Name: 細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶマウス造血幹・前駆細胞の細胞生体エネルギー評価法。細胞外フラックス分析装置でECARとOCRをリアルタイム測定し、解糖系とミトコンドリア機能を解析。96ウェルプレートによる高スループット定量で、造血幹細胞の代謝経路と多能性維持機構を解明します。

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ロンバード研究所での研究は、NIH(NIGMS R01GM101171、NIEHS R21ES032305)、国防総省(CA190267、CA170628、NF170044、ME200030)、およびGlenn Foundation for Medical Researchによってサポートされています。李研究室での作業はNIH(NHLBI 5R01HL150707)によってサポートされています。

<ol><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+%28HSPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
<li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li>
<li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells%3A+new+perspectives+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%2C+Fourth+Edition%22">Bioenergetics, Fourth Edition</a>. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).</li>
<li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent%3A+mechanism+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

この方法論文は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析装置を用いてマウスHSPCにおける細胞生体エネルギー学(解糖系およびOxPHOS)の評価のための最適化されたプロトコールを記載している。この装置は、解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である生細胞のECARおよびOCRを同時に測定する強力なツールである。したがって、細胞生体エネルギー学をリアルタイムで評価するために使用することができる。さらに、96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度でハイスループット定量を提供し、別の高分解能呼吸計、2つのサンプルを同時に分析できるOroboros O2k、または古典的なクラーク電極20と比較して、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。
細胞外フラックス分析計は、細胞が単層に存在する必要があり、懸濁状態で増殖した細胞を分析することがより困難になるため、主に付着細胞型の分析に使用されてきました。また、ポートからの薬物注入後、測定前のウェルにおける薬物・培地混合サイクル中に乱流が生じ、細胞が脱落することが...

