Name: マウスとヒトの歯からの単一細胞の迅速な分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学ぶマウスとヒトの歯から単一細胞を迅速に分離する方法。組織処理を効率化し、細胞生存性を維持しながら単一細胞RNAシーケンス解析の品質を向上させます。歯科研究における高品質な細胞解析の基盤となります。

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J.K.は、マサリク大学の助成機関(MUNI/H/1615/2015/2018)と医学部MUからジュニア研究者への資金によって支援されました。J.L.はマサリック大学グラントエージェンシー(MUNI/IGA/1532/2020)の支援を受け、ブルノ市自治体が資金を提供するブルノ博士課程の人材奨学金保有者です。T.Bはオーストリア科学基金(リーゼ・マイトナー交付金:M2688-B28)によって支援されました。私たちは、人間の歯の取得に彼らの助けをライディ・イザコビコワ・ホラとヴェロニカ・コヴァル・マテヨワに感謝します。最後に、ラデク・フェダーとカレル・スーチェクがFACS選別を支援してくれたことに感謝します。

すべての動物実験は、国際および現地の規制に従って行われ、チェコ共和国の教育・青少年・スポーツ省によって承認されました(MSMT-8360/2019-2;MSMT-9231/2020-2;MSMT-272/2020-3)。このプロトコルは、雄と雌の野生型C57BL/6およびCD-1マウスと遺伝子組み換えSox10:::iCreERT2 mice17(様々なレポーターシステムと組み合わせた)をC57BL/6バックグラウンドでテストした。ヒトサンプルの実験は、チェコ共和国ブルノにある医学部、マサリック大学ブルノ&セントアンズ教団病院の倫理委員会の承認を得て行われました。
1. 実験的なセットアップとソリューションの準備
<ol><li>計器のセットアップ<ol>
<li>遠心分離機を4°Cに冷却します。</li>
		<li>インキュベーションチャンバーを37°Cに加熱します。</li>
		<li>蛍光活性化セルソーティング(FACS)マシンを起動し、ソーター(コレクションチューブホルダを含む)のすべての温度を4°Cに設定します。 機器の品質管理を行い、ドロップ遅延を設定します。</li>
		<li>事前のギャティング戦略を設定し、テストのソートを実行します。 注: FACS を使用する場合は、100 μm のノズルを使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューションを準備します(手順1.2.1-1.2.3)。<ol>
<li>洗浄液:HBSS(ハンクスのバランス塩溶液)で新鮮な2%FBS(牛血清)を準備します。</li>
		<li>消化混合物:フレッシュコラゲナーゼP(3 U/mL)をHBSSに完全に溶解させて準備します。</li>
		<li>オプション: 単細胞懸濁液を-80 °Cで保存するために、フレッシュHBSS + BSA (0.04%)と冷蔵分析グレードのメタノールを-20 °C冷凍庫で準備します。 注: 実験を開始する前に、ステップ 1 を実行する必要があります。利用された溶液の組成は 補足表1にまとめた。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 実験動物・歯の準備
<ol><li>実験動物(マウス)を準備する。<ol>
<li>現地の規則に従ってマウスを安楽死させる。例えば、麻酔薬による過剰摂取は、前述のとおり1. 注意:実験動物の人道的安楽死に関する規制は、局所的に異なります。常に有効な現地の規制に従ってください。</li>
		<li>直ちに組織解剖工程(ステップ3)に進む。 注:実験動物の組織を直ちに解剖できない場合(例えば、動物の住施設からの移動など)、実験動物を氷の上に置き、できるだけ早く組織解剖を行う。マウスモルパルプからより多くの細胞を得るために、若い(6週間以下)動物を使用する。年齢が増加すると、歯科パルプのサイズが小さくなります。マウスの切歯は、主に年齢の増加に伴って構造を維持するので、様々な年齢の動物が組織解剖に使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>人間の歯を準備する 注:人間の歯は、臨床的に関連する理由のために抽出されました。すべての診断は個別に治療され、経験豊富な歯科外科医は常に抜歯を行った。<ol>
<li>抽出した歯をすぐに氷冷HBSSで50mLチューブに入れ、さらに処理されるまでチューブを氷の上に置きます。 注:最高の細胞収量のために25-30歳まで患者からの保持された親知らずを使用することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組織解剖
