Name: 真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶ真核生物のグリコーゲン代謝における酵素活性測定法。放射能同位体を使用せず、簡易な吸光光度計でグリコーゲン合成酵素活性を正確に測定できます。安全で低コストな生化学研究手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、Karoline DittmerとAndrew Brittinghamの洞察と多くの有益な議論に感謝したいと思います。この作業は、アイオワオステオパシー教育研究基金(IOER 03-17-05および03-20-04)からの助成金によって部分的に支援されました。

<ol><li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li>
<li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li>
<li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li>
<li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase%2C+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li>
<li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose%3A1%2C4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li>
<li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li>
<li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li>
<li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1%2C6-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li>
<li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li>
<li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li>
<li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li>
<li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li>
<li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li>
<li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C+6-diphosphatase%2C+phosphofructokinase%2C+glycogen+synthetase%2C+phosphorylase%2C+and+protein+kinase+from+swine+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li>
<li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).</li>
<li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1%2C6-glucosidase-oligo-1%2C4-1%2C4-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li>
<li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification%2C+properties+and+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li>
<li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain%3A+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li>
<li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+EYC+%22The+Enzymes+Vol.+5%22">The Enzymes Vol. 5</a>. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).</li>
<li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+of+amylose+and+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li>
<li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1%2C4%2C-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltansferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li>
<li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li>
<li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li>
<li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li>
<li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li>
<li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis%3A+An+unusual+member+of+the+starch%2Fglycogen+synthase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-1%2C4-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li>
<li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+oyster+glucogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li>
<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

この作業に関連する既知の利益相反はなく、その結果に影響を与えた可能性のあるこの作業に対する財政的支援はありませんでした。

一般に、提示されたすべての方法の主な利点は、低コスト、容易さ、速度、および特殊な機器への依存の欠如です。それらすべてに共通する主な欠点は、他の利用可能な方法と比較した感度です。NADH / NADPHの生産または消費を伴う手順の感度は簡単に推定できます。NADH/NADPHの吸光係数が6.22 M-1 cm-1であることを考えると、単純な算術で10~20 μMの濃度変化を容易に検出できることがわかります。現在の論文に記載されているアッセイ量では、これは~10-20 nmolの範囲の量を測定する能力に相当します。間違いなく、これはかなり敏感です。しかしながら、放射性標識基質の比活性を調整して、感度を分光光度アッセイの限界を超えて非常に容易に増加させることができるようにすることができる。分岐酵素アッセイとグリコーゲン分岐の定性的評価はどちらもヨウ素とα1,4結合グルコースポリマーの間の複合体の形成に依存していますが、各アッセイからの出力は異なり、それらの感度も同様に異なります。記載されるアッセイの各々についての具体的な考慮事項は、以下で論じられる。
<p class="jove_conte...

