Name: 細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ光分解性ヒドロゲルを用いた細菌細胞の高速分離法。マイクロスコープによるリアルタイムモニタリングとUV光パターン制御により、複雑な細菌群集から標的細胞を選択的に抽出し、ゲノム解析のための高純度DNAを取得する手法です。

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この研究はNSFキャリア賞#1944791によって支援されました。

<ol><li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li>
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<li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+separation%3A+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+is+now%3A+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+flow+cytometry%3A+The+role+of+microfabrication+methodologies%2C+performance+and+functional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li>
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<li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li>
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<li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li>
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<li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening%2C+isolation%2C+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li>
<li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%2C+Nanotechnology+and+Microelectronics%3A+Materials%2C+Processing%2C+Measurement%2C+and+Phenomena%22%5BJournal%5D)">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li>
<li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562(2018).</li>
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<li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li>
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<li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080(2016).</li>
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<li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893(2018).</li>
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RRHとAJVは、この技術に関する特許を出願しています。残りの著者は利益相反を宣言しません。

この原稿は、細菌のスクリーニングおよび単離のための光分解性ヒドロゲルの使用を示す。材料とアプローチは、ハイスループット培養、成長培地と成長条件の制御、クリーンで正確な細胞抽出を簡単かつ費用対効果の高い方法で可能にします。抽出は、パターン化された照明ツールと結合された蛍光顕微鏡のみを必要とし、複数の細胞標的を分離するために逐次的に行うことができます。各抽出は、実行するのに5〜10分かかり、最大30の標的コロニーが単一のヒドロゲルから除去されています。このアプローチの主な利点は、バルクヒドロゲルとマイクロウェルアレイの両方からのスクリーニングでここで示すように、さまざまなアッセイフォーマットへの適応性です。両方の形式の分離プロセスは、培養後の下流のジェノタイピングのためのユニークな成長挙動を示す細菌の分離に成功し、細胞遺伝子型を表現型に接続するための重要な機能である顕微鏡観察。現在までに、これらのインターフェースから抽出された細菌のゲノム特性評価には、16Sアンプリコンシーケンシングが含まれており、創発的な成長挙動18を生成する環境マイクロバイオームから細菌の多種集合を同定し、全ゲノムシーケンシングのために変異ライブラリー19内に存在する細胞に稀な増殖プロファイルを引き起こす遺伝子変異を同定することに成功した。