<ol><li>実験動物の頭の後ろに持ち、尾が離れて指し出るように頭の腹側を見てください。</li>
	<li>小さくて鋭いはさみを使用して、下顎骨のアーチ、下顎骨の各半分の間の軟部組織、および隣接する顔の筋肉を露出させるために、すぐに下顎骨から皮膚を取り除く。<ol>
<li>下顎の両側から深いカットを行います。まず、顎関節までの下顎骨側のバッカル側に沿ってm.マッセターを通り、次に口腔の基部を通って下顎骨の各半分の内側に沿って( 補足図1を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>口腔の外側と内側の両方から顎関節まで下顎骨に沿ってすべての筋肉と靭帯を切断します。 注: ボーンを切断しないでください。これは、切歯の最もアプリカル部分を損傷する可能性があります。</li>
	<li>曲がった先端ピンセットを使用して下顎を握り、それを取り除きます。次に、解剖した下顎骨を下顎骨共生を切断して、はさみで2つの半分に分割します( 補足図1を参照)。</li>
	<li>工業用低糸口ワイプを使用して、下顎骨の各半分から残りの軟部組織を切り落とします。下顎の両方の部分を洗浄した後、氷冷HBSSで事前に準備されたペトリ皿に入れます。 注:この時点から、氷の上で作業してください。マウスの切歯および臼歯の更なる解剖は、黒い背景を有する実体顕微鏡下で行われる。</li>
	<li>マウス下顎切歯<ol>
<li>下顎切歯の解剖のために、3つの大臼歯すべてを持つ歯槽尾根を取り除き、第1モルと第2のモルの間の位置に対応する場所で下顎弓を横切って割る。 注:鋭いメスの刃の11とピンセットは、このステップを実行するために使用されます( 材料表を参照)。</li>
		<li>歯ソケットの残りの部分から慎重に切歯を引き出します。 注:成功した場合、抽出された切歯は完全な頸部ループを有する上皮組織を含む無傷の尖壁部分を含む。</li>
		<li>必要に応じて、ピンセットとメスで切り傷に付着した骨の残りの断片を除去します。</li>
		<li>解剖した切歯を新鮮な氷冷HBSSに入れ、子宮頸部ループ、歯髄、または歯の他の部分など、目的の組織を解剖します。</li>
		<li>解剖した軟組織を、10cmのペトリ皿の真ん中に新鮮な氷冷HBSSの液滴に入れます。氷の上に置いておきなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス下顎臼歯<ol>
<li>下顎臼歯を解剖するために、メスの刃を使用して下顎骨の残りの部分から歯槽尾根を完全に取り除きます。</li>
		<li>解剖された歯槽の紋章をペトリ皿の新鮮な氷冷HBSSに移動し、根に取り付けられた歯槽骨の残りの断片をすべて慎重に取り除きます。</li>
		<li>歯槽の骨のない解剖した臼歯を新鮮で氷冷HBSSに入れる。パルプを露出するには、パルプキャビティに到達するまで、細かい鋭利な先端ピンセットを使用して、象牙質側から象牙質の一部を取り除き始めます。</li>
		<li>パルプ腔に達したら、鋭い先端ピンセットを使用して歯科パルプを慎重に解剖し、歯髄の軟部組織を氷の上に保管された10cmペトリ皿の真ん中に新鮮で氷冷HBSSの液滴に入れます。 注:マウスの大臼歯のパルプは非常に小さいので、それに応じて実体顕微鏡で倍率を調整してください。</li>
	</ol></li>
	<li>人間の歯<ol>
<li>氷冷HBSSでもう一度人間の歯を洗い、残りの血液を取り除きます。</li>
		<li>歯を3つの厚い壁の無菌プラスチック袋に入れ、鋳鉄製のベンチトップエンジニアのバイスを使って歯を割ります。袋を貫通しないように、平らな表面を持つバイス顎を使用してください。</li>
		<li>歯の割れが聞こえるまで、ゆっくりと万力を締めます。袋から取り出し、ペトリ皿の新鮮な氷冷HBSSに入れます。</li>
		<li>2つのピンセットを使用して、歯科パルプを取り出し、硬い組織のすべての残骸からそれをきれいにし、氷の上に保管された10cmペトリ皿の真ん中に氷冷HBSSの1液滴に入れます。 注意:人間の組織は感染する可能性があります。人間の組織を扱うときは、組織との直接接触を避けるために保護装置を使用してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 単細胞懸濁液の調製
