージを操作して、目的の鼻と並ぶ。マウスの目を中央に配置するために必要に応じてステージを調整します。目を中央に配置したら、目と接触するまでゆっくりと目的を動かします。</li>
	<li>両眼に眼深および蛍光イメージングを行い、細胞内注射後1週間及び2週間でtdTomato発現をフォローアップする(図3B)14。レポーター表現の比較のために同じ設定で眼科画像と蛍光画像を撮ります。</li>
</ol>4. レティナの分離
<ol><li>2週間時点でのRETINA回収のためのCO2 吸入による眼深および蛍光イメージング後の動物を安楽死させる。</li>
	<li>13.5 cmのスプリッタ鉗子の助けを借りて眼球を前方にシフトします。</li>
	<li>鉗子で穏やかな圧力をかけることによって残りのガラス膜と一緒にレンズを取り外す。</li>
	<li>精密湾曲した鉗子で眼球と視神経の接続を切断し、同じ湾曲した鉗子で静かに眼球を絞ります。</li>
	<li>解剖されたレチナをマイクロ遠心分離チューブに移します。</li>
	<li>液体窒素にチューブを入れることによって、凍結のレチナをスナップします。</li>
</ol>5. 組織ゲノムDNAの分離
<ol><li>ゲノムDNAを、製品化したプロテイン酵素K消化ベースの組織ゲノムDNAキットで分離します。</li>
	<li>55°Cでレティナを消化し、200 x g で30分間、すでにキットに供給されているプロテナーゼKを使用します。</li>
	<li>RNaseインキュベーションステップ、洗浄バッファーIおよびIIで洗浄ステップ、および最終的にメーカーのプロトコルに従って溶出ステップを行います。</li>
	<li>最後の洗浄後に余分なスピンステップを追加して、残留エタノールを除去します。</li>
	<li>ゲノムDNAの濃度を測定し、サンプルを-20°Cで保存します。</li>
</ol>6. ウイルスゲノムの定量のためのマウスのレチナサンプルの液滴デジタルPCR解析
<ol><li>0.05%Pluronic F-68溶液に注入されたレチナからゲノムのDNAを希釈し、各サンプルに対して1 ng/μLの最終濃度に達した。</li>
	<li>各プライマーに対して125 nMの最終濃度のターゲット特定プライマーを使用して、WPREと18Sに対して別々の反応を行います。</li>
	<li>1 ngのゲノムDNA、125 nMプライマー、2xエバグリーンスーパーミックスを含む20 μLのPCR反応ミックスで液滴生成を行います。</li>
	<li>液滴生成のために、カートリッジの中央部にサンプルミックスをロードします。</li>
	<li>カートリッジへのサンプルローディングが完了したら、70 μLの液滴生成油をカートリッジの下段に追加します。</li>
	<li>ガスケットをカートリッジの上に置き、液滴発生器に入れます。ガスケットとカートリッジの間に隙間がないことを確認します。</li>
	<li>上のウェルで生成された液滴の約40 μLを静かに取ります。半スカートの96ウェルPCR反応プレートに液滴溶液を加えます。</li>
	<li>PCR プレートを、アルミ製シールホイルを使用してシーラー PCR でシールします。</li>
	<li>PCR プレートを 96 ウェルヒートシールサーマルサイクラーに入れます。PCR プロトコルを使用します。95°C、30秒で95°Cの40サイクル、1分間60°C、5分間4°C、5分間90°C、4°C、4°Cの無限保持。各サイクルで2°C/sランプレートを適用して、サイクル中に各ステップの正しい温度に到達するように液滴を確保</li>
	<li>PCR プレートを液滴リーダーに配置し、dd-PCR ソフトウェアを使用して液滴を定量化します。テンプレートは、evagreen の特定の設定を使用して設定されます。</li>
	<li>蛍光強度対液滴数の各標本を用いた1次元プロットグラフを使用してデータを分析します。しきい値は、しきい値を超える液滴が正のもの、下の液滴が負のものとして割り当てられるように配置されます。その後、ポアソンアルゴリズムを適用して、コピー/μL単位でターゲットDNAの開始濃度を決定します。WPRE対18Sの比は、AAVトランスダクション効率を測定するために計算されます。</li>
</ol>

