Name: 生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶ定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植による生体内カルシウムイメージング法。自由に行動するマウスの深部脳構造における数百個の神経細胞の協調的活動を長期的に記録し、神経回路動態の理解を深めます。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)5P20GM121310、R61NS115161、およびUG3NS115608からの助成金によってサポートされています。

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<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
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<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を報告していない。

神経科学における中心的な問題は、神経ダイナミクスと回路がどのように情報をエンコードして保存し、脳疾患でどのように変化するかを理解することです。ミニスコープin vivo Ca2+イメージングシステムを使用して、局所微小回路内の数百のニューロンからの個々の神経活動を、自由に行動する動物から同時に監視することができる。ここでは、カスタム開発のミニスコープ記録システムを介して、脳深部in vivo Ca2+イメージング用のげっ歯類を調製するためのウイルス注射およびGRINレンズ移植のための詳細な手術プロトコルが記載されている。表1は、当社のミニスコープシステムと他の市販およびカスタムメイドのミニスコープシステム7、8、9、10、11、13、25、26との比較を示しています。本外科的プロトコルを用いたGRINレンズ移植は、脳深部in vivoカルシウムイメージングのための商業的またはカスタムメイドの単一光子および2光子イメージングシステムと互換性があることは注目に値します。
ウイルス注射から インビボ カルシウムイメージングのミニスコープのデータ取得まで、実験手順全体が完了するまでに少なくとも2ヶ月かかります。これは複雑で労働集約的なプロセスです。実験の最終的な成功は、GECIの適切な選択、標的脳領域におけるウイルスの正確な注入、所望の神経集団における十分なウイルス発現、所望の位置へのGRINレンズの正確な移植、手術からの適切な回復、ならびに、手術後に重度の炎症が起こるかどうか、および動物の行動が手術によって重篤に影響を受けるかどうかを含む複数の要因に依存する。 などなど。
2つの重要なステップには、ウイルスの定位注射とGRINレンズ移植が含まれる。実証の目的のために、立体マイクロインジェクションをマウスmPFCにおいて、mPFC中の錐体ニューロンを選択的に標識するCaMKIIプロモーターの制御下でGCaMP6fをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV1)を用いて実施した。GCaMP6fは、71ms15の半減衰時間を有する最速かつ最も敏感なカルシウム指標の1つであるため、選択された。さらに、GCaMP6fのAAVウイルス発現は長期間(すなわち、数ヶ月)持続するため、神経変性疾患のマウスモデルにおける縦断的研究のために、長期間にわたって反復的なin vivo Ca2+イメージングを行うのに理想的である27。現在の手術プロトコルは、他の任意の脳領域における異なる細胞集団を標的とするために適合させることができる。様々な利用可能なウイルスツールは、所望の年齢で所望の脳領域における特定の神経集団の選択的標識を可能にする。さらに、研究者らは、Cre-LoxP組換えシステムおよび利用可能な様々なトランスジェニックマウスモデルを利用して、遺伝子改変を行い、行動および神経回路の結果を研究することができる28,29。
提示されたプロトコルのユニークな特徴の1つは、GRINレンズ(直径1mm)移植の前に、自動化された層ごとの脳組織吸引が行われたことである。これは、カスタムメイドのロボットアームとソフトウェア23によって制御される真空システムに接続された27G針を介して達成される。我々の経験に基づいて、この方法は、GRINレンズが接触するための均一な表面を生成し、手動組織吸引23よりも隣接する組織への損傷が少ない。このため、この手順は、比較的広い直径(例えば、1mm)を有するGRINレンズに明らかな利点をもたらす。しかし、より小さな直径(0.5mmまたは0.25mm)のGRINレンズを移植するために、組織吸引は必要ないかもしれない。代わりに、30Gニードル21で作られた先行トラックに沿って直接植えることができます。
上記で説明した 2 つの重要な手順に加えて、操作を成功させるには、他の多くの要因を慎重に検討する必要があります。(1)脳に接触する器具はすべて滅菌して感染を予防してください。(2)さらなる炎症および過剰な瘢痕組織形成を防ぐために、脳への損傷を最小限に抑えるために、すべての手術ステップを実行する必要があります。(3)最初に与えられ、手術中に維持された麻酔用量、特に腹腔内投与された麻酔用量は、慎重に検討する必要がある。麻酔用量は、異なるマウス系統に応じて変更することができ、いくつかはより感受性であり得る。(4)マウスの状態は、手術中に常に監視する必要があります。最後に、(5)手術後に多くの合併症が発生する可能性があるため、マウスは手術後に定期的に監視する必要があります。
脳組織の塊はGRINレンズ移植ステップ中に一方的に除去されるが、我々はいかなる明白な行動欠損も観察しなかった7、12。ミニスコープの重量は約2グラムで、ケーブルは軽くし、マウスが簡単に持ち運べるようにカスタム設計されています。ミニスコープとケーブルは、in vivoイメージングの前に動物にのみ取り付けられ、イメージング後に取り外しられます。イメージングプロセス全体は、通常、30分以上かかりません。したがって、これらのインストルメンテーションは、マウスが自由に動作することを妨げるものではありません。ミニスコープの取り付けと取り外しの手順では、動物の拘束を目的として、イソフルランによる簡単な麻酔(2分未満)が必要です。我々は通常、インビボイメージングを行う前に、マウスをイソフルランの短い曝露から30分間回復させる。我々は、マウスの健康状態およびマウスの社会的行動への影響に気付かずに、数週間にわたって週に1回、ミニスコープのin vivoカルシウムイメージングを実施した12。
現在のミニスコープ記録システムの主な制限の1つは、データ収集のために顕微鏡をケーブルに接続する必要があることです。ケーブルの存在は時々マウスのタスクのパフォーマンスを制限し、一度に1匹の動物の記録を制限します。最近、ワイヤレスミニスコープが開発されました25,26.これにより、タスクのパフォーマンスが広がり、グループ内の複数の動物からの同時in vivoイメージングが可能になります。さらに、スペクトル的に分離可能な波長とデュアルカラーミニスコープを組み合わせた、より高感度なGECIを開発することは、神経科学研究にとってよりエキサイティングな可能性を提供します。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