<ol><li>15 mL チューブを用意し、2.5 mL の消化液を HBSS に完全に溶解したコラゲローゼ P (3 U/mL) で構成します。使用するまで氷の上にソリューションを保管してください。 注:常に作りたてのコラゲラーゼPを使用してください。アリコートを凍結しないでください。コラゲラーゼP活性はバッチからバッチまで異なります。希釈する前に、バッチのアクティビティを確認してください。コラゲナーゼPはカルシウムによって活性化され、その量は既に凍結乾燥粉末で十分である。そのため、カルシウムとの酵素混合を豊かにする必要がなくなります。コラゲターゼPはFBSによって不活性化されないが、キレート剤(例えば、エチレンジアミントラセクティック−EDTA)によって不活性化され得る。解離プロセスを停止すると、ラコラーゼPを洗浄液(HBSSで2%FBS)で希釈することによって確実に行われます。FBSを追加すると、細胞の生存率が増加し、並べ替え後の最終的な数の細胞数が18に増加することが示されています。</li>
	<li>丸い形のメスの刃を10番にして、組織を全方向に切り取って、出来る限り小さくする。液滴の中央に組織片を再凝集し、丸型(No.10)メスの刃を使用して組織凝集体を繰り返し切断する。材料が十分にみじん切りになるまで、このプロセスを数回繰り返します。</li>
	<li>1 mL ピペットチップを使用して、細断された組織片を準備した消化液に移します。 注:一度に処理されている動物の数が多い場合は、コラゲナーゼPでいくつかのチューブに組織を分割します。チューブ当たりの最大量は、約10個のマウス切歯から得られるパルプです。パルプが非常に少ない大臼歯の場合、加工パルプの数を十分に増やすことができます。人間の歯を使用する場合は、パルプのサイズに応じて、チューブあたり最大2〜3個のパルプを使用してください。</li>
	<li>37°Cの予熱インキュベーターに、シェーカーでチューブを入れます。シェーカー内のチューブを60°の角度に傾け、チューブ内の一定のサスペンションの動きを確実にするために速度を150〜200rpmに設定します。</li>
	<li>すべての塊を崩壊させるために1 mLピペットチップで3〜4分ごとに懸濁液を激しくトリチュレートします。 注:時間が経つと、塊はほとんど消えるまで小さく、柔らかくなります。</li>
	<li>合計で、15〜20分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、最後にトリチュレートし、最後の体積12mLに氷冷洗浄液をゆっくりと加えます。</li>
	<li>50 μmの細胞ストレーナーを使用して懸濁液を濾過して、残りの塊または石灰化組織の破片を取り除きます。</li>
	<li>濾過細胞懸濁液の10〜20 μLを取り、細胞計数チャンバー(ヘモサイトメーター)を使用して遠心分離中に細胞を数えます。遠心分離機は4°Cで300xgで5分間 10 mL血清ピペットを使用して上清を取り除く。 注: 希釈された懸濁液でカウントできないセル数が制限されている場合は、セルカウントをスキップし、すべてのセルを使用して処理を続行します。</li>
	<li>オプション: 固定およびストレージ21に進みます。<ol>
<li>HBSS + BSA (0.04%)の100 uLにペレット(最大107 細胞)を再懸濁します。</li>
		<li>冷やしたメタノールを400μL加え、ゆっくりと混ぜます。</li>
		<li>細胞懸濁液を氷の上で15分間インキュベートします。</li>
		<li>処理されるまで-80°Cで保管してください(1ヶ月以内)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄液中のペレットを再び懸濁します。洗浄液の700-1200細胞/μLを目指します。</li>
	<li>さらに処理されるまでチューブを氷の上に置いてください。 注:必要に応じて、-80°Cで固定および保管を行ってください。 しかし、scRNA-seqに対する細胞懸濁液の即時処理が推奨される。さらなるステップは、単一細胞RNA seqプロトコルに依存する。scRNA-seq プロトコルがマイクロ流体システムを使用する場合 (いくつかの sc-RNA-seq 企業が行います)、直接または細胞の並べ替え後に、メーカーのガイドラインに基づいてセルをロードします。</li>
	<li>FACS の場合は、手順 5 に進みます。</li>
</ol>5. 蛍光活性化細胞分類(FACS)
<ol><li>ソートする前に、セルソート器を準備します。<ol>
<li>システム全体を4°Cに冷却し、機器の品質管理を行い、落下遅延と偏向プレートの電圧を設定します。コレクションチューブをコレクションチューブホルダーに入れます。 注:不要な細胞損失をもたらす追加の遠心分離ステップを避けるために、洗浄液の少量(25〜50 μL)のマイクロチューブ(1.5 mL)に細胞を分類します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オプション: FACS の前に生存率染色を実行します。<ol>