造血は、高度に専門化された機能を有する様々なタイプの成熟血液細胞がHSCs1から形成されるプロセスである。HSCは、自己複製および様々な多能性および系統特異的な前駆集団への分化が可能である。これらの前駆細胞は、最終的にリンパ系、骨髄系、赤血球系、および巨核球系譜の細胞を産生する。自己複製能力を維持するために、HSCは大部分が静止したままであり、他の組織幹細胞と同様に、ATP産生のためにミトコンドリアOxPHOSではなく解糖系に依存すると考えられている2,3。細胞周期に入ると、呼吸とOxPHOSが増強され、HSCの維持と機能に有害な活性酸素種(ROS)のレベルが上昇します3。したがって、細胞分裂を繰り返すと、HSCの自己複製能力が低下し、最終的には枯渇する可能性があります。
成体造血では、HSCは主に非対称細胞分裂を受け、その間、娘細胞の1つがHSC電位を保持し、解糖系代謝に依存し続ける。もう一方の娘細胞は、自己複製能を失うが増殖し、最終的に分化した機能造血細胞4を生じさせる原始前駆細胞となる。HSCが分化して下流の祖先を産生すると、HSCが不活性なミトコンドリア塊を有するという観察によって示唆されるように、解糖系からミトコンドリア代謝への切り替えが起こると考えられている5、HSCが不活性なミトコンドリア塊6、7、8、9.対照的に、ミトコンドリア活性(リンクされたROSレベルによって示される)は、HSCs9、10、11よりも系統コミットされた前駆細胞においてはるかに高い。したがって、造血の初期段階で起こる代謝変化は、HSCの運命を調節する上でのミトコンドリアの直接的かつ重要な役割を示唆している。
老化、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス条件下で存在する機能不全のミトコンドリア12は、HSCの自己複製能力を妨害し、過剰な量のROSを産生し、ATP産生を損ない、および/または他の代謝プロセスを変化させることによってHSC/前駆分化の不均衡を誘発する可能性がある9,12,13.HSC/前駆分化における代謝恒常性における摂動は、造血に重大な影響を及ぼし、血液学的異常の発症に寄与する可能性がある13。解糖系およびミトコンドリアOxPHOSがHSCのステムネスおよび分化に及ぼす重大な影響を考えると、正常およびストレス条件下で両方の代謝パラメータを調査することが興味深い。HSCおよび前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、細胞の解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標であるECARおよびOCRをそれぞれ評価することによって得ることができる。
タツノオトシゴ細胞外フラックス分析計は、生細胞中のECARおよびOCRを同時に測定するためにウェルあたり2つのプローブを備えた強力な装置であり、したがって、様々な基質または阻害剤に応答して、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。分析装置で使用されるアッセイカートリッジには、アッセイ中に自動注入用の最大 4 つの薬物を保持する注入ポートが含まれています。典型的な解糖系ストレス試験のスキームを 図1Aに示す。アッセイは、グルコースまたはピルビン酸を含まないグルタミンを含む解糖系ストレス試験培地中でインキュベートした細胞のECARの測定から始まる。これは、細胞の非解糖系活性のために起こる酸性化を表し、非解糖系酸性化として報告されている。これに続いて、飽和濃度でのグルコースの注射が続く。解糖系を介して、細胞内のグルコースはピルビン酸に変換され、これはさらに細胞質内で代謝されて乳酸塩を生成し、またはミトコンドリア内でCO2 および水を生成する。
グルコースから乳酸への変換は、細胞外培地へのプロトンの正味産生およびその後の放出を引き起こし、その結果、ECAR14、15、16の急速な増加をもたらす。ECARにおけるこのグルコース刺激変化は、基礎条件下で解糖系として報告される。2回目の注射は、ミトコンドリアATP産生を阻害するオリゴマイシン(ATP合成酵素、別名複合体V17の阻害剤)からなる。オリゴマイシン媒介性OxPHOS阻害の間、細胞は解糖系を最大限アップレギュレートして、その精力的要求を満たす。これはECARのさらなる増加を引き起こし、細胞の最大解糖系能力を明らかにする。最大解糖系容量と基礎解糖系との差を解糖系予備量と呼ぶ。最後に、2-DGが注入され、これはECARの有意な低下を引き起こし、通常は非解糖系酸性化レベルに近い。2-DGは、ヘキソキナーゼに競合的に結合し、解糖系18の阻害をもたらすグルコース類似体である。したがって、ECARの2-DG誘導性減少は、解糖系が実際にグルコースおよびオリゴマイシン注射後に観察されるECARの供給源であることをさらに確認する。
図1B は、典型的なミトコンドリアストレス試験の概略を示す。アッセイは、細胞のベースラインOCR測定から始まり、グルコース、グルタミン、およびピルビン酸を含むミトコンドリアストレス試験培地中でインキュベートする。基礎OCR測定に続いて、このアッセイにおいてオリゴマイシンが注入され、これは錯体Vを阻害し、それによって電子輸送鎖(ETC)を通る電子流を減少させる17。その結果、オリゴマイシン注射に応答してOCRが減少し、このOCRの減少がミトコンドリアATP産生と関連している。2回目の注射は、カルボニルシアン化物-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、プロトノフォアおよびミトコンドリアOxPHOS17のアンカプラーからなる。FCCPは、ミトコンドリア内膜を横切るプロトンの流れを可能にすることによってミトコンドリアプロトン勾配を崩壊させる。FCCP注入のために、ETCを通る電子流は抑制されず、錯体IVは最大レベルで酸素を消費する。最大OCRと基礎OCRの差は予備呼吸能力と呼ばれ、ストレス条件下でのエネルギー需要の増加に応答する細胞の能力の尺度である。最後に、2つのETC阻害剤(ロテノン、複合体I阻害剤、およびアンチマイシンA、複合体III阻害剤17)の混合物が注入され、電子の流れが完全に遮断され、OCRは低レベルに低下する。ロテノンおよびアンチマイシンA注射後に測定されたOCRは、細胞内の他のプロセスによって駆動される非ミトコンドリアOCRに対応する。非ミトコンドリアOCRは、基礎呼吸、陽子漏れ、および最大呼吸の計算を可能にします。
基礎呼吸は、ベースラインOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。プロトンリークは、オリゴマイシン注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を指す。最大呼吸は、FCCP注射後のOCRと非ミトコンドリアOCRとの差を表す。結合効率は、基礎呼吸数に対するATP生産率の割合として計算される。この方法論文は、タツノオトシゴXFe96細胞外フラックス分析装置を使用して系統陰性HSPC中のECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコルを提供する。このプロトコールは、マウス系統陰性HSPCを単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および細胞外フラックスアッセイで使用される様々な薬物の濃度の最適化を説明し、薬物治療戦略を説明する。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;mフィルター</td><td>コーニング</td><td>430626</td><td>アッセイ培地のろ過滅菌に使用</td></tr><tr><td>100 mM ピルビン酸ナトリウム</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11360-070</td><td>ミトコンドリアストレステストアッセイ媒体の成分</td></tr><tr><td>15mL 円錐形ファルコンチューブ</td><td>コーニング</td><td>352096</td><td>HSPCの収穫時に使用され、アッセイ薬液の調製に使用</td></tr><tr><td>200 mM L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 25030-081</td><td>解糖ストレステストおよびミトコンドリアストレステストアッセイ培地の成分</td></tr><tr><td>2-デオキシ-D-グルコース (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>解糖ストレステスト中の3回目の薬物注射</td></tr><tr><td>5倍濃縮バッファー (MojoSort)</td><td>バイオレジェン</td>ド<td>480017</td><td>HSPC収穫時の洗浄に使用</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A661-3</td><td>ACK溶解の成分バッファー</td></tr><tr><td>アンチマイシン A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>ミトコンドリア負荷試験中の 3 回目の薬物注射</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC タンパク質アッセイキット</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>製造元の指示に従って使用</td></tr><tr><td>シアン化カルボニル-4 (トリフルオロメトキシ) フェニルヒドラゾン (FCCP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>ミトコンドリアストレス試験中の 2 回目の薬物注射</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>コーニング</td><td>354240</td><td>セル接着剤。細胞マイクロプレートのコーティングに使用</td></tr><tr><td>カウント3 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O2793-500</td><td>ACK溶解バッファーおよびRIPA溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>ファルコン70 &mu;mフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td>HSPCの収穫時に細胞ストレーナーとして使用</td></tr><tr><td>Gibco Fetal wevine serum (FBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>26400044</td><td>HSPCの収穫時にアッセイバッファーを調製するために使用</td></tr><tr><td>Gibco HBSS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14175095</td><td>HSPCの収穫時にアッセイバッファーを調製するために使用</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>ミトコンドリア負荷試験アッセイ媒体の成分と解糖ストレス試験の最初の注射</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>解糖ストレステスト中の2回目の薬物注射とミトコンドリアストレステスト中の1回目の薬物注射</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>タンパク質定量のためのアッセイ後に細胞を洗浄するために使用</td></tr><tr><td>重炭酸カリウム (KHCO3)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P235-500</td><td>ACK溶解バッファー</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td>の成分 錠剤として供給されます。1錠を10 mLのRIPAバッファーに溶解して、1x PICを調製しました。</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-B220、クローンID:RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td></td><td>103203 HSPCs収穫中の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-CD2、クローンID:RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>HSPC収穫中の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-CD3、クローンID:17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>HSPC収穫中の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-CD5、クローンID: 53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>HSPCs収穫時の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-CD8, クローンID: 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>HSPCs収穫時の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-Gr-1, クローンID: RB6-8C5</td><td>バイオレジェン</td>ド<td>108403</td><td>HSPCs収穫時の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ラットビオチン抗マウス-Ter-119, クローンID: TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>HSPC収穫時の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ミトコンドリアストレステスト中の3回目の薬物注射</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XFe96 細胞外フラックス分析装置</td><td>タツノオトシゴ バイオサイエンス社 アジレント</td><td></td><td>ECARおよびOCR測定をリアルタイムで行うことができます。</td></tr><tr><td>重曹</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>マイクロプレートコーティング用細胞接着液の製造に使用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP358</td><td>RIPA溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>RIPA溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム(NaF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td>RIPA溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>1 N溶液を調製しました。pHの正常化に使用</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンナノビーズ(MojoSort)</td><td>バイオレジェンド</td><td>480015</td><td>HSPCs収穫中の系統枯渇に使用</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>RIPA溶解バッファーXF</td></tr><tr><td>ベース培地</td>の成分 <td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>ベース培地 解糖ストレステストおよびミトコンドリアストレステストアッセイ培地</td></tr><tr><td>XFプレップステーション</td><td>タツノオトシゴバイオサイエンス</td><td></td><td>非CO<サブ>2</サブに使用される > 37 &deg;C インキュベーション</td></tr><tr><td>XFe96 細胞外 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100 または 102601-100</td><td>ユーティリティプレート付きアッセイカートリッジ、アッセイカートリッジに薬物 をロードするためのローディングガイドフラット、XFキャリブラント溶液、XF細胞培養マイクロプレートが含まれています</td></tr></tbody></table>。