細胞内Ca2+ シグナル伝達は、細胞増殖、増殖、分化、遊走、遺伝子転写、分泌、およびアポトーシス1の必須調節因子である。ニューロンでは、Ca2+ シグナル伝達は、その時空間パターンが膜興奮性、神経伝達物質放出、シナプス可塑性などの重要な機能に関連しているため、正確に制御されています2。
インビボカルシウムイメージングは、正常な動物の行動に元素的な神経回路表現を解読し、脳障害の動物モデルにおける異常なニューロン活動を特定し、これらの変更された回路を正常化する可能性のある潜在的な治療標的を解明するために利用できる強力な技術です。2つの一般的なインビボカルシウムイメージングシステムは、2光子レーザー走査蛍光顕微鏡3、4、5、6およびヘッドマウント小型内視鏡(miniscope)7、8、9、10、11、12、13である。.従来の2光子顕微鏡は、より良い解像度、低ノイズ、およびより低いフォトブリーチングなどの主要な利点を提供する。しかし、実験動物は頭を固定する必要があり、3、4、5、6を行うことができる行動研究が制限されています。これに対して、ヘッドマウント型ミニスコープシステムは小型で持ち運びが容易であり、自由に行動する動物7、8、9、10、11、12、13を用いた多種多様な行動試験の研究を可能にする。
2つの主要なCa2+指標、化学指標5,14および遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)15,16がある。Ca2+イメージングは、標的回路内のニューロンの特異的標識を可能にするウイルスベクターと共に送達される高感度GECIを使用することによって促進されてきた。感度、寿命、および細胞下区画でさえも標識する能力を高めるための継続的な努力により、GECIは様々なin vivoカルシウムイメージング研究に理想的です17,18,19。
イメージング中の脳組織における光の散乱は、2光子顕微鏡を用いても、深さの光学的浸透を制限する。しかし、グラジエントインデックス(GRIN)レンズは、GRINレンズを生体組織に直接埋め込み、脳深部領域から顕微鏡対物レンズに画像を中継することができるため、この問題を克服します。光学的に均質な材料で作られ、焦点を合わせて画像を作成するために複雑な形状の表面を必要とする従来のレンズとは異なり、GRINレンズの性能は、平面面20との焦点を達成するレンズ材料内の緩やかな屈折率変化に基づいている。GRINレンズは直径0.2mmまで製作可能です。そのため、微細化されたGRINレンズを、あまりダメージを与えることなく脳深部に埋め込むことができます。
この記事では、脳深部のin vivoカルシウムイメージングのための完全な手術プロトコルを提示する。実証の目的で、マウス脳の内側前頭前野(mPFC)を特異的に標的とした脳手術と、国立薬物乱用研究所(NIDA/IRP)のLin博士のグループが開発したカスタムメイドのミニスコープシステムによる生体内カルシウムイメージング記録について説明します7,12。実験手順には、2つの主要な脳手術が含まれます。最初の手術は、GCaMP6f(GECI)を発現するウイルスベクターをmPFCに定位的に注入することである。2番目の手術は、GRINレンズを同じ脳領域に移植することです。これらの脳手術からの回復後、その後の手順は、歯科用セメントを使用してマウスの頭蓋骨にミニスコープホルダー(ベース)を貼り付けることである。インビボでCa2+イメージングは、ミニスコープをベースに取り付けた後、いつでも実行できます。ウイルス注射およびGRINレンズ移植のための手術プロトコルは、インビボカルシウムイメージングにおける深部脳のための市販またはカスタムビルドの単一光子および2光子イメージングシステムと互換性があります。