<li>FACSの前にヨウ化プロピジウムを細胞懸濁液に加え、最終濃度0.5μg/mLにし、4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルをセルソーターにロードします。細胞の破片、ダブレット、死んだ細胞を除去するための厳格な格言戦略を設定します。細胞を準備チューブまたはマルチウェルプレートにソートします。図 2 に、ゲージ戦略の例を示します。 注: 操作手順を最小限に抑え、プロトコルを高速化するには、実行可能性染色を使用するのではなく、厳密な格言戦略 ( 図 2 で推奨) を適用することをお勧めします。免疫細胞を単離集団から分離するために、CD45抗体染色を行うことができる。これを行うために、細胞懸濁液を100μLの染色溶液(PBS+ 2%FBS + 抗CD45-APC共役抗体1/100希釈)で再懸濁させる。光から保護された氷上で15分間インキュベートし、FACSを直接実行します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

細胞レベルまたは分子レベルで歯や骨を研究することは、これらの組織を形成する細胞が異なる種類の硬い行列19に囲まれているため、一般的に困難です。歯科組織上で単細胞RNA-seqを行うための主な目標の1つは、転写体に人工的な変化を起こしることなく、関心のある細胞を迅速に取得する必要性である。これを達成するために、マウスおよびヒト歯髄から細胞を単離するのに適した高効率のプロトコルが開発され、すべての転写アプリケーションのための単細胞懸濁液の迅速な生成が可能となった。これは、組織と細胞の操作のステップを最小限に抑え、機械的および酵素的消化を合理化することによって、迅速な組織分離によって保証された。
このプロトコルの最も重要なステップは、高速組織処理および適切な単一細胞懸濁液調製8,9です。手動アプローチは、歯科ドリルやその他の発熱装置を利用せずに歯科パルプを得るために使用されます。過熱は、ヒートショックタンパク質および他の遺伝子の人工的な発現を引き起こし、最終的には元の組織20の代表でない分析された遺伝子発現パターンにつながる可能性がある。手動組織の収穫は、おそらく事前にいくつかの訓練を必要とする困難なステップかもしれません。その後、パルプを小さく切り、37°Cで酵素消化する。 酵素消化の15〜20分を除いて、プロトコル全体が4°Cで行われます。 組織処理、特に酵素消化は、37°Cでより長期のインキュベーションが遺伝子発現パターンの変化を引き起こす可能性があるため、可能な限り最短の時間まで最小化した。酵素消化の前に象牙質の機械的除去が推奨されます。デンチンとパルプ付きプレデンチンは、コラーゲンの多くが含まれていて、その過剰な存在は、消化液の有効性を低下させる可能性があります。体から除去された後(または生物の死)、細胞が遺伝子発現パターンを迅速に改変し始めることを示した12。したがって、細胞の分離と処理は、できるだけ速く行う必要があります。現在のプロトコルは、組織(安楽死動物)を単細胞懸濁液の調製に35〜45分に処理時間を短縮する。
この技術の代替的な変更の1つは、後で使用するための細胞保存です。これはメタノール固定によって達成される。メタノール固定細胞懸濁液は、プロトコル21に記載されているように、−80°Cで1ヶ月まで保存することができる。しかし、メタノール固定単細胞懸濁液からの単細胞データは、ストレス関連遺伝子の発現増加や周囲RNA22による汚染に苦しむ可能性があるため、可能な限りscRNA-seqを直接実行します。この手順では、製造元のプロトコルに応じて追加の変更が必要になる場合があります。
このプロトコルの最初のアプリケーションの前に、いくつかの検証手順を実行して、この手法をテストすることをお勧めします。我々の経験から、我々は、プロトコルの前述の重要なステップをテストすることをお勧めします。さらに、コラゲナーゼP溶液の有効性を試験し、組織解離工程の取り扱いを試験することを提案する。具体的には、コラゲターゼPインキュベーションの開始後の最初の5分前後で、組織の断片が一緒に凝集する必要があります。これは一般的な状況です。凝集体は1 mLピペットを使用して3〜4分ごとに崩壊し、時間が長くなると、ほとんど見えないまで小さくなるはずです。
さらに、遠心分離前および濾過前後の細胞計数室で細胞計数を行い、最適でない上清除去による細胞損失の可能性を検出することが推奨される。最終的な単一細胞懸濁液を精製する必要がある場合は、FACSを使用することができます。細胞の選別は、デブリや死んだ細胞を除去するだけでなく、蛍光標識された細胞13,19で最終的な懸濁液を豊かにすることを可能にします。セルソーターのせん断応力や詰まりを避けるために、広いノズル(85 μmまたは100 μm)を使用します。これにより、ソートされた細胞の生存率がさらに向上します。