<ol><li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions%3A+The+fast+and+the+curious%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li>
<li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li>
<li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+structure+and+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li>
<li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+%28intravitreal%2C+subretinal%2C+or+suprachoroidal%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li>
<li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li>
<li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice%2C+non-human+primates+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li>
<li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+tools+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li>
<li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li>
<li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li>
<li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、異なるキャプシドタンパク質を有する2つのAAVベクターを生成し、それに応じてそれらをtiteredした。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、トランスダクション12,13の後に検出可能なレポーター式をもたらす十分な量のAAVを生成することです。
AAV の titering も、AAV の投与量を調整する重要な要因です。これらの重要な基準が達成されれば、Dd-PCR方法論によってAAVのトランスダクション効率を定量化することが可能です。
多くの研究所では、AAV のタンターに定量 PCR (qPCR) 法を使用しています。qPCRベースの絶対定量法は、既知の量の標的DNA18の希釈を有する標準曲線を必要とする。しかし、dd-PCRは、標的DNAのコピーが少なくとも1つある正の液滴を検出することによって、特定のサンプル内の標的分子の総数を直...

アデノ関連ウイルス(AAV)は現在、様々な遺伝子治療研究に一般的に使用されています。AAVは、より少ない免疫原性と少ないゲノム統合で、安全で効率的な遺伝子導入方法を提供します。標的細胞へのAAVの侵入はエンドサイトーシスを介して起こり、細胞表面1,2上の受容体および共受容体の結合を必要とする。したがって、異なる細胞タイプに対するAAVのトランスダクション効率は、主にキャプシドおよびその宿主細胞受容体との相互作用に依存する。AAVには血清型があり、各血清型は、明確な細胞/組織の栄養と伝達効率を持つことができます。また、ウイルスキャプシドの化学修飾によって生成される人工AAV血清型および変異体、ハイブリッドキャプシドの産生、ペプチド挿入、キャプシドシャッフル、指向進化、および合理的突然変異誘発3もある。アミノ酸配列やカプシド構造のわずかな変化でさえ、宿主細胞因子との相互作用に影響を及ぼし、異なる栄養価を有する。カプシド変異体に加えて、AAV産生の注入経路およびバッチ間変動のような他の要因は、神経性レチナにおけるAAVの導入効率に影響を与える可能性がある。したがって、異なるバリアントのトランスダクション率の比較のための信頼性の高い方法が必要です。
AAVの導入効率を決定する方法の大部分は、レポーター遺伝子発現に依存する。これらには、蛍光イメージング、免疫染色化学、ウェスタンブロット、またはレポーター遺伝子産物5、6、7の構造化学的分析が含まれる。しかし、AAVのサイズ制約により、伝達効率を監視するレポーター遺伝子を含めることが必ずしも可能であるとは限りません。ハイブリッドCMVエンハンサー/チキンβ-アクチンまたはウッドチャック肝炎転写後調節要素(WPRE)のような強力なプロモーターをmRNA安定剤配列として用い、サイズ問題8をさらに複雑にする。したがって、より直接的な方法論で注入されたAAVのトランスダクション率を定義することも有益です。
デジタル液滴PCR(dd-PCR)は、微量のサンプルからターゲットDNAを定量化する強力な手法です。dd-PCR技術は、油滴による標的DNAおよびPCR反応混合物の封入に依存する。各dd-PCR反応には、数千個の液滴が含まれています。各液滴は、独立したPCR反応9として処理され、分析される。液滴の解析により、ポアソンアルゴリズムを使用するだけで、任意のサンプル中の標的DNA分子の絶対コピー数を計算できます。AAVのトランスダクション効率は神経筋のAAVゲノムのコピー数と相関しているため、Dd-PCR法を用いてAAVゲノムを定量化しました。
ここでは、遺伝子組換えDNA6,10からAAVベクターの導入効率を算出するdd-PCR方法論について説明する。まず、tdTomatoレポーターを発現するAAVを小規模プロトコルを用いて生成し、dd-PCR法11で煮込んだ。第二に、AAVは本当に神経細胞のretinaに注入された。トランスダクション効率を実証するために、まず蛍光顕微鏡とImageJソフトウェアを用いてtdTomato発現を定量化しました。その後、dd-PCRを用いて注入されたレティナにおけるAAVゲノムの定量化のためのゲノムDNAの単離が行われた。tdTomato発現量とdd-PCRによって定量されたトランスタイズされたAAVゲノムとの比較は、dd-PCR法がAAVベクターのトランスダクション効率を正確に定量することを示した。当社のプロトコルは、AAVの変換効率を定量化するためのdd-PCRベースの方法論の詳細な説明を示しました。本プロトコルでは、ゲノムDNA単離後の希釈因子とdd-PCR結果を用いて、細胞内注射後にトランスデュージされるAAVゲノムの絶対数も示す。全体として、このプロトコルは、レチナにおけるAAVベクターの伝達効率を定量化するレポーター式に代わる強力な方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>96ウェルセミスカートddPCRプレート</td><td>BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj mice</td><td>strain Janvier</td><td>C57BL/6JRj</td><td>mice</td></tr><tr><td>DG8 gaskets BioRad</td><td></td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8 Cartridges</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>液滴発生油 eva green</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>液滴リーダー油</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>PX1 用 AAV</td></tr><tr><td>ホイルシールPCR プレートシーラー</td><td>BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BD メディカル</td><td>320933</td><td>硝子体内注射</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td><td></td><td>N01AB06麻酔マイクロ</td></tr><tr><td>インジェクター MM33</td><td>ワールド精密機器</td><td>82-42-101-0000</td><td>硝子体内注射</td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>Micron IV</td><td>3-CCDカラーカメラ、フレームグラバー、および既製のソフトウェアに基づく顕微鏡システムにより、研究者はマウスの網膜をイメージングできます。</td></tr><tr><td>ミドフリン(%2.5フェニレフリン塩酸塩)</td><td>アルコン</td><td>S01FB01</td><td>瞳孔拡張</td></tr><tr><td>Nanofilシリンジ10 &mu;l</td><td>World Precision</td><td>Instruments NANOFIL</td><td>硝子体内注射</td></tr><tr><td>針 RN G36, 25 mm, PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>硝子体内注射</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>AAV</td></tr><tr><td>プラスミド pHGT1-Adeno1</td><td>PlasmidFactory</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>プルロニック F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR プレート シーラー システム</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 液滴リーダー/QX200 液滴発生器</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>スプリッター 鉗子 WATCHER MAKER - 長さ = 13.5 CM</td><td>エンドストール 医療</td><td>EJN-160-0155</td>網<td>膜隔離</td></tr><tr><td>滅菌シリンジ</td><td>フィルターAISIMO</td><td>ASF33PS22S</td><td>AAV</td></tr><tr><td>組織ゲノムDNAキット</td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>gDNA分離</td></tr><tr><td>トブラデックス(0.3%トブラマイシン/ 0.1%デキサメタゾン)</td><td>アルコン</td><td>S01CA01</td><td>抗炎症/抗生物質</td></tr><tr><td>トロパミド(%0.5トロピカミド)</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>瞳孔拡張</td></tr><tr><td>ターボヌクレア</td><td>ーゼ Accelagen</td><td>N0103L</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Viscotears (カルボマー 2 mg/g)</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>潤滑剤点眼薬</td></tr></tbody></table>

マウスレチナにおけるaavトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴pcr法

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

多くのレチナル細胞生物学研究所は現在、遺伝子編集や規制アプリケーションのためにアデノ関連ウイルス(AAV)を日常的に使用しています。AAVの伝達の効率は、通常、全体的な実験結果に影響を与える重要です。トランスダクション効率の主な決定要因の1つは、AAVベクターの血清型または変異体です。 現在、様々な人工AAV血清型および変異体は、細胞表面受容体をホストするために異なる親和性を有して利用可能である。遺伝子の遺伝子治療では、異なるレチナル細胞タイプに対して様々な程度の伝達効率が得られます。また、AAV産生の噴射経路および品質も、AAVの変換効率に影響を与える可能性があります。したがって、さまざまなバリアント、バッチ、および方法論の効率を比較することが不可欠です。デジタル液滴PCR(dd-PCR)法は、核酸を高精度に定量化し、標準や基準を使用せずに特定のターゲットの絶対定量を行うことができます。dd-PCRを用いて、注入されたレチナ内のAAVゲノムコピー数を絶対定量化することにより、AAVのトランスダクション効率を評価することも可能です。ここでは、dd-PCRを用いて、レチナル細胞内のAAVのトランスダクション率を定量化する簡単な方法を提供します。マイナーな改変により、この方法論は、ミトコンドリアDNAのコピー数定量化の基礎となり、いくつかの疾患および遺伝子治療用途に不可欠なベース編集の効率を評価する基礎となる可能性もあります。

小規模な AAV の生産は、迅速かつ効率的な方法で、ビトリアル内注射用のベクターを提供します (図 1)。小規模なAAV生産は、通常、1 x 1012 GC/mlの範囲内の方位を与え、これはレティナにおけるレポーター発現を検出するのに十分である(図2)。dd-PCR を使用した AAV のタンターは、一貫した結果を与えます。ITR2およびWPRE固有のプライマーは日常的に使用されており、各標的分子の開始濃度をポアソン分布としてモデリングすることによりdd-PCRソフトウェアで算出した。希釈因子の乗算により計算が確定し、1mL当たりのゲノムコピーに変換された。このプロトコル用に製造されたAAVは、それぞれ1.63 x 1012 GC/mLのタイターと1.7x 1012 GC/mlのAAV2/BP2およびAAV2/PHP.S7,15のタイター...