細胞スクリーニングおよび単離のためにバルクヒドロゲルを使用することは、最も簡単でシンプルなフォーマットです。バルク光分解性ヒドロゲルは、透明なガラスカバースリップの上に前駆体を混合した後に急速に(25分)形成し、標準的な直立または反転した蛍光顕微鏡で画像化された3次元細胞培養マトリックスに細胞をカプセル化する。したがって、この方法は、マイクロファブリケーションリソースや専門知識を持たない一般的な微生物学の研究室に翻訳する可能性を秘めています。この形式の欠点は、セルが 3 次元ヒドロゲル全体にランダムに向いている点です。したがって、細胞コロニーが互いに近づきすぎたり、コロニーの垂直オーバーレイがある場合、より高い倍率の目的でイメージングする場合、細胞が焦点面外に現れる可能性があり、抽出が困難になる可能性があります。記載されているように薄いヒドロゲル(<13 μm)を堆積させることは、この欠点を軽減するために重要です。このパターンは、UV光への暴露を最小限に抑え、めっきによって容易に回収できるヒドロゲルを含まない細胞をもたらすので、壊れたクロスライトパターン(図4B)における露光が好ましい。
対照的に、マイクロウェルアレイフォーマットは、細菌細胞が小さな培養または共培養部位17、18、26として機能する離散的なマイクロウェルに分割されるため、よりよく制御されたインタフェースを提供する。マイクロウェル寸法、ピッチ、密度は、標準的なフォトリソグラフィ技術を用いて精密に製作されています。バルクヒドロゲルと比較して、細菌は、細胞がヒドロゲル全体にランダムに分散されていない、事前定義された場所にのみ存在するので、特異性の高い程度とクロスコンタミネーションの可能性が低いマイクロウェルアレイから抽出することができます。播種溶液中の細菌細胞の濃度と比率は、以前のレポート26で特徴付けられてきた播種プロセスを通じてマイクロウェル接種の量および組成を制御するために変化させることができ、スクリーンの実験設計においてユーザに柔軟性を与える。マイクロウェルアレイ形式によるスクリーニングの主な欠点は、マイクロファブリケーションに必要な時間と専門知識の追加です。マイクロウェルの製造は、材料費とクリーンルーム費用を含むアレイあたり〜10ドルの費用がかかると見積もられました。さらに、マイクロウェルアレイはシリコン製であり、基板が透明でないためイメージングが困難になる可能性があります。さらに、シリコン表面からの光散乱量が多いと、マイクロウェル内の撮像が制限され、パターン化された照明ツールからのUV光によるヒドロゲル露光時のパターン分解能を低下させることができます(図8A、B)。同様のマイクロウェルは、これらのタイプの制限に対処するために透明な石英基板上で製造されています。しかし、この製作はかなり難しい。ウェルの周囲を照らすリングパターンへの暴露は、UV露光を最小限に抑えながらウェルから自由な細胞を放出することがここで好ましい。
いずれの形式でも生じる最も一般的な問題は、ヒドロゲルの膨潤による培養中の基質からヒドロゲルの剥離である。これがバルクヒドロゲルの問題である場合、ベースガラスカバースリップの表面を横切る化学(MTPS)アタッチメント層におけるチオール基の存在、密度、均一性は、適切な表面特性評価技術(XPS、ATR-FTIR、AFMなど)を使用して検証する必要があります。非効率的な表面官能化による表面チオール基の低密度は、基材とヒドロゲルとの間の弱い相互作用を引き起こす可能性があります。低レベルの表面のチオラクションが発生した場合は、MTPS溶液の安定性をチェックする必要があります。MTPS処理の前にきれいな表面を確保するために、ガラススライドの最初のクリーニングに注意を払う必要があり、MTPS表面反応中に無水トルエンの使用を確実にするように注意する必要があります(プロトコルセクション4)。マイクロウェルアレイの場合、表面はチオラートされず、ヒドロゲルは代わりにヒドロゲルでウェルの部分的な充填を介して付着し、ヒドロゲルをシリコン基板17に固定する。ハイドロゲル剥離がこのシステムで問題である場合、より多くのマイクロウェルまたは他のマイクロスケールの特徴を配列にエッチングして、より強いアタッチメントを促進するためにさらに基板にハイドロゲルを固定することができます。
いずれの形式における技術の制限は、細菌の存在下におけるヒドロゲルの安定性が限られている。A.ツメファシエンスのようないくつかの細菌は、実験時間を制限する5-7日17、19の間にヒドロゲルを分解することができることが指摘されている。細菌分解のメカニズムの現在の調査が進行中です。他のシステム17に記載されているように、ジアクリレートモノマーから存在するエステル基は、細菌媒介性加水分解および/または酵素分解の対象となると仮定される。より安定したヒドロゲル化学を開発することは、細菌がヒドロゲルに残ることができる時間を延長し、より遅い増殖速度を有する微生物にスクリーンを拡張する。2 つ目の制限は、両方のフォーマットで、細胞の回収と抽出がオープン環境で発生し、比較的高い抽出量 (30 ~ 100 μL) が発生し、外部汚染の影響を受けやすいという点です。したがって、抽出液の体積を最小限に抑えながら、標的コロニーから十分な細胞が存在することを確認するために注意が必要です。めっきおよび回収またはDNA材料の抽出のために十分な細胞を得るためには、バルクヒドロゲルでは、細胞が少なくとも10μmのコロニー直径に達するのに十分な長さで培養されなければならないことが観察された。細胞抽出に必要な体積を下げるために、マイクロリットルシリンジおよびチューブ(図2)を用いてピペットよりも効率的であるが観察された。チューブにより、分離液をより正確に離型ポイントから引き出せるようになっており、溶液量を減らし、汚染の可能性を低くしました。
今後の研究は、ヒドロゲルの機械的特性が細胞増殖に及ぼす影響を理解することを含み、これらのヒドロゲルの機械的特徴は、種々の分子量28の適切なPEGベースのモノマー前駆体の選択によって十分に制御され、そして機械的相互作用が細菌挙動29において重要な役割を果たす可能性が高い。ヒドロゲル材料は様々な異なるシステムやデバイスに容易に組み込むことができるので、さらなる開発は、マイクロ流体システムへのこの材料の統合にも焦点を当てています。これにより、オープンコレクション形式で現在必要とされている従来の30〜100 μLの容積と比較して、フェムトリットルからピコリットルまでの量に対する抽出溶液が減少します。ソリューションの容積が小さいと、汚染の可能性が大幅に減少し、単一細胞の分離と特性評価に向けてアプローチが進みます。