グリコーゲンは自然界に広く分布しており、化合物は細菌、多くの原生生物、真菌、および動物に含まれています。微生物では、栄養素が制限されている場合、グリコーゲンは細胞の生存に重要であり、哺乳類などの高等生物では、グリコーゲンの合成と分解が血糖値を緩衝するのに役立ちます1,2,3。したがって、グリコーゲン代謝の研究は、微生物学や哺乳類生理学などの多様な分野にとって重要です。グリコーゲン代謝を理解するには、グリコーゲン合成(グリコーゲン合成酵素と分岐酵素)とグリコーゲン分解(グリコーゲンホスホリラーゼと枝切り酵素)の重要な酵素を研究する必要があります。グリコーゲン合成酵素、ホスホリラーゼ、分岐、および枝切り酵素活性のゴールドスタンダードアッセイは、放射性同位元素を使用します。例えば、グリコーゲンシンターゼは一般に、UDP-[14C]グルコース(動物および真菌酵素の場合)またはADP-[14C]グルコース(細菌酵素の場合)からのグルコースのグリコーゲン4,5への取り込みに続いて、停止した放射化学的アッセイで測定される。同様に、グリコーゲンホスホリラーゼは、[14C]グルコース-1-リン酸からグリコーゲン6へのグルコースの取り込みに続いて、グリコーゲン合成の方向に測定されます。枝切り酵素は、グリコーゲンホスホリラーゼ7によってグルコース-1-リン酸からα1,4結合鎖への[14C]グルコースの取り込みを刺激するこの酵素の能力を測定することによってアッセイされ、枝切り酵素活性は、グリコーゲン8に[14C]グルコースを取り込む酵素の能力に従うことによって決定されます。.放射性基質は非常に感度が高く、酵素活性の低い粗細胞抽出物に使用できますが、高価であり、放射性同位元素の使用に伴う規制要件の対象となります。これらの障壁により、特定のアッセイの使用は多くの労働者の手の届かないところにあります。しかしながら、長年にわたって、これらの酵素の測定に対する印象的な様々な分光光度法が記載されている。一般に、これらのアプローチは、最終的にはNADH / NADPHの生成または消費、またはグリコーゲンとヨウ素の間の着色錯体の生成の測定に依存しています。したがって、それらは単純であり、タングステンまたはキセノンフラッシュランプのみを備えた単純な分光光度計を使用して実行できます。
グリコーゲン合成酵素の分光光度アッセイは、グルコースが成長するグリコーゲン鎖に付加されるにつれて糖ヌクレオチド供与体から放出されるヌクレオシド二リン酸を測定することに依存している9,10。以下のプロトコルのセクション1に記載されているグリコーゲンシンターゼ活性を測定する手順は、Wayllaceら11によって概説されている手順の変更であり、カップリングスキームを以下に示します。
(グルコース)n + UPD-グルコース → (グルコース)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + ホスホエノールピルビン酸 → ピルビン酸 + ATP
ピルビン酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+
グリコーゲン合成酵素は、UDP-グルコースからグリコーゲンにグルコースを付加します。この過程で生成したUDPは、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ(NDPキナーゼ)によってUTPに変換され、ADPを生成する反応となる。次に、ADPはピルビン酸キナーゼの基質として機能し、ホスホエノールピルビン酸をリン酸供与体として使用してADPをリン酸化します。生成したピルビン酸は、NADHを消費する反応で酵素乳酸脱水素酵素によって乳酸に変換される。したがって、アッセイは、NADHが消費されるにつれて340nmでの吸光度の減少をモニタリングしながら、連続的に実施することができる。グルコース供与体としてADP-グルコースを必要とする酵素での使用に容易に適応します。ここでは、グリコーゲンシンターゼの作用によって放出されるADPがピルビン酸キナーゼによって直接作用されるため、カップリングステップはより単純です。
グリコーゲンホスホリラーゼ活性の測定に利用できるさまざまな分光光度アッセイがあります。古典的なバージョンでは、以下に示すように、酵素はグリコーゲン合成の方向に後方に駆動されます。
(グルコース)n + グルコース-1-リン酸 → (グルコース)n+1 +P i
時限間隔で、反応混合物のアリコートを除去し、遊離したリン酸塩の量を定量化する12,13。我々の手では、このアッセイは、ホスホリラーゼ作用に必要な高濃度のグルコース-1-リン酸と組み合わされた、グルコース-1-リン酸の多くの市販調製物中に容易に測定可能な遊離リン酸が存在するため、使用が制限されていた。むしろ、グリコーゲンがホスホリラーゼ13によって分解されるときに放出されるグルコース-1-リン酸を測定する代替アッセイを日常的に採用しています。以下に示す共役反応スキームが採用される。
(グルコース)n + Pi → (グルコース)n-1 + グルコース-1-リン酸
グルコース-1-リン酸 → グルコース-6-リン酸