<table><tbody><tr><td>0.6mmおよび1.2mmドリルバリ</td><td>KF技術</td><td>8000037800</td><td>開頭術用</td></tr><tr><td>27-Gおよび30-G針</td><td>BD PrecisionGlide針</td><td>REF 305109およびREF305106</td><td>両方の手術用</td></tr><tr><td>45個の角度付き鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td>手術用</td></tr><tr><td>7.5% ポビドンヨード溶液(ベタジン)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>表面消毒剤</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>GRINレンズクリーナー</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>抗生物質軟膏</td><td>HeliDermテクノロジー</td><td>81073087</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>抗炎症薬(イブプロフェン)</td><td>ジョンソン&ジョンソンコンシューマー株式会社</td><td>30043308</td><td>手術後の鎮痛剤として機能します</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>行動記録ソフトウェア (ポイントグレー FlyCap2)</td><td>ポイント グレー</td><td>ポイント グレー 研究 ブラックフライ BFLY-PGE-12A2C</td><td>行動を記録するため</td></tr><tr><td>真鍮製六角ナット</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>パー医薬品</td><td>NDC 4202317905</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>10043-52-4</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>整流子</td>の準備用 <td>NIDA/IRP</td><td>画像</td><td>取得システムのカスタム設計コンポーネント</td></tr><tr><td>圧縮酸素およびカックスボンド酸化タンク</td><td>ロッキーマウンテンエアソリューション</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>GRINレンズ用移植</td></tr><tr><td>圧縮酸素タンク</td><td>ロッキーマウンテン エアソリューション</td><td>OX-M-K</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>コードレスマイクロドリル</td><td>KF技術</td><td>8000037800</td><td>開頭術用</td></tr><tr><td>シアノアクリレート</td><td>ヘンケル協力</td><td># 1811182</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>データ収集コントローラー</td><td>NIDA/IRP</td><td>カスタム設計</td><td>画像取得のコンポーネントシステム</td></tr><tr><td>データ伝送ケーブル</td><td>NIDA/IRP</td><td>カスタム設計</td><td>画像取得システムのコンポーネント</td></tr><tr><td>歯科用セメントセット</td><td>C&B メタボンドと触媒</td><td>A00253revA306 および A00168revB306</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>歯科用セメントセット</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>シグマ</td><td>50-99-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>ダイエットジェル</td><td>の準備用 クリアH20</td><td>72-06-5022</td><td>ダイエットサプリメントマウス用</td></tr><tr><td>GRINレンズ</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>GRINレンズ埋め込み用</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>手術中にマウスの体を暖かく保つために</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>局所麻酔</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Σ</td><td>7791-18-6</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>マイクロリットルの調製用シリンジ(ハミルトン)</td><td>ハミルトン</td><td>7653-01</td>ウイルス<td>注射用</td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプコントローラー</td><td>ワールド精密機器</td><td>#178647</td>ウイルス<td>注射用</td></tr><tr><td>ミニスコープ</td><td>NIDA / IRP</td>カスタム<td>設計イメージング</td><td>ミニ</td></tr><tr><td>スコープベース</td><td>Protolabs</td>カスタム<td>設計</td>ベースミニ<td></td></tr><tr><td>スコープ保持アーム</td><td>NIDA / IRP</td><td>の取り付け用ミニスコープカスタムデザイン</td><td>ベース取り付け用</td></tr><tr><td>ミニスコープ保護キャップ</td><td>Protolabs</td><td>カスタムデザイン</td><td>ミニスコープ保護用</td></tr><tr><td>電動コントローラー</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>ベース取り付け用</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>in vivoイメージング用</td></tr><tr><td>眼科用軟膏</td><td>Puralube Vet 軟膏</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>眼科</td></tr><tr><td>用PCRチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>ピンチクランプ</td><td>ワールド精密機器</td><td>14040</td><td>チューブをクランプするため</td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープ</td><td>TegaSeal PTFEテープ</td><td>A-A-58092</td><td>miniScopeをベースに固定するため</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>ロボットアームの準備用</td><td>NIDA/IRP</td><td>カスタム設計</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>両手術用</td></tr><tr><td>セットスクリュー</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>ミニスコープベースの真鍮製六角ナットをねじ込むため</td></tr><tr><td>&nbsp;シリコーンゴムチューブ、0.062インチID、1/8インチOD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>aCSF の灌漑用</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>の調製用 <td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>定位固定装置の調製</td>用 <td>KOPF</td><td>モデル 962 デュアル超精密小動物定位固定装置</td><td>両方の手術で</td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>両方の手術用</td></tr><tr><td>手術用ツール</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td>手術用</td></tr><tr><td>縫合</td>糸 <td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>&nbsp;シリンジフィルター(0.22 &micro;m)</td><td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>GRINレンズ移植中にaCSFをろ過するため</td></tr><tr><td>ウイルス懸濁液 (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>ウイルス注射</td></tr><tr><td></td><td></td>用 <td>力価:2.8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr></tbody></table>