複雑で異種の環境からユニークな行動を持つ細胞の単離は、生物学1で遺伝情報を得るための基本である。微生物学では、ゲノム情報と観察可能な現象情報との関連を必要とする多くの用途において、観察後の希少微生物またはユニークな微生物の選択と分離が重要になります。これらのアプリケーションには、変異ライブラリー2から、典型的に希少株を選択し、複雑な微生物群集3、4からキーストーン微生物を選択し、アイソジェニック集団から異種的に稀だが重要な細菌を選択する。細菌集団からの生存可能だが非培養可能な細胞(VBNC)の単離は、VBNC表現型を有する細胞が1:102から1:105比5,6で細菌集団に隠されることが多い後者の重要な例である。細菌の分離における広範な困難のために、多くのフェノタイプの希少微生物について多くの未知のままである。これらの制限は、まず混合物から標的細胞を特定し、次に下流の分子解析のためにそれらを取り出して単離する細胞分離技術の必要性を強調する7.
細胞分離の最も一般的に確立された方法のいくつかは、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別(FACS)8、免疫磁性分離9、10、およびマイクロ流体11を含む。これらの分離方法は高い価値を持ちますが、使用を制限する欠点もあります。例えば、FACSは、フォローアップゲノム解析3のために単細胞レベルでルーチン微生物分離を提供することができるが、多くの場合、その可用性と費用、ならびに下流汚染問題11によって制限される。マイクロ流体流量サイトメトリーのようなマイクロ流体ベースのアプローチは、多くの注目を集めているが、これは、従来のフローサイトメトリーと比較して、必要なサンプル体積の大幅な減少を可能にする12。しかし、マイクロ流体デバイスからの個々または小さな細胞の集合の分離と検索は、多くの場合、より複雑なセットアップとデバイス設計13を必要とする困難な問題である。多くのマイクロ流体ベースのアプローチは、細胞が入力される前に遺伝的に特徴付け、デバイス14で観察され、機能画面を実行する際に観察される固有種の数を制限する。これらの制限を考えると、多くの研究室で広く使用するためには、細胞スクリーニングと分離に実用的な方法と材料の両方のさらなる革新が必要です。
本論文は、細菌のスクリーニングと単離のための新しい材料ベースのアプローチを提示する。この方法では、細胞カプセル化、培養、顕微鏡観察、およびユニークなフェノタイプを有する標的菌のオンデマンド放出および回収に光分解性ヒドロゲルを使用する。ヒドロゲルは、10 nmメッシュサイズを含む設計されており、各架橋にはo-ニトロベンジル基15が含まれています。この材料は、培養のために細胞との間で栄養素や廃棄物の拡散を可能にしながら、観察のために細胞をカプセル化またはトラップします。直立した顕微鏡を介してパターン化された365nm UV光源に材料を露出させることは、o-ニトロベンジル基16,17の光切断を通じてヒドロゲルの局所分解を可能にする。分解は、ゲノム解析や、潜在的にプロテオミクスおよび転写分析を含む下流分析のための細胞の選択的放出を引き起こします。実験のセットアップとプロトコルは、比較的簡単で、安価で、微生物学の研究室への翻訳です。ヒドロゲル形成による細胞カプセル化、直立した明視野および蛍光顕微鏡による捕捉細胞の観察、および検索のためのパターン化されたUV光源による目的の細胞の照明のみを必要とする。
この材料ベースのスクリーニングアプローチの主な利点は、異なるスクリーニングフォーマットへの適応性です。最も基本的な形式では、材料はバルクヒドロゲルで異種細胞のコレクションをカプセル化することによってスクリーニングに使用することができる。次に、細胞は所望の表現型について観察され、目的の個々の細胞はゲノム特性解析のために除去される。より精巧なフォーマットでは、材料はまた、デバイスの所望の領域からの正確な細胞放出および検索を提供するために、ラボオンチップデバイスに統合することができる。両方の形式がここに記載されており、両方とも最近の新しい微生物スクリーニングと選択アプリケーション17、18、19を可能にしています。この方法は、モデルグラム陰性生物(大腸菌、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス)およびモデルグラム陽性生物(枯草菌)と共に、他の様々な細菌に容易に拡張された。