この技術は、マウスと人間の歯の両方で設計され、テストされました。主な制限要因は、古いマウス(臼歯)とヒトの歯の歯の減少した歯髄の少数の細胞である。より多くの細胞を得る必要があるか、高齢患者の歯から細胞を獲得する必要があるとします。1つの可能な解決策は、より多くの歯を処理し、それらを単一のバッチにマージし、その後1つのサンプルとして処理することです。
ヒト歯髄の生細胞は、コラゲターゼIとジスパーゼ23の酵素混合物を使用して20年以上前に最初に単離された。それ以来、歯髄細胞の分離が広く利用され、幾つかの技術が用いられてきた。ここで提示される方法の重要な意義は、scRNA-seqの最終的な細胞懸濁液の高品質を確保するために、分離を迅速かつ穏やかにするためのすべての分離ステップの適応です。より高い細胞収率は、酵素でより長期のインキュベーションによって得ることができる。このプロトコルは、単一細胞RNAシーケンシングに適した品質のマウスおよびヒトの歯から単一細胞を迅速に取得するための効率的なソリューションを提供します。この技術は、わずかな技術的な変更を伴う他の組織や生物に広く使用することが期待されています。

単細胞RNAシーケンシングは、生体内細胞集団構造、階層構造、相互作用、ホメオスタシス1,2を解読するための強力なツールです。しかし、その結果は、この高度な分析の最初のステップに強く依存する - 複雑でよく組織化された組織から完璧な品質の単一細胞懸濁液の調製。これは、細胞を生き続け、細胞の遺伝子発現プロファイルにおける望ましくない人工的な変化を防ぐことを含む3,4。このような変化は、人口構造の不正確な特徴付けと収集されたデータの誤った解釈につながる可能性があります。
広範囲の組織から分離するための特定のプロトコルが開発された5,6,7,8。それらは通常、様々なタンパク質分解酵素とのさらなるインキュベーションと組み合わせて機械的解離を採用する。これらは典型的には、トリプシン、コラゲターゼ、ディスパーゼ、パパイン6、7、8、9、またはアククターゼ、トリプル等の市販の酵素混合物を含む。トランスクリプトームの品質に影響を与える最も重要な部分は酵素消化です。37°Cで酵素を使用した長時間のインキュベーションが遺伝子発現に影響を及ぼし、多くのストレス関連遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすことが示された10,11,12,13。分離プロセスのもう一つの重要なパラメータは、細胞転写体が組織虚血14の後に変化することが示されているように、その全長である。このプロトコルは、複雑な組織から細胞を分離するために以前に使用されたプロトコルを、他の組織よりも速く、マウスおよびヒトの歯から単一細胞を穏やかに分離するための効率的なプロトコルを提示する5,6,9,11,13,15,16。
このプロトコルは、硬い歯から軟部組織を迅速に解剖し、scRNA-seqに適した単細胞懸濁液を調製する方法を提示する。この方法は、遠心分離ステップを1つだけ採用し、組織の取り扱いと消化時間を短縮し、ほとんどの場合、組織と細胞を4°Cに保つことによって、望ましくない転写変化の影響を最小限に抑えます。この手順は、マウスの切歯、大臼歯、およびヒトの親知らずからの細胞の分離を例に示すが、主に様々な生物の他の歯のために働くべきである。完全なプロトコルは図 1 で概略的に視覚化されます。このプロトコルは、マウスとヒトの歯1から得られた歯科細胞型アトラスを生成するために最近使用されています。

<table><tbody><tr><td>APC 抗マウス CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103112</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンフラクション V</td><td>ロシュ</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50 & マイクロ;m, 滅菌済み</td><td>シスメックス</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼP (COLLP-PRO)</td><td>ロシュ</td><td>11213857001</td><td></td></tr><tr><td>CUTFIX メス用刃, 図10</td><td>AESCULAP</td><td>16600495</td><td></td></tr><tr><td>CUTFIX用メス用, 