生体 内 カルシウムイメージングのための定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

小型蛍光顕微鏡(ミニスコープ)は、自由に行動する動物からの 生体内 カルシウムイメージングのための強力なツールです。従来の多光子カルシウムイメージングシステムに比べていくつかの利点があります:(1)コンパクト。(2)軽量;(3)手頃な価格。(4)自由に行動する動物からの記録を可能にする。このプロトコルは、カスタム開発のミニスコープ記録システムを使用した脳深部 in vivo カルシウムイメージングのための脳外科手術を記述しています。調製手順は、(1)マウス脳の所望の脳領域にウイルスを定位的に注入し、ニューロンの特定のサブグループを遺伝的にコードされたカルシウムセンサーで標識することを含む3つのステップからなる。(2)脳深部領域からミニスコープシステムにカルシウム像を中継できるグラジエントインデックス(GRIN)レンズの移植;(3)ミニスコープホルダーをマウスの頭蓋骨の上に貼り付け、後でミニスコープを取り付けることができます。 インビボ カルシウムイメージングを行うために、ミニスコープをホルダーに固定し、同時に行動記録とともにニューロンカルシウム画像を収集します。本手術プロトコルは、 インビボ カルシウムイメージングのための任意の市販またはカスタムビルドの単一光子および2光子イメージングシステムと互換性がある。