グルコース-6-リン酸 + NADP+ → 6-ホスホグルコノラクトン + NADPH + H+
グルコース-1-リン酸はホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換され、グルコース-6-リン酸は6-ホスホグルコノラクトンに酸化され、同時にNADP+がNADPHに還元されます。以下のプロトコルのセクション2に詳述されている手順は、Mendicino et al.14およびSchreiber & Bowling 15によって記述された方法に由来する。アッセイは、時間の経過とともに340nmでの吸光度が増加し、反応速度の決定を可能にする連続的に容易に実施することができる。
枝切り酵素活性の吸光光度測定は、ホスホリラーゼ限界デキストリン16に対する酵素の作用によって放出されるグルコースの測定に依存する。この化合物は、グリコーゲンホスホリラーゼでグリコーゲンを網羅的に処理することによって作られます。グリコーゲンホスホリラーゼ作用はα1,6-分岐点から4グルコース残基離れて停止するので、限界デキストリンにはグリコーゲンが含まれており、その外鎖は~4グルコース残基に短縮されています。ホスホリラーゼ限界デキストリンの調製は、Taylorら17 およびMakino & Omichi18によって開発されたものに由来する手順を用いて、本明細書に記載されている。
分岐解除は 2 段階のプロセスです。二官能性枝切り酵素の4-α-グルカノトランスフェラーゼ活性は、最初に3つのグルコース残基を分岐点から近くのα1,4結合グルコース鎖の非還元末端に転移する。分岐点に残っている単一のα1,6結合グルコース残基は、次いでα1,6-グルコシダーゼ活性19によって加水分解される。アッセイは通常、停止した方法で実行され、所与の時間(または一連の回)後に放出されるグルコースは、以下に示すように結合酵素アッセイで測定されます。
(グルコース)n → (グルコース)n-1 + グルコース
グルコース + ATP → グルコース-6-リン酸 + ADP
グルコース-6-リン酸 + NADP+ → 6-ホスホグルコノラクトン + NADPH + H+
産生されるNADPHの測定は、グルコース産生の尺度を与える。以下のプロトコルのセクション3で概説されている手順は、Nelsonら16によって記述されたものに基づいています。NADH/NADPHの消費または生成に依存する他の方法と同様に、アッセイは非常に感度が高いです。ただし、ホスホリラーゼ限界デキストリンから遊離グルコースを遊離させる可能性のあるアミラーゼまたは他のグルコシダーゼの存在は、重大な干渉を引き起こします(ディスカッションを参照)。
分岐酵素活性の比色測定は、グルコースのα1,4結合鎖がヨウ素に結合するらせん構造を採用し、着色錯体を形成するという事実に依存しています20。形成される複合体の色は、α1,4結合鎖の長さに依存する。したがって、α1,4結合グルコースの長くて大部分が分岐していない鎖からなるアミロースは、ヨウ素と濃い青色の複合体を形成します。対照的に、その外鎖が一般にわずか6〜8グルコース残基長のオーダーであるグリコーゲンは、橙赤色の複合体を形成する。アミロースの溶液を分岐酵素と共にインキュベートする場合、アミロースへの分岐の導入は、より短いα1,4結合グルコース鎖の生成をもたらす。したがって、アミロース/ヨウ素錯体の吸収極大はより短い波長にシフトします。ここで説明する手順は、Boyer & Preiss21 によって詳述されたものに由来し、分岐酵素活性は、時間の経過に伴う660nmでのアミロース/ヨウ素複合体の吸収の減少として定量化されます。
上記の議論からすぐに明らかなように、ヨウ素とα1,4-グルコース鎖の間に形成される錯体の色が鎖長によって変化するという事実は、グリコーゲン/ヨウ素複合体の吸光度スペクトルがグリコーゲン分岐の程度によって変化することを意味する。これは確かに事実であり、より分岐の少ないグリコーゲン/より長い外鎖を有するグリコーゲンは、より分岐している/より短い外鎖を有するグリコーゲンよりも長い波長の光を吸収する。したがって、ヨウ素染色反応を使用して、グリコーゲン分岐の程度に関する迅速で定性的なデータを得ることができます22。ヨウ素とのグリコーゲン錯体が特に強くない場合、オレンジ - 茶色が形成されます。しかしながら、発色は、飽和塩化カルシウム溶液22を含有させることによって増強することができる。これにより、メソッドの感度が約10倍になり、マイクログラム量のグリコーゲンをすぐに分析できます。下記のプロトコルのセクション4に記載される分岐の決定のためのアッセイは、Krisman22によって開発された手順から適応される。グリコーゲンサンプルをキュベット内のヨウ素溶液および塩化カルシウムと組み合わせ、330nmから800nmの吸収スペクトルを収集するだけで実施できます。吸光度の最大値は、分岐の程度が減少するにつれて、より長い波長にシフトします。
まとめると、ここで説明する方法は、グリコーゲン代謝の重要な酵素の活性を評価し、グリコーゲン分岐の程度に関する定性的データを取得するための簡単で信頼性の高い手段を提供します。