このプロトコルは、小さなAAV産生、ビトリアル内注射、遺伝子画像化、および遺伝子ゲノムDNA分離と共に、デジタル液滴PCR(dd-PCR)を用いてマウスの遺伝子のAAVトランスダクション効率を定量化する方法を示しています。

マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

このビデオでは、非常に感度が高く、標的DNAの絶対定量を行うデジタル液滴PCR法を用いて、マウスのAAV伝達を定量化する方法を紹介します。我々は、主にCRISPRベースの構築物のようなレポーター遺伝子を使用することを許可しない大きなAVV構造のためにこの方法を開発しました。この方法を用いることで、単にRetinaでのAAVのトランスダクション率を定量化することができます。この方法は、デジタル液滴PCRの感度と絶対定量に依存し、まっすぐな結果をもたらします。このビデオでは、非常に感度が高く、標的DNAの絶対定量を行うデジタル液滴PCR法を用いて、マウスのAAV伝達を定量化する方法を紹介します。我々は、主にCRISPRベースの構築物のようなレポーター遺伝子を使用することを可能にしない大きな領域構造のためにこの方法を開発しました。この方法を用いることで、単にRetinaでのAAVのトランスダクション率を定量化することができます。この方法は、感度と2つの液滴PCRの絶対定量に依存し、まっすぐな結果を得る。デジタル液滴 PCR 手法の効率により、定量的リアルタイム PCR からデジタル液滴 PCR または AAV 滴定に切り替える研究所がいくつか存在します。この方法はまた、マウスのretinaにおける遺伝子治療のためのCRISPRベースの突然変異補正の効率をチェックするとともに、レティナにおけるミトコンドリアDNA定量の基礎を提供することができる。AAVヘルパープラスミド、AAVカプシドプラスミド、AAVベクター、およびPI溶液を5ミリリットルの要求でトランスフェクション混合物を調製します。5ミリリットルのトランスフェクション混合物を培養培地に加えます。37°Cでトランスフェクトされた細胞をインキュベートします。トランスフェクション後48~60時間でメディアを収集します。37°Cで30分間、30分間、30分間摂氏4,000gで遠心分離機で30分間、1ミリリットル当たり250単位の最終濃度でDNAでメディアを消化します。再生セルロース膜をPBSで予水した。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターで、100キロダルトンの予め湿った再生セルロース膜に培地をフィルターします。再生セルロース膜を4,000Gで摂氏4度で30分間遠心し、培地を廃棄する。再生セルロース膜を4000G4°Cで3回3回で0.001%pluronic F68を含むPBSで再生セルロース膜を30分間洗浄し、遠心分離します。再生セルロース膜の上部から濃縮されたAAVを収集し、さらなる使用のために割り当てます。ここでは、より小規模なAAV生産を行う方法を示しました。このプロトコルを確認した後、あなたは、retinaでレポーターの表現を見るのに十分なAVを作ることができるはずです。また、デジタル PCR のプロトコルに従って、AAV を生産する機能を実現することもできます。0.5%のトロピックアミドと2.5%フェニレフリン塩酸塩の1滴を適用し、瞳孔を拡張するために麻酔前に眼球滴を含む。イソフルランでマウスを麻酔し、反射神経を検証する。0.3%トブラマイシンと0.1%デキサメタゾン滅菌オフサルミック溶液の点眼を注射術前に各眼に塗布する。上まぶたを安定させるために外科用フックを使用してください。わずかに引き戻して、目の背側部分を露出させます。フックをバンドにテープで貼り付け、位置に保持します。湾曲した虹彩はさみで結膜を取り除き、眼の膜を露出させます。新鮮で無菌の30Gインスリン注射器を使用して、スクレラを穿刺します。マイクロマニピュレータを使用して、同じ穿刺を通してマイクロシリンジの針を挿入します。レンズの後ろの針の先端を、アイカップの中央に置きます。目の膜内にゆっくりとAAV溶液の1マイクロリットルを注入します。針を1分間所定の位置に置いておき、ゆっくりと針を引き出します。0.3%トブラマイシンと0.1%デキサメタゾンを含む抗炎症および抗菌局所ゲル処理をアイカップに適用する。0.5%トロピックアミドを1滴下適用してください。そして、2.5%フェニレフリン塩酸塩は、瞳孔を拡張するために麻酔前に目のドロップを含む。目の表面に1グラムの局所ゲルあたりカルバミド2ミリグラムを適用します。