図11</td><td>AESCULAP</td><td>16600509</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (南米), 超低エンドトキシン</td><td>バイオセラ</td><td>FB-1101/500</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+</td><td>SIGMA</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>工業用低リントワイプ、MAX60</td><td>Dirteeze</td><td>MAX60B176</td><td></td></tr><tr><td>工業用強力ピンセット、スタイル660、曲がった鋸歯状の尖った先端、150mm</td><td>Value-Tec</td><td>50-014366</td><td></td></tr><tr><td>メチルアルコール A.G.</td><td>ペンタ</td><td>21210-11000</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム溶液</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr>メス<tr><td>ハンドル</td><td>CM Instrumente</td><td>AG-013-10</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット 10mL、個包装、200個</td><td>CAPP</td><td>SP-10-C</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>EZ4</td><td></td></tr><tr><td>手術ハサミ (9cm)</td><td>CM Instrumente</td><td>AI-430-09Y</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 & オスラッシュ; 100mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスとヒトの歯からの単一細胞の迅速な分離

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

マウスと人間の歯は、単一細胞の転写や他のアプリケーションのための迅速かつ効率的な細胞分離のための挑戦的な器官を表します。細胞外マトリックスが豊富な歯髄組織は、一般的に単細胞転写学の合理的な時間を超える長く退屈な解離プロセスを必要とする。遺伝子発現の人工的な変化を避けるために、単一細胞の分析が最小限に抑えられるまで、動物を安楽死させるまでの時間を最小限に抑える必要があります。この研究は、scRNA-seq(単細胞RNAシーケンシング)に適した優れた品質で、マウスおよびヒトの歯から単細胞懸濁液を得ることを可能にする高速プロトコルを提示する。このプロトコルは、加速組織分離ステップ、酵素消化、および最終的な単一細胞懸濁液のその後の調製に基づいています。これにより、組織の迅速かつ穏やかな処理が可能となり、高い生存率と最小限の転写変化を伴う細胞懸濁液を得るために、より多くの動物またはヒトのサンプルを使用することができます。このプロトコルは、マウスや人間の歯だけでなく、軟骨、密結合組織、真皮を含む他の細胞外マトリックスが豊富な組織にもscRNA-seqを実行することに興味を持つ研究者を導く可能性があると予想されます。

単一細胞の例示的な単一の分離は、1つの6週齢のC57BL/6マウス雄から2つの下顎切歯から行った。このプロトコルに従って、単一細胞懸濁液を調製し、その後、単一細胞シーケンシングを行った。調製された単一細胞懸濁液を、FACSを用いて分析し、並べ替えた(図2)。まず、FSC-A(前方散乱、面積)およびSSC-A(側面散乱、面積)プロットを適用し、適切なゲートリング戦略を使用して、細胞デブリや細胞ダブレットまたは凝集体をフィルタリングするために、予想されるサイズと粒度を持つ集団を選択しました(図2A)。この選択された母集団(P1)は、全ての事象の38%を数え、さらに使用され、残りのセルダブレットを除去するためにFSC-AおよびFSC-H(前方散乱、高さ)パラメータを適用した(図2B)。P1の95%を数える細胞ダブレット(P2)を含まない集団は、続いてscRNA-seqに使用することができる。あるいは、追加の格子を使用して、目的の集団(例えば、蛍光タンパク質の発現または生死死染色)を選択することができます。最終懸濁液中の生細胞/死細胞数を確認するために、PI(ヨウ化プロピジウム)染色を行った(図2C)。PI- (生きている)細胞を含むP3集団は、親P2集団のうち98.4%、イベント全体のうち35.5%であった。除外された死んだ(PI+)細胞の総数は1887であった。