<table><tbody><tr><td>(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617-25G</td><td>> 95%</td></tr><tr><td>アルコノックス 洗剤粉末</td><td>アルコノックス</td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A702-500</td><td>認定 ACS粒状</td></tr><tr><td>オートクレーブ SK300C</td><td>ヤマトサイエンティフィック</td><td>18016</td><td></td></tr><tr><td>枯草菌 1A1135</td><td>バチルス遺伝資源センター</td><td>1A1135</td><td></td></tr><tr><td>明視野正立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム、無水</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>C614-500</td><td>デシケーター用 ペレット、4-20 メッシュ</td></tr><tr><td>遠心分離機 5702</td><td>エッペンドルフ</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>ACS 試薬、> 99.0%</td></tr><tr><td>D-グルコース (デキストロース)</td><td>VWRアムレスコライフサイエンス</td><td>0188-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ドネシー血液&ティッシュキット</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA精製キット</td></tr><tr><td>DOWSIL 184シリコーンエラストマーベース</td><td>ダウシリコーン株式会社</td><td></td><td>保管温度:-30-60 >C</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 シリコーン エラストマー硬化剤</td><td>ダウ シリコーン株式会社</td><td></td><td>保存温度: < 32 C</td></tr><tr><td>EPOCH2 マイクロプレート分光光度計</td><td>BioTek Instruments</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 ATCC 25922</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R19020</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、無水</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド顕微鏡カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12540A</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーファイネストプレミアム顕微鏡スライドプレーン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>216763-500ML</td><td>H2Oイン</td></tr><tr><td>キュシェイカーミニ</td><td>ベンチマーク</td><td>E5-0014-01</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム、7水和物</td><td>マクロンファインケミカルズ</td><td>6066-04</td><td>アバンター・パフォーマンス・マテリアルズ(株)</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>ACS 試薬、> 99.8%</td></tr><tr><td>NanoDrop One 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>窒素、圧縮</td><td>Matheson</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>酸素プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)</td><td>NOF AmericaCorporation</td><td>PTE-100SH</td><td>Sunbright-PTE-100SH</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X</td><td>VWR Amresco Life Science</td><td>K813-500ML</td><td>15 >C&ndash;30度;C</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS) Slygard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-D-000</td><td></td></tr><tr><td>プレミアム顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td>25 x 75 x 1 mm</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Life Science</td><td>S5886-500G</td><td>細胞培養に適したバイオ試薬</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BioXtra、> 98%、ペレット (無水)</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505-250G</td><td>BioUltra、分子生物学用、> 99.0% (T)</td></tr><tr><td>ステンレス鋼厚さ計</td><td>精密ブランド 製品</td><td>77739</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>トルエン、無水、99.8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>無水、> 99.8%</td></tr> <tr><td>トリクロロ (1H、1H、2H、2H パーフルオロオクチル) シラン (TPS)、97%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td>微生物学用</td></tr><tr><td>Super Nuova デジタル ホット プレート スターラー</td><td>Thermo Scientific</td><td>S131825</td><td></td></tr><tr><td>超音波式超音波装置</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FS-110H</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

生物学者は長い間、表現型と遺伝子型の関係を理解しようとしてきた。このつながりをよりよく理解するためには、下流の遺伝子解析のために、微視的細胞スクリーニングと細胞単離を高純度で結合する実用的な技術を開発することが重要です。ここでは、異種細胞集団からの独特な増殖表現型を有する細菌のスクリーニングおよび単離のための光分解性ポリ(エチレングリコール)ヒドロゲルの使用について説明する。この方法は、ヒドロゲルで細胞をカプセル化または包み込み、続いて培養、顕微鏡スクリーニング、次にヒドロゲル分解の時空間的制御および選択した細胞の取り出し液への放出のための高解像度光パターニングツールの使用に依存する。異なる光パターンを適用することで、抽出された細胞の形態を制御することができ、リングや十字架などのパターンを使用して、分離株へのDNA損傷を軽減するために、紫外線を最小限に抑えた細胞を取り出すことができます。さらに、ライトパターニングツールは、調整可能な光量を提供し、様々な劣化および細胞放出率を達成します。それは高分解能で分解を可能にし、ミクロンスケールの空間精度で細胞を取り出すことを可能にする。ここでは、バルクヒドロゲルおよびマイクロハブラボオンチップデバイスの両方から細菌をスクリーニングおよび回収するためのこの材料の使用が実証されている。この方法は安価でシンプルで、変異型ライブラリーからのまれな成長プロファイルを持つ細菌株の単離やゲノム特性評価のための出現した形質を有する細菌コンソーシアムの単離など、微生物学における一般的かつ新しい用途に使用することができる。