図1は、ウイルス注射、GRINレンズ移植、マウス頭蓋骨へのミニスコープ基部の貼付、およびミニスコープを介したインビボカルシウムイメージングを含む概略実験手順を示す。全体の手順は〜2ヶ月かかります。図2は、インビボカルシウムイメージングのミニスコープのためのプロトコルに記載された主要成分を示す。図3は、GRINレンズ注入時のオートステレオタ・ソフトウェアのインタフェースを示しています。図4は、in vivoカルシウムイメージング中のNeuViewと行動記録ソフトウェアのインターフェースを示しています。
in vivoカルシウムイメージングの結果は、ウイルス注射とGRINレンズ移植手術の両方の成功に依存します。図5は、インビボカルシウム画像化記録からのアウトカムの範囲(すなわち、不成功、最適でない、および良好)を示す。失敗した場合、カルシウム画像は暗くも明るくも見えるかもしれませんが、通常は活動的なニューロンがまったくまたはほとんど現れません。私たちは通常、5つ未満の活性ニューロンがある場合、in vivoカルシウム記録実験を追求しません。優れたインビボカルシウムイメージングは、典型的には、数百の活性ニューロンを明らかにする。記録に含まれる活動ニューロンが100個未満の場合、最適ではない記録と見なします。
最適ではない記録と良好な記録の両方で、 インビボカルシウム イメージング実験が追求され、その後のデータ解析が行われました。 動画1は 、マウスmPFCからの代表的な 生体内 カルシウムイメージング記録を示す。行動ビデオとカルシウムイメージングデータは、通常、別々に処理されます。マウスの動作ビデオは手動でスコアリングできます。カルシウム画像化ファイルは、CaImAnカルシウム画像処理ツールボックス24を用いて処理される。 図6 は、良好な インビボ カルシウムイメージング記録からの代表的な細胞マップおよびいくつかのカルシウム微量を示す。
インビボカルシウムイメージングを完了した後、最終ステップは、ウイルス注入およびGRINレンズ移植が所望の脳領域において起こったかどうかを確認することである。この目的のために、マウスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流し、続いて4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流した。マウス脳を採取し、4%PFA中で12時間後固定し、4°CでPBSに保存した。 次いで、マウス脳を、ビブラートームを用いて厚さ50μmのスライスで切片化した。脳スライスをDAPIで染色し、顕微鏡下で観察した(プロトコールには記載されていない)12。図7は、実験マウス由来のブレグマより前方〜1.94 mmのマウス脳スライスであって、GRINレンズが移植された軌跡を示す。GRINレンズトラックの下および周囲の緑色蛍光領域は、mPFC領域におけるGCaMP6fの発現を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> 図1:実験手順の概略概要。(b)mPFCにおけるGRINレンズ移植。(C)マウスの頭蓋骨にミニスコープベースを貼り付ける。(d)ミニスコープ搭載およびインビボカルシウムイメージング。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> 図2:in vivoカルシウムイメージングに必要な主要成分。 (A) 直径1mm、全長4.38mmのGRINレンズ。(B)脳組織の吸引に使用される27Gの手動研磨鈍い端の針。(C)針ホルダーに連結されたロボットアーム。(D)マウスの頭蓋骨にミニスコープベースが貼付されるまで露出したGRINレンズを保護するためのPCRチューブからのカスタムメイドのキャップ。(E) 六角ナット付きのミニスコープホルダー(ベース)。(F) ねじ部がPTFEテープで包まれているミニスコープ。(G) ロックネジでベースに固定されたミニスコープ。