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

定常状態では、造血幹細胞(HSC)は大部分が静止したままであり、そのエネルギー的ニーズを満たすために主に解糖系に依存していると考えられている。しかし、感染や失血などのストレス条件下では、HSCは増殖性になり、下流の前駆細胞を急速に産生し、それがさらに分化し、最終的に成熟した血液細胞を産生する。この移行および分化プロセスの間、HSCは静止から終了し、解糖系から酸化的リン酸化(OxPHOS)への代謝スイッチを急速に受ける。加齢、癌、糖尿病、肥満などの様々なストレス状態は、ミトコンドリア機能に悪影響を及ぼす可能性があり、したがって、造血中のHSCおよび前駆細胞の代謝リプログラミングおよび分化を変化させる可能性がある。HSCおよび前駆細胞の正常およびストレス条件下での解糖系およびミトコンドリア機能に関する貴重な洞察は、それぞれ細胞解糖系およびミトコンドリア呼吸の指標である細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)の評価を通じて得ることができる。 
ここでは、細胞外フラックス分析装置を使用して、造血幹細胞および原始前駆細胞(HSPC)の両方を含むマウス骨髄由来系統陰性細胞集団におけるECARおよびOCRを測定するための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコールは、マウス骨髄から系統陰性細胞を単離するためのアプローチを説明し、細胞播種密度および2-デオキシ-D-グルコース(2-DG、解糖系を阻害するグルコース類似体)およびこれらのアッセイで使用される様々なOxPHOS標的薬物(オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンA)の濃度を説明し、薬物治療戦略を説明する。解糖系、解糖系容量、解糖系予備量などの解糖系フラックスの主要なパラメータと、基礎呼吸、最大呼吸、プロトン漏れ、ATP産生、予備呼吸能力、カップリング効率などのOxPHOSパラメータは、これらのアッセイで測定できます。このプロトコルは、非付着性HSPCのECARおよびOCR測定を可能にし、あらゆるタイプの浮遊細胞の分析条件を最適化するために一般化することができます。

このプロトコールを使用して、細胞数および様々なOxPHOS標的薬(細胞外フラックスアッセイに使用)の濃度を最適化し、24週齢の雌C57BL/6マウスから単離されたHSPCのECARおよびOCRを測定した。まず、細胞数およびオリゴマイシン濃度を最適化するために解糖系ストレス試験を行った。このアッセイでは、5 ~104 ~ 2.5 × 105 の範囲のウェルあたりのさまざまな数のHSPC×使用しました。図2Aおよび図2Cに示すように、非解糖系酸性化率は、細胞数が5×104から2.5×105に増加するにつれて上昇するが、2×105〜2.5×105細胞の間では最小限にしか増加しない。予想通り、10mMグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、CARの最大増加は1ウェル当たり2.5×105細胞で観察される。しかし、2μMのオリゴマイシンの注射は、そうでなければ予想され...