<table><tbody><tr><td>アミロペクチン(アミロースフリー)ワックス状トウモロコシ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>アミロース</td><td>バイオシンス カルボシンス</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP、二ナトリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース-1,6-ビスリン酸、カリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース-6-リン酸、ナトリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グレード I、酵母</td><td>ミリポアシグマ</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン、タイプ II カキ</td><td>ミリポアSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>ヘキソキナーゼ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>メタクリレート キュベット、1.5 mL</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-955-128</td><td>メタクリレートは、一部の手順が340nm以下で実施</td></tr><tr><td>&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ナトリウム塩</td><td>ミリポアSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型二ナトリウム塩</td><td>ミリポアSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオシド5'-二リン酸キナーゼ</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸、モノカリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>ウサギの筋肉からのホスホグルコムターゼ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P3397</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>の筋肉からのホスホリラーゼA</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸キナーゼ/ウサギの筋肉からの乳酸デヒドロゲナーゼ酵素</td><td>シグマ</td><td>P0294UDP</td><td></td></tr><tr><td>グルコース、二ナトリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

グリコーゲンは、細菌から動物に至るまで、さまざまな生物によってグルコースの貯蔵形態として合成されます。この分子は、α1,6結合の付加によって導入された分岐を有するα1,4結合グルコース残基の直鎖を含む。グリコーゲンの合成と分解がどのように制御され、グリコーゲンがその特徴的な分岐構造をどのように達成するかを理解するには、グリコーゲン貯蔵の酵素の研究が必要です。しかしながら、これらの酵素活性を研究するために最も一般的に使用される方法は、典型的には、すべての研究者が利用できるわけではない試薬または技術を使用する。ここでは、技術的に単純で費用効果が高く、それでもグリコーゲン貯蔵の制御に関する貴重な洞察を提供できる一連の手順について説明します。この技術は、330〜800nmの範囲で動作する分光光度計へのアクセスを必要とし、ユーザーが使い捨てのプラスチックキュベットを使用することを想定して説明されています。ただし、手順は容易に拡張でき、マイクロプレートリーダーで使用するために変更できるため、高度な並列分析が可能です。

グリコーゲン合成酵素活性の測定 図1 は、精製酵素を用いたグリコーゲン合成酵素アッセイの代表的な結果を示す。パネルAでは、わずかな遅れの後、約12分間、時間の経過とともに340nmでの吸収が直線的に減少しました。 図1A の吸収の変化率は~0.12吸光度単位/分であった。吸光度の変化速度は~0.010〜~0.20吸光度単位/分の間で最適であり、グリコーゲン合成酵素の添加量は、この範囲内の収率に調整する必要があります。パネルBでは、アッセイにグリコーゲンシンターゼを添加しすぎた結果が示されています。ここで、反応は最初の2分以内に完了した。これらの場合、グリコーゲンシンターゼを含まない対照反応は、経時的な吸光度の測定可能な減少を示さなかった。ディスカッションで詳述したように、このアッセイでの組織ホモジネートの使用は完全に実行可能ですが、追加の制御反応が必要です。
ここで説明するプロトコルは、カキグリコーゲンを基質として使用してお...