(H) アームを保持するミニスコープ。(I)XYZ位置でのミニスコープの移動を容易にするために使用されるカスタムメイドの3D電動コントローラ。(J)マウスがin vivoカルシウムイメージングを行っていない間に露出したGRINレンズを保護するために、ベースに固定された保護キャップ。(K) ケーブルに接続されているミニスコープ。(L)インビボCa2+イメージングのためのデータ収集システム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> 図3:層ごとの脳組織吸引中のAutoStereotaソフトウェアの インターフェース。 (A)ステップ2.17.1から2.17.3に対応するインターフェース。(B) ステップ 2.17.4 から 2.17.6 に対応するインターフェース。(C) ステップ 2.17.7 から 2.17.9 に対応するインターフェース。(D) ステップ 2.17.10 から 2.17.12 に対応するインターフェース。赤いボックスは入力値を強調表示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> 図4: NeuViewソフトウェアとin vivo カルシウムイメージング中の挙動記録ソフトウェアのインターフェース (A) NeuView のインターフェース。(B,C)動作記録ソフトウェアのインターフェイス。赤いボックスは、クリックする必要があるボタンを強調表示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> 図5:最大投影蛍光細胞マップは、起こりうる結果の範囲を示す 。 (A,B)その後のデータ解析に許容できない インビボ カルシウムイメージングの失敗。(a)は暗く、5個未満の活性ニューロンを含む。(b)明るいが活性ニューロンを有さない。(C)いくつかの活性ニューロンを含む最適でない インビボ カルシウムイメージングからの細胞マップ。(d)数百の活性ニューロンを含む良好な インビボ カルシウムイメージングからの細胞マップ。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> 図6:代表的な細胞マップおよびカルシウム一過性からの、成功したインビボ カルシウムイメージング。 左パネルは、オープンフィールドテスト中のmPFC におけるin vivo カルシウムイメージング記録からの最大投影蛍光細胞マップである。録音は5分間続きます。右側のパネルは、関心のある15の領域からのカルシウム過渡現象を示しています(色一致)。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> 図7:実験マウスの死後評価。 実験マウスのmPFCにおけるGCaMP6f発現およびGRINレンズ移植についての死後評価。長方形の領域は、GRINレンズ移植のための経路を示す。GRINレンズ移植領域の下の緑色の領域は、GCaMP6fが発現されたことを確認し、GRINレンズが所望の脳領域に正確に移植された。Cg, 帯状皮質;PrL、前大脳辺縁系皮質;IL、脳辺縁系皮質。スケールバー:400μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:NIDAのカスタムメイドミニスコープシステムと他のミニスコープシステム 7,8,9,10,11,13,25,26との比較。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
映画1: オープンフィールドテスト中のマウスmPFCからのインビボカルシウムイメージング記録。デモンストレーションの目的で、このビデオは1分間の録画のみを示しています。元の記録フレームレートは10フレーム/秒です。ビデオは元の録画よりも6倍高速です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