マウスの目を中央に合わせるには、必要に応じてマウススタンドを調整します。両眼に眼深さと蛍光イメージングを行い、細胞内注射の1週間と2週間後にTdTomato発現を行います。手順の前に二酸化炭素吸入を使用して動物を安楽死させる。13.5センチメートルのスプリッター鉗子の助けを借りて前方に目の球をシフト。残ったガラス膜と一緒にレンズを取り外します。精密湾曲した鉗子で眼球と視神経の接続を切断し、同じ湾曲した鉗子で静かに眼球の接続を切断します。ゲノムDNAを、製品化プロテイナーゼK消化膜ベースの組織DNAキットで分離します。55°Cでレティナを30分間30分間消化し、プロテイナーゼK.Lyse retinaを使用し、メーカーのプロトコルに従ってください。これらのプロトコルでは、細胞内注入眼球イメージング、ならびにレティナおよびゲノムDNA分離を示している。これらは retina にとって非常に重要な手順であり、このプロトコルに従うことで、生産された AAV を注入し、その式プロファイルをフォローアップできるはずです。そして、その点を、AAVゲノムを遺伝子組換え遺伝子で定量することにより、その伝達効率を高める。ここでは、デジタル液滴PCRの基本的な応用を見ることができ、そこでは、細胞の中でトランスデュースするAAVゲノムの絶対定量化を行うことができます。0.05%pluronic F 68溶液に注入されたレチナからの希薄なゲノムDNAは、各サンプルに対してマイクロリットル当たり1ナノグラムの最終濃度に達する。1ナノグラムゲノムDNA125ナノモルプライマーと2X常緑スーパーミックスを含む20マイクロリットルのPCR反応ミックスで液滴生成を行います。液滴生成のためにカートリッジの中央部にサンプルミックスをロードします。その後、カートリッジの下段に70マイクロリットルの液滴発生油を加えます。カートリッジの上にガスケットを置きます。ガスケットとカートリッジの間に隙間がないことを確認します。その後、液滴発生器に配置します。上のベルに発生する約40マイクロリットルの液滴をそっと取ります。セミスカート96-ウェルPCR反応プレートに液滴溶液を追加します。PCR プレートを、アルミ製シールホイルを使用してシーラー PCR でシールします。PCR プレートを 96 ウェルヒートシールサーマルサイクラーに入れます。この記事で示されている ddPCR プロトコルを使用します。PCR プレートを液滴リーダーに入れてデータを分析します。このビデオを見た後、基本的なデジタル PCR 技術を実行できるはずです。少量の材料を含む細胞を使用することも可能で、デジタル PCR 技術に最適です。ただし、デジタル液滴 PCR の限界を超えないようにターゲット DNA 量を慎重に調整する必要があります。実験手順のフローチャートを次に示します。小規模なAAV生産を行い、その後AAVの引き起こしを行いました。その後、細胞内注射を行いました。その後、眼深蛍光イメージングによる蛍光強度を定量化しました。その後、マウスのレティナを単離し、ddPCR用のレティナからゲノムDNAを抽出した。Titering AAV は、AAV の変換を正しく定量化できることも重要です。ddPCRは、標的AAVジェノムを希釈した液滴の生成に依存する。代表的なddPCRの結果は、AVVゲノムの正および負の液滴を示す。しきい値を超える正の値と負の値は以下です。希釈因子を掛けた後、AAVの価率は1ミリリットル当たりのゲノムコピーで10〜12であることがわかった。AAVトランダクション効率を正しく定量するために、いくつかのレチナを注入した。注射した動物を画像化し、蛍光平均強度を算出した。2週間の時点で、レティナは単離された。ddPCRはWPREおよび18Sプライマーを用いて行った。AAV注入されたレティナの蛍光強度は、AAVゲノム計算と相関し、方法論の力を示した。ここでは、小規模なAAV調製イントラビクテル注射を含むいくつかの技術を示した。

digital-droplet-pcr-method-for-quantification-aav-transduction

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神経科学

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マウスレチナにおけるAAVトランスダクション効率の定量化のためのデジタル液滴PCR法

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