細胞放出に対して制御されたヒドロゲル分解を引き起こすUV光の能力を調べるため、ヒドロゲルはまず細菌を含まないチオラ化カバースリップ上に封入された。各ヒドロゲルは、異なる強度および露光時間における光の3つの複製円パターンに曝露された。ゲル分解率は、各光強度でUV光曝露後に算出し、次いで蛍光イメージング用蛍光-5-メーリミド色素とペンダントチオール基を結合して曝露時間を定量した。これら2つのパラメータがヒドロゲル分解に与える影響の代表例を図3に示す。明らかなように、パターン照明ツールによって提供されるパターン化された光は、少数の細胞の放出のみを可能にする解像度でヒドロゲル分解の空間的時間的制御を提供する。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg"> 図3:ヒドロゲル分解の制御 UV光線量および得られるヒドロゲル分解速度は、パターン化された照明ツールを介して調整可能である。(インセット)パターン化されたヒドロゲル分解のために2つの異なる光強度を選択した。365 nmのUV光暴露後、ヒドロゲルを蛍光イメージング用フルオレセイン-5-マレミドで標識した。ファタヒら19 著作権2020アメリカ化学会の許可を得て転載(適応)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
細胞抽出では、異なる光パターンを用い、細胞放出を調べた(図4)。ここで、 アグロバクテリウム 菌細胞を、チオラ化ガラスカバーリップ上のバルクヒドロゲルに封入し、次いでマイクロスケールのコロニーに培養した。その後、ヒドロゲルを明視野顕微鏡で検査し、標的化されたマイクロコロニーを多様なUV光パターンにさらした。放出された細胞の形態に異なる露光パターンが影響を与えるのが観察された。これは、さまざまなアプリケーションに役立つ可能性があります。例えば、標的コロニーの周囲にリングパターンを露出すると、保護PEGヒドロゲルにカプセル化されたコロニー全体の放出が生じ、直接UV光暴露を伴わない(図4A)、細胞を保存し、下流の精製を容易にする可能性がある。これに対し、コロニーの一部または全部をUV光にさらすことによって、細胞は凝集細胞クラスター(図4B)として、または個々の細胞(図4C)として抽出することができる。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg"> 図4:抽出細胞の形態を制御する。(A)PEGマトリックスで保護された細胞コロニー全体を放出する環状パターンの使用。(B) 集合体におけるセル解放のための破断十字パターンの使用。(C) クロスパターンを使用して個々の細胞を放出する。Fattahiらの許可を得て転載(適合)、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。</a>
カプセル化プロトコルにおいて重要なのは、これらのパラメータの両方が観察のためにヒドロゲルに組み込まれる細胞の数に影響を与えることができるので、ヒドロゲルの細胞播種密度と厚さの両方である。実証するために 、A.tumefaciens 細胞サンプルを、薄いスペーサー(12.7 μm)または厚いスペーサー(40 μm)を使用して2つの厚さのヒドロゲルにカプセル化し、確立されたプロトコルに従って画像化した。より薄いヒドロゲルは、ヒドロゲル全体で90コロニー/mm2 のマイクロコロニー密度をもたらし、そこでコロニーの重なりが最小限に見られた(図5A)。対照的に、12.7μmを超えるヒドロゲル厚は、重なり合うコロニーを垂直方向(図5B)に形成し、複数のコロニーを抽出することがある。コロニーの重なりは、光パターンの2次元的性質による抽出時に交差汚染を引き起こす可能性があります。例えば、トップコロニーを標的とすることができ、基礎となるコロニーもそれと一緒に抽出される(図5C)。そのため、12.7 μm のスペーサーを使用して、ヒドロゲル調製を推奨します。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg"> 図5:ヒドロゲルの厚さは抽出純度に影響を与える。(A)厚さ12.7μmのスペーサーをヒドロゲル形成に利用することで、10x焦点面内にコロニーが形成される。(B)厚さ12.7μmを超えるスペーサーを使用すると、コロニーの重ね合わせが10倍の拡大で観察される。(C)細胞放出中にコロニーのオーバーレイで交差汚染が起こり得る:(i)環状パターンが標的細胞コロニーを放出するために使用され、(ii)標的細胞コロニーがヒドロゲルから剥離し、(iii)第2に、標的コロニーの下の光暴露の間に下層コロニーが観察される。このコロニーも除去され、クロスコンタミネーションが発生します。ファタヒら19著作権2020アメリカ化学会の許可を得て転載(適応)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
UV光を有する細菌に対する潜在的な損傷を考えると、多様なUV光微小パターンが細胞生存率に及ぼす影響をさらに検討したモデル、グラム陽性菌(B.サチリス)およびモデル、グラム陰性細菌(大腸菌)。それぞれバルクヒドロゲル内にカプセル化され、標準的なプロトコルに従ってマイクロスケールのコロニーに培養され、ヒドロゲルとの相溶性を検証した。その後、同じサイズの標的マイクロコロニー(直径26±1μm)は、マイクロコロニー全体をUV光にさらす円パターンまたはヒドロゲルエッジのみを分解して細胞への光暴露を最小限に抑える円パターンの形で、一定の光量(168 mJ/mm2)にさらされた。次いで、細胞を回収し、各コロニーから回収したCFU/mLを定量化するためにメッキした。セル回復レベルに有意差は見つからなかった (図6A)。さらに抽出した細胞の純度を調べるには、 大腸菌 試料からDNAを抽出し、UV-Vis分光光度計を用いて分析した。両方のパターンについて、DNAの品質レベルは、1.8から2.0の間のA260/ A280 範囲(図6B)に収まり、ゲノムシーケンシング25に理想的な範囲にある。これは、記載された条件下での放出に使用されるUVパターンが、バルクヒドロゲルから回収された生存細胞の量または抽出後のゲノムDNAの質に対する最小限の効果を有することを示している。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg"> 図6:バルクヒドロゲルから放出される細菌の細胞生存率およびDNA品質に対する異なる光暴露パターンの影響(A)クロスパターンおよび円パターンを用いた抽出後の大腸菌およびB.