インビボカルシウムイメージングのミニスコープは、自由に行動するマウスのニューロンダイナミクスとマイクロサーキットを研究するための強力な技術です。このプロトコルは、ミニスコープを使用して良好なin vivoカルシウムイメージングを達成するために脳手術を行うことを記載しています。

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

ミニスコープの生体内カルシウムイメージングは、自由に行動する動物の深部脳構造における何百ものニューロンからの空間的および時間的に協調した活性を研究者が調べることを可能にします。ミニスコープのインビボカルシウムイメージングは、細胞型特異的、大規模、および縦方向の記録を実行する能力を含む多くの利点を提供する。ウイルス注射およびGRINレンズ移植のための当社の手術プロトコルは、インビボカルシウムイメージング用の深部脳用の市販またはカスタムビルドの単一光子および2つの光子イメージングシステムと互換性があります。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRashmi Thapaです。麻酔をかけられたマウスの剃毛された手術領域を消毒した後、メスを使用して正中線に沿って皮膚を通して2センチメートルの切開を行い、頭蓋骨のラムダおよびブレグマを露出させる。0.5ミリメートルの歯科用ドリルバリをブレグマから1.94ミリメートル前後部および内側側方0.5ミリメートルの位置に位置決めした後、頭蓋骨の穴あけを開始する。次に、マイクロポンプのコントロールパネルを使用してウイルスをマイクロリットルシリンジにロードし、500ナノリットルの気泡を引き出し、続いて毎秒50ナノリットルの流量で800ナノリットルのウイルスを抜き取る。針をゆっくりと脳組織に下ろし、背側腹側1.75ミリメートルのターゲットZ座標まで移動させ、次に背側腹側1.65ミリメートルのZ座標までわずかに上方に動かす。コントロールパネルで、マイクロポンプを毎分50ナノリットルの流量で500ナノリットルのウイルスを注入するように設定してから、[実行]ボタンを押してウイルスを注入します。注射が終わったら、皮膚の端を整列させ、4-0の縫合糸で切開部を慎重に閉じます。感染を防ぐために縫合された領域に抗生物質軟膏を塗布する。グラデーションインデックスまたはGRINレンズを移植するには、細かいはさみを使用して、目の間の前側からラムダの後ろの後側までの高さ1.5センチメートル、1.5センチメートルの基部の皮膚の三角形の領域を切り取ります。頭蓋骨を完全に洗浄して乾燥させた後、シアノアクリレートを皮膚の端に塗布し、皮膚を頭蓋骨に付着させる。シアノアクリレートが乾燥した5分後、直径1.2ミリメートルの歯科用ドリルバリを、ブレグマから内側側方0.8ミリメートルの前後1.94ミリメートルの位置に位置付ける。頭蓋骨をドリルスルーし、続いて30ゲージの針先を使用して硬膜を除去します。45度の角度の鋭い鉗子ですべての骨破片をきれいにします。次に、27ゲージの手動研磨鈍い端の針を針ホルダーに取り付け、10度の角度で傾けたロボットアームに結合させ、針ホルダーのもう一方の端を家の真空システムに接続します。ブレグマのZ座標をゼロに設定するためにブレグマボタンをクリックする前に、ブレグマに触れたばかりの針の先端を見つけます。入力X値を0.8、入力Y値を1.94、入力Z値を1.0に設定し、[検索]ボタンをクリックして、頭蓋骨のドリル穴の上部に針を移動します。針の先端をドリルで開けた穴の中央に配置し、Z 位置 0 まで下げます。真空をオンにし、先端が曲がった30ゲージの針に接続された重力制御チューブシステムを介して、人工脳脊髄液(ACSF)で露出した脳領域をすすぎ始めます。ACSFは、0.2ミクロンのフィルターでろ過されながら、95%の酸素と5%の二酸化炭素の混合ガスで連続的にバブリングされます。AutoStereotaソフトウェアを使用して、脳組織の吸引は4ラウンドで完了します。吸引の最初のラウンドでは、Z 値がゼロであることを確認します。次に、zStep セッションで、1 行目と 2 行目をクリックして確認します。最初の行の値を 0.2 と 1 に設定します。2 行目の値を 0.15 と 4 に設定します。モードセッションで、針のサイズを27ゲージと1.2に設定します。ディムを 0.9 に設定します。他のすべての値はデフォルトになります。吸引を開始するには、NotSet、KeepZero、およびStartボタンを順番にクリックします。吸引の最初のラウンドは、深さ0.8ミリメートル、直径1ミリメートルのカラムポケットを生成します。吸引の 3 回目のラウンドで、zStep セッションの最初の行をクリックして確認し、最初の行の値を 1.8 と 1 に設定します。モードセッションで、針のサイズを27ゲージと2.2に設定します。他の値を前のラウンドと同じにして、願望を開始します。3回目の吸引の後、カラムポケットの深さは1.8ミリメートルです。最後の吸引は、ポケットの底に溜まった血液をきれいにすることです。吸引を開始する前に、zStep セッションで最初の行の値を 1.6 と 1 に設定し、モードセッションで針のサイズを 27 ゲージ、2.2 とディム 0.6 に設定します。ポケットに血液がなくなったら、真空を止め、ACSFの灌漑を停止し、針をZ座標で2ミリメートル、中央から0.5ミリメートル前方に持ち上げます。