RNA-seq(P2)に適した生存性染色なしで得られた最終的な数の細胞は、2つのマウス切歯パルプから118,199個の細胞を数えた。これは、1つの下顎切歯から約60,000個の生細胞の数を意味します。
最終的な単細胞懸濁液における免疫細胞の数を明らかにするために、2つのアプローチが用いられた。まず、CD45抗体染色とその後のFACS分析を使用した。補完的な方法として、scRNA-seqデータにおける免疫細胞の総数(CD45+)を分析した。FACS分析では、CD45+細胞の14.44%(13.20%が生きて1.24%死んでいる)が示されました(図3A)。scRNA-seqデータの分析は、CD45発現細胞の10.90%を示した(図3B)。scRNA-seq データにおける CD45+ 細胞の減少は、scRNA-seq 分析中の追加の閾値によって引き起こされる可能性があります。
マウス切歯の例に関するこれらの代表的なデータは、厳密な格言戦略と組み合わせて与えられたプロトコルが、生存性染色の追加使用を必要とせずに、単一のマウス歯から多数の細胞を得るのに効率的であることを示している。免疫(CD45+)細胞の比率は軽微であった(13.2%)。さらに、免疫細胞は歯の恒常性維持に不可欠であることが以前に示されていたので、FACS中のscRNA-seq分析からそれらを取り除くことは、いくつかの用途では逆効果であろう。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略表現 温度条件や予想時間を含む異なるステップが表され、マウスおよびヒトの歯からの単細胞懸濁液を調製する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig02.jpg"> 図2:格言戦略の例 FSC-AおよびSSC-Aゲーティングは、P1ゲートを生成するために使用され、予想されるサイズと粒度を有する細胞集団を反映し、細胞および細胞外マトリックスの破片および最も大きな事象をフィルタリングした(A)。その後、P1母集団をFSC-HプロットとFCS-Aプロットでプロットし、セルダブレット(B)を除外しました。このP2集団を、ヨウ化プロピジウム(C)により死細胞の存在について分析した。ゲートあたりのイベント/セルの数は、(D)で表されます。(FSC-A - 前方散乱、エリア;SSC-A - サイドスキャッタ、エリア。FSC-H - 前方散乱、高さ。PI - ヨウ化プロピジウム)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63043/63043fig03.jpg"> 図3:免疫細胞の定量化。 免疫細胞の定量は、プロピジウムヨウ化物染色(A)を用いて抗CD45抗体で染色された細胞のFACS分析およびライブ/デッド分析によって行った。さらに免疫細胞の定量化は、scRNA-seq分析(B)の間に行った。(CD45-APC - 抗CD45アロフィコシアニン共役抗体;PI - ヨウ化プロピジウム;t-SNE - t分散ストカスティック隣接埋め込み)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/63043fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補助図1:下顎解剖プロセスの概要 破線は、推奨されるカットを示しています。TMJ - 顎関節、m.マッセッター - 筋骨格。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/Supplementary%20figure%201.png" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:研究で使用される溶液の組成物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63043/Supplemental%20table%201.docx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

現在のプロトコルは、成長し続けるマウス切歯、マウス臼歯、およびヒトの歯から単細胞RNA-seq分析に適した単一細胞を単離するための迅速で効率的で穏やかな方法を提示します。

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