可視域で動作する単純な分光光度計を使用して、グリコーゲン代謝の重要な酵素の活性を測定する技術が提示されます。

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

プロトコルは、放射性同位元素の使用を回避し、多くの労働者がグリコーゲン代謝の酵素を研究することを妨げる可能性のある障壁を取り除くため、重要です。記載された手順は安価であり、単純な分光光度計へのアクセスのみを必要とする。グリコーゲンシンターゼ活性の測定から始めるには、UDPグルコース、ATP、ホスホエノールピルビン酸、およびNDPキナーゼの予め調製したストック溶液を氷上で解凍する。水浴を摂氏30度に予熱します。ストック溶液の準備ができたら、テキストプロトコルに記載されているように、試薬を15ミリリットルのチューブに追加することにより、グリコーゲンシンターゼアッセイの数に応じて十分なアッセイ混合物を調製します。反応混合物のNADHを水で置換してブランク反応を調製し、反応物を使い捨てメタクリレートキュベットに移します。ブランク反応を使用して、分光光度計の波長を340ナノメートルに設定します。1.5ミリリットルのチューブに反応混合物の770マイクロリットルのアリコートを1つ取り、NDPキナーゼとピルビン酸キナーゼ乳酸デヒドロゲナーゼ混合物をそれぞれ2マイクロリットルずつチューブに順次加えます。混合後、チューブを水浴中で摂氏30度で3分間静かにインキュベートし、反応混合物を予熱する。次に、グリコーゲンシンターゼを含むサンプル30マイクロリットルをpH 7.8の20ミリモルトリスバッファーに加え、穏やかに混合してから、反応混合物を廃棄メタクリレートキュベットに移します。キュベットを分光光度計に入れ、340ナノメートルの吸光度を10〜20分間、時間間隔で記録します。次に、得られた吸光度を時間に対してプロットする。放出されたグルコースを測定するには、加熱されたグリコーゲンサンプルから使い捨てメタクリレートキュベットに40マイクロリットルの上清を移します。そして、原稿に記載されているように、測定量のトリエタノールアミン、塩酸硫酸マグネシウム緩衝液、NADP ATP混合物および水を加える。気泡を発生させずに穏やかに上下にピペッティングして混合物を混合します。各キュベットに0.5マイクロリットルのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを加える。ピペッティングで混合した後、混合物を室温で10分間インキュベートし、340ナノメートルの吸光度を記録します。次に、前述のように各キュベットに0.5マイクロリットルのヘキソキナーゼを混合し、15分間インキュベートしてから、340ナノメートルの吸収セットを記録する。その後、室温で5分間インキュベーションを続け、吸光度を記録した。吸収が15分で記録されたものから増加した場合は、340ナノメートルで最終的な吸収を記録する前に5分間インキュベーションを続けます。グリコーゲン分岐を決定するには、650マイクロリットルのヨウ素塩化カルシウムカラー試薬スト

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、グリコーゲン合成酵素活性を推定するための分光光度法について説明しています。この方法は、NADHの吸光度が時間とともに減少することに依存しており、グリコーゲン合成酵素活性を示します。...

グリコーゲン合成酵素活性を測定するための分光光度法アッセイ

このビデオでは、特性が未定の構造を持つグリコーゲンサンプルの分岐の程度を決定するための定性的な分光光度法アッセイについて説明します。未評価のサンプルの最大吸光度を、分岐構造が既知の多糖類の吸光度最大と比較すると、未評価のサンプルに分岐が存在することがわかります。...

グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

ここでは、in vitroでのグリコーゲンの滴定のために、正確で再現性のある便利な生化学的方法を記載する。この手法は、アブカムグリコーゲンアッセイキットを使用し、蛍光により滴定グルコースとグルコースへのグリコーゲンの連続加水分解に基づく。...

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

過ヨウ素酸シッフ染色は、組織の多糖類含有量を可視化する技術です。この記事では、ヒト静脈血から精製された末梢血単核細胞での使用に適した過ヨウ素酸シッフ染色プロトコルを示しています。このようなサンプルは、リンパ球や免疫系の他の白血球に富んでいます。...

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。...

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

スクロース密度勾配遠心分離を用いた肝グリコーゲンの抽出に最適なスクロース濃度を決定しました。グリコーゲン分解酵素を阻害するために10分間の煮沸ステップを加えると、有益であることが証明されました。...

グリコーゲン構造決定のための肝臓グリコーゲン分子の抽出

修正された固定後手順は、組織中のグリコーゲン粒子のコントラストを増加させる。この論文は、組織を処理し、イメージングを行い、立体学的方法を使用して骨格筋における繊維型特異的な細胞内グリコーゲン分布に関する偏りのない定量的データを得る方法を説明するステップバイステップのプロトコルを提供する。...

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

動物組織アッセイは、核シンチレーション検出を利用して、グリコーゲンへの放射性標識グルコースの取り込みを測定することにより、グリコーゲンシンターゼの酵素活性を決定します。...

動物組織におけるグリコーゲンシンターゼ酵素活性の放射化学的評価

&gt;jove_content&lt;ここでは、真核細胞からのタンパク質複合体の発現、単離、および特性評価のための、新しく、堅牢で、効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法について説明します。このプロトコルは、離散的な複合体の生化学的特性評価、ならびにそれらの機能を調節する新規相互作用因子および翻訳後修飾の同定に利用できる可能性があります。...

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ...

小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸

学ぶ真核生物のグリコーゲン代謝における酵素活性測定法。放射能同位体を使用せず、簡易な吸光光度計でグリコーゲン合成酵素活性を正確に測定できます。安全で低コストな生化学研究手法です。

真核生物グリコーゲン代謝研究のための吸光光度法

さらに動画を探す