滅菌した1ミリメートルGRINレンズを脳組織ポケットに入れます。次に、ヘラの助けを借りて、GRINレンズと脳組織との間の隙間に融解したアガロースを塗布する。アガロースがゲルを形成した後、マイクロブレードを用いて余分なアガロースを除去する。歯科用セメント粉末と触媒液を予め冷やした混合でよく混合し、GRINレンズを囲むことから始めて、露出した頭蓋骨全体を覆うことによって、頭蓋骨上に自己硬化型接着性樹脂セメントの層を塗布する。きれいなプラスチック井戸で、歯科用セメント粉末と黒炭を液体と混合して、歯科用セメントの第1層の上に混合物の薄層を塗布する。5分間固めます。ミニスコープをケーブルに接続し、カスタム開発ソフトウェアNuViewをオンにします。NuViewで、[ハードウェア]をクリックし、LED1をチェックし、[ストリーム]ボタンをクリックしてライブ画像を表示します。ライブストリーミングを停止するには、[停止]ボタンをクリックします。次に、ミニスコープをカスタムメイドのミニスコープ保持アームに固定します。電動コントローラの助けを借りて、露出したGRINレンズのすぐ上にミニスコープを配置し、レンズの表面に平行にします。ミニスコープをゆっくりとGRINレンズの方向に下ろし、最適な焦点面が見つかるまでZ位置を調整します。ミニスコープの位置を変えずに、ミニスコープベースの周りに歯科用セメントの最初の層を塗布します。セメントが固まったら、ミニスコープがマウスヘッドの上に自立できるように、保持アームを慎重に取り外します。すべてのギャップを埋めるために、ベースの周りに歯科用セメントの第2層を塗布し、ギャップからLED光漏れがないことを確認します。歯科用セメントを硬化させます。イソフルランでマウスを短時間麻酔した後、保護キャップを取り外す前に小さなドライバーでベースのロックネジを緩め、アセトンを浸した綿棒でGRINレンズの表面を拭きます。ミニスコープをケーブルに接続し、NuViewソフトウェアを起動して、鈍い鉗子の助けを借りてわずかに締め付けたり緩めたりして、ベースに対するミニスコープの位置を調整して、最適な焦点面の識別を開始します。最適な焦点面が決まったら、ロックネジを締めてからケーブルを外し、マウスをホームケージに戻します。ビヘイビアカメラソフトウェアをオンにして、ライブストリーム機能でマウスビヘイビアアリーナを表示します。トップカメラのフォーカスを手動で調整します。[ストロボのトリガー]を選択し、トリガーの有効/無効を確認してから、[録音]ボタンをクリックします。次に、[参照] を使用して、行動記録を保存する場所を選択します。目的の画像形式を選択します。マウスをアリーナに近づけ、ミニスコープをデータ集録システムにリンクされているケーブルに接続します。次に、アリーナの中央にマウスを置きます。ビヘイビアカメラソフトウェアで、[録画の開始]をクリックします。NuViewで、LED1をチェックし、[キャプチャ]をクリックしてから、トリガーボタンをクリックして録音を開始します。これにより、カルシウムイメージングとマウス行動の同時記録が可能になります。ヒット 停止 3, 000フレーム後に ファイルを保存します.記録が完了したら、マウスをイソフルランで簡単に麻酔し、ミニスコープをベースから取り外し、保護キャップをベースの上に置き、マウスをホームケージに戻します。最適でないin vivoカルシウムイメージングからの細胞マップには、いくつかの活性ニューロンが含まれていましたが、成功したイメージングからの細胞マップには、焦点領域に数百の活性ニューロンが含まれていました。インビボカルシウムイメージングに失敗した典型的な例では、領域が暗く、5つ未満の活性ニューロンを含むことが観察されたか、または領域が明るく、活性ニューロンがなかった。代表的な解析では、連続したインビボカルシウムイメージング記録からの最大投影蛍光細胞マップおよびカルシウム過渡現象が示されている。実験マウスの内側PFCにおけるGCaMP6f発現およびGRINレンズ移植の死後評価は、GCaMP6fが発現し、GRINレンズが所望の脳領域に正確に移植されたことを示した。良好なカルシウムイメージングを得るためには、GRINレンズを移植する前に、出血が完全に停止し、フィールドに血栓がないことを確認する必要があります。この技術は、異なるヒト脳障害のマウスモデルにおける神経回路の変化を研究し、薬物候補が変化した回路を正常化できるかどうかをテストするために利用することができる。

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JoVE Journal

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神経科学

新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin...

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インビボ マウスの社会的行動を理解するための視床下部での微型顕微鏡によるカルシウムイメージング

学ぶ定位ウイルス注入および勾配指数レンズ移植による生体内カルシウムイメージング法。自由に行動するマウスの深部脳構造における数百個の神経細胞の協調的活動を長期的に記録し、神経回路動態の理解を深めます。

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