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

造血中、造血幹細胞は解糖系から酸化的リン酸化への代謝スイッチを受ける。このプロトコルは、マウス造血幹および前駆細胞の解糖系およびミトコンドリア機能を評価するために使用することができる。この方法は、細胞の生体エネルギーをリアルタイムで評価するために使用することができる。96ウェルマイクロプレートベースのプラットフォームは、高感度で高スループット定量を提供し、単一のプレートを使用して複数のサンプルを同時に分析することができます。この技術は、様々な条件下でのHSC代謝に対する化学物質または遺伝子操作の影響を調査するために使用することができる。HSCの多能性を維持する代謝経路の解明に役立つ可能性があります。現在の研究は主にマウス造血幹細胞と前駆細胞に焦点を当てていますが、プロトコルとこのアプローチは、あらゆる種類の浮遊細胞の分析条件を最適化するために容易に適応させることができます。アッセイの1日前に、細胞外フラックスアッセイキットを開き、センサーカートリッジおよびユーティリティプレートアセンブリを取り外します。翌日に使用するためにローディングガイドフラットを保存します。次に、センサーカートリッジをユーティリティプレートから手動で分離し、ユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、フラックスアッセイキットに付属の200マイクロリットルのキャリブラントでユーティリティプレートの各ウェルを満たし、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻して、センサーをキャリブラントに完全に沈めてください。次に、ユーティリティプレートをキャリブラントでインキュベートし、センサーカートリッジを非二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートし、原稿に記載されている加湿条件に従います。アッセイ当日に、本文原稿に記載されているように96穴細胞培養マイクロプレートあたり2.5ミリリットルの細胞接着溶液を調製する。フラックスアッセイキットに付属の96ウェル細胞培養マイクロプレートを開き、調製した細胞接着溶液25マイクロリットルを各ウェルの底に分注する。マイクロプレートを蓋で覆い、フード内で室温で30分間インキュベートする。インキュベーション後、マルチチャンネルピペットまたはアスピレーターを使用して余分な細胞接着溶液を取り出して廃棄し、各ウェルを200マイクロリットルの滅菌超純水で2回洗浄する。フード内部の蓋なしでプレートを30〜45分間空気乾燥させます。調製したマウス系統陰性HSPCsを室温で5分間Gで200倍で遠心分離する。上清を捨てた後、細胞ペレットを適当なアッセイ培地に再懸濁し、細胞懸濁液を再度遠心分離する。この手順をもう一度繰り返し、細胞を適切な加温アッセイ培地に再懸濁して、50マイクロリットルあたり250,000細胞または1ミリリットルあたり500万細胞の濃度にします。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞接着コーティングされた96ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルの側面に沿って50マイクロリットルの細胞懸濁液を添加し、次いで50マイクロリットルのアッセイ培地をコーナーバックグラウンド測定ウェルに加える。コーティングされていない96ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルあたり50マイクロリットルの水を加えて遠心分離機バランスプレートを作成する。細胞を室温で1分間、Gの200倍で遠心分離する。プレートを摂氏37度の非二酸化炭素インキュベーターで25〜30分間インキュベートし、細胞付着させる。30分後、細胞がマイクロプレート表面に安定に接着していることを顕微鏡下で目視で確認した。まず、本文原稿に記載されているように、予め加温した解糖系ストレス試験アッセイ培地に必要なすべての溶液を調製し、水和センサーカートリッジをインキュベーターから取り出します。センサーカートリッジを持ち上げてキャリブラントから取り出し、キャリブラントと同じユーティリティプレートに取り付けて気泡を取り除きます。80 ローディング・ガイドをセンサー・カートリッジの上部に平らに置き、文字 A が左上隅に位置するように向きを変えます。マルチチャンネルピペットを使用して、ポートAに20マイクロリットルの100ミリモルグルコース溶液を分配します.80ローディングガイドフラットをBCローディングガイドフラットに交換し、左上隅の文字Bを方向付けます。ポートBに20マイクロモルのオリゴマイシン溶液22マイクロリットルを分注する.BCローディングガイドフラットの向きを変えて、ポートCの左上隅にある文字Cを見つけ、ポートCに25マイクロリットルの500ミリモル2-デオキシ-d-グルコース溶液を分配します。次に、解糖系ストレステストのテンプレートを作成またはコントローラーに読み込みます。注射戦略、治療条件、および細胞タイプに関する詳細を入力し、「グループの生成」を押します。プレートマップに移動し、分析する各グループにウェルを割り当てます。プロトコルで、初期化ステップでキャリブレーションと平衡化がチェックされていることを確認します。ベースライン測定および各注射後の測定については、測定サイクル数を3に設定し、混合、待機、測定時間を3分、0分、3分に混合する。ソフトウェアで[実行の開始]をクリックします。コンパウンドを装填し、水和させたセンサーカートリッジから蓋を取り外し、細胞外フラックス分析装置の作業トレイに置きます。キャリブレーションの実行を開始します。播種した細胞を入れたマイクロプレートをインキュベーターから取り出します。細胞を乱すことなく、ウェルあたり130マイクロリットルの加温前解糖ストレス試験アッセイ培地をゆっくりと加えて、各ウェルの培地容量を180マイクロリットルにし、プレートをさらに15〜20分間インキュベーターに戻します。ソフトウェアの [トレイを開く] をクリックして、タツノオトシゴのサーマルトレイを開きます。校正が終了したら、ユーティリティプレートをセルを含むこのアッセイマイクロプレートと交換し、ロードセルプレートを押して測定を開始します。測定が終わったら、細胞を乱すことなくアッセイ培地をプレートから取り出し、細胞を脱落させることなく250マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水で穏やかに洗浄する。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した10マイクロリットルの放射免疫沈降溶解バッファーを各ウェルに追加し、シェーカー上でプレートを10分間攪拌する。プレート全体をマイナス80°Cで凍結します。プレートを解凍し、メーカーの指示に従ってデータ正規化のためのタンパク質測定アッセイを実行します。Waveデスクトップソフトウェアを使用してデータファイルを開いて、データを取得して分析します。[正規化]をクリックし、各ウェルの正規化値を貼り付け、[適用]をクリックしてデータを正規化します。[エクスポート]をクリックし、[解糖系ストレステストレポートジェネレータ]を選択して、分析データをレポートジェネレータにエクスポートします。非解糖系酸性化率は、細胞数が50, 000から250, 000に増加するにつれて上昇するが、200, 000から250, 000の間では最小限にしか増加しない。10ミリモルグルコースの注射は、すべての細胞数で解糖系を刺激し、1ウェルあたり250,000細胞で観察されるECARの最大増加を伴う。しかしながら、オリゴマイシンの2マイクロモルの注射は、ECARをさらに増加させない。解糖系ストレス試験の同じセットで得られたOCRデータは、複合体5阻害によるオリゴマイシン注射後の有意な低下を示す。解糖系ストレス試験パラメータを計算し、2マイクロモルのオリゴマイシン中のウェル当たり250,000個の細胞をさらなる研究のために選択した。ミトコンドリアストレス試験では、2マイクロモルオリゴマイシン注射が複合体5の阻害を介してOCRの有意な減少を引き起こすことを示した。FCCPは、HSPC中のOCRを用量依存的に刺激し、2マイクロモルで観察される最大の増加を伴う。0.5マイクロモルのロテノンと0.5マイクロモルのアンチマイシンA注射の混合物は、OCRを非ミトコンドリア酸素消費に対応する最小レベルまで減少させる。ミトコンドリアストレス試験パラメータを計算し、さらなる研究のためにFCCPの2マイクロモルを選択した。この技術のハイスループットの性質を考えると、ここで説明するプロトコルは、造血幹細胞、造血前駆細胞、および悪性造血細胞における多数の生体エネルギーモジュレーターをスクリーニングするために容易に適合させることができる。タツノオトシゴ分析は、様々な基質および阻害剤の存在下で多種多様な文脈における代謝を測定するために文献において広く使用されている。