サブティリスの細胞回復レベル。今回の実験では、同じ直径(26μm±1μm)の球状コロニーから抽出を行い、各コロニーから放出される細胞の数が同等であることを確認しました。次いで、抽出した溶液をめっきし、各パターンから取得したCFU/mLを計算した。統計解析では、大腸菌とB.サチリスの両方のクロスパターンと円パターンから得られたCFU/mLに有意な差は示さなかった(p値&gt;0.05、n=6の両方の株)。(B)クロスパターンと円パターンを用いた単離された大腸菌細胞のDNA品質の分光測定ここで、統計解析は、使用されるパターン(P値&gt;0.05、n=6)(C)の交差および円パターンに露出した等直径を有するコロニーのブライトフィールド画像に対するDNA品質に有意な差を示さなかった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マイクロウェルアレイは、バルクヒドロゲルと比較してより制御されたスクリーニング機能を提供する代替のラボオンチップスクリーニングインターフェースを提供します。例えば、マイクロウェルアレイは、接種中の細胞の数を制御することができる離散培養部位への細菌の播種を可能にする。深さや直径などのマイクロウェルの幾何学的特徴も、標準的な微細加工方法によって制御されます。これらの利点により、マイクロウェルは空間閉じ込め26の下で細菌の増殖を研究するのに有用であり、そして最近では、マイクロスケール18で一緒に閉じ込められたときに異なる細菌種間の共生的および拮抗的相互作用の発見に有用であった。16Sアンプリコンシーケンシングなどのゲノム解析のためのウェルからの細胞抽出は、これらのアプリケーションにとって重要です。同じヒドロゲル材料を使用して、UV光は、円またはリングパターンのいずれかとして、関心のある細胞を含むウェル上に露出することができる。 後者は、細胞の直接照射を防ぐために、マイクロウェル周囲でのみヒドロゲル分解を保証します。これを実証するために、mCherryを発現する A.トゥメファシエンス 細胞をウェルに播種し、次いでヒドロゲルをマイクロウェルアレイに取り付けた。細胞を培養し、次いで円または環状のいずれかのパターンで照射した。その後、膜をフルオレセイン-5-マライムダイで染色した。2色蛍光画像は、ウェル内の膜と細胞の両方が両方の照射パターン17について除去されることを明らかにした。バルクヒドロゲル形式とは異なり、ここでの細胞抽出は、細胞クラスター18の形状でのみ観察されている。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg"> 図7:マイクロウェルアレイからの細胞分離に対する光パターンの影響を示す代表的な共焦点顕微鏡画像(A)播種および培養後の細菌(赤)を含む直径40μmのマイクロウェル。(B)円とリングパターンを用いた光の露出(青色)。(C)赤蛍光の減少は、細胞が照射されたウェルから抽出されることを示す。(D)照射後の膜及び細菌の2色蛍光像は、ヒドロゲル(緑色)及び細菌(赤色)の両方を標的ウェルから除去したことを示す。(E)Zスタック、2色蛍光画像の標的ウェル。(D) の赤い線は xz でイメージされた xz 平面を示し、 (E) の緑の線は (D) でイメージされた xy 平面を示します。画像中のサンプル(C-E)を、放出細胞の除去のために洗浄し、次いで固定し、画像化した。スケールバー= 40 μmファン・デル・ヴリーズらの許可を得て転載(適応)17.著作権 2019 アメリカ化学ソセティズ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この形式で抽出後の菌細胞の生存率およびDNAの質を定量化するために、B.サチリスおよび大腸菌細胞を播種し、培養し、円および環パターンを用いてマイクロウェルアレイから放出した(図8A、B)。次いで、放出された細胞をATGN寒天プレートにメッキし、抽出した細胞のDNA品質を定量化した。各抽出中に一貫した数の細胞が存在することを確実にするために、同様の蛍光強度(約6000 A.U.)を有するマイクロウェルが放出を標的とした。円パターンを用いて抽出された生存細胞の数は、いずれの細菌のリングパターンを用いて抽出した生存細胞の数と有意に異ならなかった(図8C)。また、DNAの品質レベルは、いずれの細菌についても円と環状のパターン間で有意に異ならなかった(図8D)。したがって、バルクヒドロゲルの所見と同様に、ここで指定された強度と持続時間におけるUV光の適用は、マイクロウェルアレイから抽出された細胞の生存率およびDNA品質にわずかな影響を与えた。これらの知見は、下流分析のための最小限の損傷で、生存可能な細菌細胞をマイクロウェルから選択的に取り出すことができることを示している。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg"> 図8:マイクロウェルアレイから放出される細菌の細胞生存率とDNA品質に対する異なる光暴露パターンの影響 (A,B) 大腸菌 と B.サチリスの両方に対して、円パターンと環パターンが10μmマイクロウェルからの細胞抽出に使用された。この実験では、直径10μmの円パターンと、内径10μm、外径20μmのリングパターンを用いた。同じ直径のマイクロウェルを使用して、各マイクロウェルから放出される細胞の数が同じであることを確認しました。(C)抽出した溶液をめっきし、各露光パターンから取得したCFU/mLを計算した。統計解析では 、大腸菌 と B.サチリス の両方について円および環状パターンから得られたCFU/mLに有意差は示さなかった(p値&gt;0.05、n=6の両方の株)。(D)分光光度測定は、円と環パターンを用いて 大腸菌 および B.サブチリス 細胞の両方のDNAの質を測定するために使用された。ここで、統計解析は、使用されるパターンに対するDNA品質に有意な差を示さなかった(p値&gt;0.05、n=6両方の株)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図1:マイクロウェルアレイの設計と製作(A)シリコンウエハ上のマイクロウェルアレイを作製するために、標準的な微細加工技術を適用した。(B)各基板は、直径10μmのウェル7 x 7アレイで構成され、深さ20μm、ピッチ30μmです。(C)各アレイは225マイクロウェルで構成されています。この図はBaruaら18から変更されています。著作権2021フロンティアメディア。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

