免疫ペプチドミクス:マウスとヒトMHCクラスI-およびII関連ペプチドの分離による質量分析

このプロトコルは、実行が簡単で、任意の研究室の手の届くところにあるため重要です。このプロトコルは、HLAまたはMHCタイプIまたはタイプIIペプチドをヒトまたはマウスのサンプルから単離することを可能にする。この方法は、がん、ウイルス学、自己免疫疾患など、免疫系に関わるすべての研究分野に関連する科学的な質問に対処することができます。

このプロトコルは、研究室で働く誰でもアクセスできるように構築されました。手順に従ってください。セファロースシアノーゲン臭化ビーズを、サンプルあたり80ミリグラムの重量を量り、15ミリリットルの円錐形チューブに移す。

5ミリリットルの塩酸1ミリモルを加えます。ピペットは、乾燥ビーズの再懸濁を容易にするために5回上下し、その後、1ミリモル塩酸の追加8.5ミリリットルで円錐管を充填します。回転装置を使用して、ビーズを室温で30分間、20 RPMで回転させます。

200xGでビーズを室温で2分間遠心し、吸引によって上清を取り除く。500マイクロリットルのカップリングバッファーをビーズパレットに加え、ビーズ懸濁液を新しい2ミリリットル遠心管に移し、脇に置きます。これらのビーズに抗体を結合するには、選択した抗体の2ミリグラムを新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに加え、カップリングバッファー溶液で体積を1ミリリットルにして、1ミリリットル当たり2ミリグラムの最終濃度を得る。

前に調製したビーズ溶液を移し、抗体溶液に添加します。次いで、20RPMでマイクロ遠心管を回転させて120分間回転させ、ビーズを遠心分離し、先に述べたように上清を取り除く。次に、抗体結合ビーズを含むマイクロ遠心分離管に0.2モルグリシンの1ミリリットルを加え、ローテーター装置を使用して室温で20RPMで60分間回転させることで、ビーズのブロッキングと洗浄を開始します。

上清を遠心して取り除いた後、1ミリリットルPBSでビーズを洗い、遠心分離によって上清を取り除き、使用するまで4度のPBSの1ミリリットルでビーズを保存します。MHCクラスIまたはIIペプチドを単離するために、手のひらでチューブの底部を温めることによって1億個の細胞の凍結パレットを解凍する。500マイクロリットルのPBSをパレットに加え、懸濁液が均質になるまでピペットを上下に加えます。

サスペンションを新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、等量の細胞ライシスバッファーを追加します。回転装置を使用して摂氏4度で10RPMで60分間回転させます。フルブレーキで摂氏4度で20分間18,000x Gで細胞ライセートを遠心し、新しい2ミリリットルのマイクロ遠心チューブで上清を移します。

遠心分離と上清除去によって抗体結合ビーズを回収する。次いで、細胞のライセート上澄み剤を抗体結合ビーズに移し、ローテーター装置を用いて摂氏4度で14〜18時間10RPMでインキュベートする。2日目にポリプロピレンカラムの底蓋を取り外し、その柱をポリプロピレンカラムラックの上に置き、フロースルーを収集するために空の容器を下に取り付けます。

ポリプロピレンカラムを10ミリリットルのバッファーAですすいで、重力で排出します。液溶出の流速が遅すぎる場合は、ポリプロピレンカラムの下端をさらに切る。ビーズ/ライゼット混合物を測定し、収集し、ポリプロピレンカラムに移します。

液体混合物を重力で溶かしましょう。必要に応じて、ウェスタンブロッティング用のアリコート20マイクロリットルを収集して凍結します。次に、ポリプロピレンカラムに保持されているビーズを10ミリリットルのバッファーAを追加し、重力で溶出させて洗浄します。

ラックからポリプロピレンカラムを取り出し、新しい2ミリリットルのマイクロ遠心チューブの上に置き、柱とチューブを手で持ちます。ポリプロピレンカラムに1%TFAの300マイクロリットルを加え、上下に5回パイピングしてビーズを混ぜます。次いで、新しい2ミリリットルのマイクロ遠心チューブで溶出を移す。

MHCペプチドを脱塩および溶出するには、C-18カラムの上に200マイクロリットルのメタノールを加え、遠心分離機を1,546x Gで3分間加えてフロースルーを廃棄します。C-18カラムの上に0.1%TFAに80%アセトニトリルの200マイクロリットルを加え、再び遠心分離機を加えてフロースルーを廃棄します。その後、0.1%TFAの200マイクロリットルを加え、遠心分離によって流量を廃棄する。

最後に、C-18カラムの上にMHCペプチド複合体の200マイクロリットルをロードし、遠心分離によって流れを捨て、完全な体積がロードされるまで繰り返します。次に、0.1%TFAの200マイクロリットルを加え、遠心分離機をフロースルーを廃棄し、C-18カラムを新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、0.1%TFAに28%アセトニトリルの150マイクロリットルを加えてMHCペプチドを溶出させます。遠心分離後、フロースルーを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに回収します。

溶出プロセスを合計450マイクロリットルの合計体積に対して2回繰り返し、LC-MS-MSで分析されるまでマイナス20°Cで凍結します。これらの精製ペプチドを使用して、質量分析計でMHCクラスIおよびIIペプチドを同定します。ビーズの結合効率は、結合前の抗体と比較して、ビーズがCNBrビーズに共有結合する場合の軽鎖および重鎖のシグナル染色強度の有意な減少によって示された。

酸性溶出後のMHCペプチド複合体の単離は、抗HAL-ABC重鎖抗体を用いたMHCペプチド複合体の強力な検出シグナルによって確認された。現在のプロトコルを用いた結果のイントラおよび個体間再現性も推定された。3つの異なる生物学的複製物で検出されたペプチドの数の平均変動係数は小さく、1.9%から11%に変化したが、ペプチドの同一性はかなり変化し、39%から63%の範囲の3つの生物学的複製物にわたって再現性を持って検出されたペプチドの割合は、同定されたペプチドのMHC結合強度の予測を示した。

マウスMHCクラスIおよびクラスIIペプチドについて、述語の強いまたは弱い結合剤はそれぞれ89%および87%であった。ヒトHLAクラスIおよびクラスIIペプチドの場合、述語の強いまたは弱い結合剤はそれぞれ97%および70%であった。LHCクラスIおよびクラスIIペプチドに対するマウスおよびヒトのペプチド結合モチーフも生成された。

このプロトコルの最適化に先立ち、マウスMHCクラスIおよびIIペプチドの単離は非常に困難であった。この最適化されたプロトコルは、例えば、多くの多様な疾患関連研究の検証に日常的に使用されるインビボマウスモデルからのマウスMHCクラスIおよびIIペプチドの単離を容易にする。