assessment-cellular-bioenergetics-mouse-hematopoietic-stem-primitive

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、細胞外フラックスアッセイを使用して初代白血病細胞の細胞外酸性化率(ECAR)と酸素消費率(OCR)を測定するための生化学的アプローチを提供します。これらの細胞の代謝プロファイルの評価は、それらの要求を特徴付けるのに役立ち、個別化治療につながります。...

細胞外フラックスアッセイ:細胞の代謝プロファイルを測定する方法

この動画では、細胞外フラックスアナライザーを使用して、活性化したヒトNK細胞のエネルギー代謝を解析する方法を実演しています。電子伝達鎖複合体のさまざまな阻害剤は、酸素消費率またはOCRを通じて測定されるATP合成に影響を与え、細胞代謝と生体エネルギー学に関する洞察を提供します。...

細胞外フラックスアナライザーを用いたヒトNK細胞のエネルギー代謝のリアルタイムモニタリング

代謝リプログラミングは、M1およびM2マクロファージの分極のための特性的かつ前提条件です。この原稿では、マウス骨髄由来マクロファージにおける解糖系とミトコンドリア機能の基本パラメータを測定するためのアッセイについて説明します。このツールは、特定の要因がマクロファージの代謝と表現型にどのように影響するかを調査するために適用できます。...

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

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マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

ここでの代謝状態の白血病患者の骨髄から白血病細胞の分離と解析のためのプロトコルを提案する.主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価は、一次電池の需要のより良い特性を助けることができるし、より個別化医療にまでつながる可能性があります。...

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス...

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル...

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造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。...

造血幹細胞細胞代謝の解析

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。...

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。...

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

学ぶマウス造血幹・前駆細胞の細胞生体エネルギー評価法。細胞外フラックス分析装置でECARとOCRをリアルタイム測定し、解糖系とミトコンドリア機能を解析。96ウェルプレートによる高スループット定量で、造血幹細胞の代謝経路と多能性維持機構を解明します。

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

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