高分解光パタリングツールを利用して細菌細胞を単離するための光分解性ヒドロゲルの使用が報告されている。プロセスの基本的な実験手順、結果、および利点を検討します。この方法は、異種のコミュニティまたは集団からの稀またはユニークな機能を示す標的細菌の迅速かつ安価な分離を可能にする。

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

このプロトコルは、ゲノム特性評価のためのスクリーニングインターフェースから細胞を迅速に分離するように設計されており、この機能は、マクロ的に観察可能な細胞特徴とゲノム情報を組み合わせることができるので重要です。スクリーニングインターフェースから標的菌細胞を、この技術を用いて、操作的に簡単な方法で高い空間位置で単離することができる。ヒドロゲルは、他のスクリーニングインターフェースで実施することができる。ヒドロゲル材料はマイクロ流体装置からの細胞のオンデマンド検索のためのマイクロ流体チャネルに容易に組み込むことができる。まず、目的の細胞密度で架橋バッファーを接種します。12.5マイクロ遠心分離管に12.5マイクロセントリフュージチューブのクロスリンクバッファーと5.6マイクロリットルのPEG ONBジアクリレート溶液を加えて、ヒドロゲル前駆体溶液を調製します。そして最後に、6.9マイクロリットルの前腕PEGチオール溶液を混合物に加える。ヒドロゲル前駆体溶液の細胞カプセル化の場合、薄くしたベースカバーリップをきれいなペトリ皿の上に置き、カバースリップの反対側の2つのスペーサーに2つのスペーサーを置きます。スペーサーをペトリ皿にテーピングして、ベースカバースリップのスペーサーを固定します。非反応性パーフルオロキル化ガラススライドに前駆体溶液の所望の容積を加えた後、スライドをベースカバースリップに置き、ヒドロゲルの形成を室温で25分間完了させます。ゲル化が完了したら、パーフルオロアルキル化ガラススライドを静かに取り除きます。抗生物質を補ったATGN培地を含む60~15ミリのペトリ皿に基質を入れる。細菌細胞懸濁液の種子700マイクロウェルアレイ基板上に0.1のOD 600と、pH 8のリン酸緩衝生理食塩水ATGNの12.5マイクロリットルを使用して以前に示したようにヒドロゲル前駆体溶液を作る。ピペット12.5マイクロローサー溶液を非反応性パーフルオロアルキル化ガラススライド上に置き、細胞を接種したマイクロウェルアレイ基板の2つの反対側に2つの38マイクロメートルのスチールスペーサーを配置する。次に、前駆体溶液液滴でパーフルオロアルキル化ガラススライドを反転し、マイクロウェル基板の中央に液滴を置く。室温で25分間のインキュベーション後にヒドロゲルが形成されたら、マイクロウェル基板からガラススライドを静かに取り出し、抗生物質を補ったATGN培地を含むペトリ皿に基板を入れます。サンプルを PDMS ホルダに入れ、サンプルの上に定義された培地を加えて、サンプルの脱水を防ぎ、放出された細胞にキャリア溶液を提供します。キャリブレーションミラーを位置に持ち込んだ後、顕微鏡の焦点を調整してヒドロゲルまたはマイクロウェルアレイ内のコロニーの鮮明な画像を取得し、目的のコロニーまたはウェルを識別するために検査します。ここでは、カメラビューがサンプル内のコロニーを示しながら光パターンを設計し、細胞抽出のための異なるパターンをテストし、定義されたパターンを保存します。次に、セッションコントロールセクションを選択し、パターン照明ツールの製品名でタイトルのタブの下に保存されたシーケンスを追加します。パターンを刺激するオプションを選択して、必要な露出位置を表示および調整します。次に、LED制御タブで光強度を60%に、露出時間を40秒に調整し、露光プロセスを開始します。リアルタイムおよびブライトフィールドモードでヒドロゲルの劣化を監視し、セルの放出を確認します。放出された細胞を集めるには、顕微鏡フィルターをブライトフィールドからTRITCに変更し、試料の露出した領域を肉眼で可視化します。露出した領域が見つかったら、照射された場所にチューブの端部を置き、顕微鏡フィルターをブライトフィールドに戻してリアルタイムで細胞の検索を監視します。