調製された単一細胞懸濁液の品質は、任意の単一細胞オミクスの方法論のための高品質で信頼性の高い結果を得るために重要です。そして、このプロトコルは、非常に困難な組織から細胞を迅速かつ穏やかに、かつ堅牢に分離する方法を示します。このプロトコルの主な利点は、組織解離と完全な品質と短時間で多数のサンプルからの細胞の分離を可能にする合理化された組織処理です。この方法はマウスやヒトの歯のために開発されましたが、軟骨、骨、または密結合組織を含む他の細胞外マトリックスが豊富な組織にも適用される可能性があります。歯髄をヒト、特にマウスの歯から分離する手順は、手動で困難です。実際の実験が始まる前にこれをテストすることをお勧めします。まず、安楽死させたマウスを頭の後ろに持ち、尾が離れて指し出るように頭の腹側の側面を見てください。小さくて鋭いはさみを使用して、下顎骨のアーチ、下顎骨の各半分と隣接する顔の筋肉の間の軟部組織を露出させるために、すぐに下顎骨から皮膚を取り除きます。下顎骨の両側から深い切り口を作るために、まず下顎関節までの下顎側の頬側に沿ってマッセターを切り抜き、次に口腔の基部を通して下顎骨の各半分の内側に沿って切断する。口腔の外側と内側の両方から顎関節まで下顎骨に沿ってすべての筋肉と靭帯を切断します。曲がった先端ピンセットを使用して下顎を握り、それを取り外します。その後、はさみで、下顎の共生を切り裂き、解剖された下顎骨を2つの半分に分割する。工業用低糸口ワイプを使用して、下顎骨の各半分から残りの軟部組織を切り落とします。下顎の両方の部分を洗浄した後、氷冷HBSSで事前に準備されたペトリ皿に入れます。下顎切歯の解剖のために、3つの大臼歯すべてを有する歯槽尾根を取り除き、第1モルと第2モルの間の位置に対応する場所で下顎骨アーチを横方向に割る。歯ソケットの残りの部分から慎重に切歯を引き出します。必要に応じて、ピンセットとメスで切歯に取り付けられた骨の残りの断片を除去します。解剖した切歯を新鮮な氷冷HBSSに入れる。目的の組織を解剖した後、解剖した軟部組織を氷の上に保管された10センチメートルのペトリ皿の真ん中に新鮮な氷冷HBSSの液滴に入れます。丸い形の10個のメスの刃を使用して、組織を可能な限り小さな部分に切ります。液滴の中央に組織片を再凝集させた後、同じメスの刃で組織凝集体を繰り返し切断し、材料が十分にミンチされるまでこのプロセスを繰り返す。1ミリリットルのピペットチップを使用して、細断された組織片を、以前に調製した消化混合物に移します。その後、チューブを60度の角度に置き、チューブ内の一定の懸濁液の動きを確保し、15〜20分間インキュベートするために150〜200RPMの速度を設定します。インキュベーション中に3〜4分ごとに、すべての塊を崩壊させるために1ミリリットルのピペットチップを使用して懸濁液を激しく刺激する。インキュベーションの終わりに、最後の時間の細胞懸濁液を刺激した後、12ミリリットルの最終体積に氷冷洗浄液をゆっくりと加える。セル懸濁液を摂氏4度で5分間5分間Gの300倍にして、10ミリリットルの血清ピペットで上清を慎重に取り除きます。洗浄液中のペレットを再懸濁して、マイクロリットル当たり700~1,200細胞の最終濃度を達成する。50マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を通過し、残りの塊または石灰化した組織の破片を取り除き、さらに処理されるまでチューブを氷の上に保ちます。次に、蛍光活性化細胞選別のために、細胞を調製されたチューブにロードします。細胞のソーターにチューブをロードし、テキスト原稿に記載されているように細胞の破片、ダブレット、および死んだ細胞を除去するための厳格なゲートリング戦略を設定します。まず、CD45抗体染色とその後のFACS分析を用いて、最終的な単細胞懸濁液中の免疫細胞の数を明らかにした。無料の方法として、単細胞RNAシーケンシングデータにおけるCD45陽性免疫細胞の総数を分析した。FACSを用いて、14.44%CD45陽性細胞を同定した。単一細胞RNAシーケンシングデータの分析は、CD45発現細胞の10.9%を示し、単細胞RNAシーケンシングデータにおける細胞の減少は、シーケンシング分析中の追加の閾値化によって引き起こされる可能性がある。重要なことは、速く、可能な限りこの組織や細胞を氷の上に保つことです。分離細胞の数は、特にマウスの臼歯の分離時に非常に少なくなる可能性があります。細胞損失を避ける。単一細胞の分離の時間を短縮することは、すべての単一細胞実験の成功のために非常に重要です。そして、この特定の方法は本当にこの時間を減らし、マウスおよび人間のシステムのための高品質の歯科細胞タイプのための道を開くことを可能にした。

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