チューブの反対側に取り付けられたシリンジを使用して、放出された細胞を含む溶液の200マイクロリットルを慎重に引き出し、DNA分析またはメッキのために溶液を1.5ミリメートルの遠心分離管に移します。バルクヒドロゲルからの細胞抽出には異なるUV光マイクロパターンが使用され、放出された細胞の形態に影響を与えた。リングパターンにおけるUV露光により、コロニー全体が保護PEGヒドロゲルに封入された放出が生じた。対照的に、コロニーの一部または全部をUV光にさらすことによって、細胞は凝集細胞クラスターとして、または自由な個々の細胞として抽出することができる。ヒドロゲルの細胞播種密度と厚さは、細胞カプセル化にとって重要です。より薄いヒドロゲルは、最小限のコロニーの重複を有する微小コロニーをもたらし、厚さの増加したヒドロゲルはコロニーを重なり、複数のコロニーの抽出をもたらす可能性がある。コロニーの重なりは、光パターンの2次元的性質による抽出時に交差汚染を引き起こす可能性があります。トップコロニーが標的にされたとき、基礎となるコロニーもそれと共に抽出された。また、細胞生存率に対する多様なUV光マイクロパターンの効果も評価した。マイクロコロニーが円形またはクロスパターンのいずれかで制御された用量のUV光にさらされたとき、細胞回復およびDNA純度は影響を受けなかった。このアプローチを用いてマイクロウェルアレイから細胞を正常に取り出し、代表的な共焦点顕微鏡画像から明らかであり、円形および環状パターンで照射すると、細胞はそれぞれのパターンで除去された。マイクロウェルアレイから抽出した後、細胞の生存率とDNA量を評価した。暴露パターンは生存細胞数もDNAの質にも影響を及ぼせず、生存可能な細菌細胞を最小限の損傷でマイクロウェルから選択的に取り出し、そのDNAを下流ゲノム解析のために高純度で単離できることを示している。パーフルオロキル化カバースリップを取り除く前に、ヒドロゲルが形成されていることを常に確認してください。ヒドロゲル蒸着用スペーサーを配置し、細胞の抽出用チューブを使用する場合は、精度と注意が必要です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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このプロトコルは、上皮細胞や細菌の同時およびローカライズされた文化のためのマイクロ流体の共培養モデルを説明します。このモデルは、推定されるプロバイオティクス菌株の有効性を病因の異なる水溶性分子シグナルの役割を調べるだけでなく、画面に使用することができます。...

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医療機器上の細菌表面結合を減少させるポリマーの同定のためのハイスループットマイクロアレイ法が説明されています。...

医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

このプロトコルは慣習的な液体培養かペトリ皿より自然な生息地に類似している複雑な3D多孔質のヒドロゲルのマトリックスの運動性そして成長を調査する細菌のコロニーの三次元(3D)印刷のためのプロシージャを記述する。...

複雑な3D多孔質媒体の運動性と増殖を研究するための3Dプリンティングバクテリア

このプロトコルは、産業用微生物向けの標準的な高スループットスクリーニングワークフローを提供します。これはARTP変異誘発による変異体ライブラリの構築、自動マイクロ流体解析による陽性液滴スクリーニングを行い、その後結果を検証する過程を含みます。ワークフローの信頼性は、高収量の B. coagulans...

自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

学ぶ光分解性ヒドロゲルを用いた細菌細胞の高速分離法。マイクロスコープによるリアルタイムモニタリングとUV光パターン制御により、複雑な細菌群集から標的細胞を選択的に抽出し、ゲノム解析のための高純度DNAを取得する手法です。

細菌スクリーニング、選択、および分離のための光分解性ヒドロゲルインターフェース

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