天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強
2021年9月23日
天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。
常磁性緩和増強技術は、分子間距離を特徴付けて測定し、一過性および/または人口の少ない生体分子相互作用を定量化するために利用できます。ここでは、この手法を適用して、タンパク質の凝縮に先行する相互作用をキャプチャしました。PREの感度により、他のNMR技術では目に見えず、アクセスできない動的状態の原子分解能の同定、検出、定量が可能になります。
このプロトコルの重要なステップには、非共役ニトロキシドスピン標識の除去と、ピーク高さを正確に測定するためのスペクトルの慎重な分析が含まれます。さらに、NMR実験のセットアップとパルスキャリブレーションの際には注意が必要です。まず、ストック溶液から目的の15N同位体標識タンパク質の20倍モル過剰で3-マレイミド-PROXYLを加えます。
室温または摂氏4度で、光と酸素から保護し、穏やかな揺り動かしまたは栄養補給しながら一晩インキュベートします。翌日、タンパク質サンプルの広範な透析またはゲルろ過を使用して、非特異的溶媒PREを防ぐために、非反応フリースピン標識を除去します。次に、Ellman試薬を使用して、溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量します。
マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し、検量線を作成します。分子内PREを測定するには、NMRに適したバッファー中で、15N同位体濃縮スピン標識タンパク質を100マイクロモル以上300マイクロモル以下の濃度に調製します。次に、ロングステムガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、NMRサンプルを高磁場磁石での使用に適した5ミリメートルNMRチューブに移します。
サンプルを磁石に入れます。lockコマンドを使用して重水素信号をロックし、施設のプロトコルに従ってプロトンチャネルを調整して一致させます。次に、トップシムサブルーチンを使用してシムを調整し、溶媒シグナル抑制を最適化します。
次に、P-OPTプログラムを使用してプロトンパルスを校正します。次に、標準サンプルに対して15Nパルスを校正します。シェーピングパルスの正しい減衰を決定するには、シェイプツールサブルーチンを使用します。
次に、フォルダアイコンをクリックして、適切なパルス形状ファイルを開きます。成形パルスは、取得パラメータのパルスパラメータセクションにあります。パルス定義ファイルをロードしたら、「波形の解析」、「形状の統合」の順にクリックします。
校正済みのプロトン90度ハードパルス、希望形状パルス長、および回転を入力します。次に、校正された90度パルスの減衰に電力レベルの変化を加えて、成形パルスの電力レベルを計算します。標準プロトン15N HSQCを記録して、掃引幅、キャリア周波数を最適化し、水抑制を確認します。
最後に、SW[SW]コマンドと[TD]コマンドを使用して、または適切なダイアログ ボックスで直接、スイープ幅と間接寸法増分数を調整します。前に示したように、成形パルスを校正します。次に、[集録パラメータ]タブの[パルスパラメータ]セクションに校正済みのパルス長を入力します。
2時間遅延点アプローチを使用してアミドプロトンT2を測定するには、VDリストファイルを編集して時間遅延を設定します。最初の遅延は 0.01 ミリ秒に設定されます。予想される最大PREとの関係を使用して、2番目の遅延を選択します。
次に、第1および第2の遅延スペクトルの第1の増分を比較し、信号がその初期値の40〜50%の間に減衰するように第2の遅延を調整することによって、適切な値を決定する。十分な信号平均化のために、記録する複素点の数とスキャンの数を決定します。次に、コマンドEXPTを使用して実験時間を計算し、コマンドZGで実験を開始します。アスコルビン酸ナトリウムをNMRバッファーに溶解した後、元のNMRバッファーと一致するようにpHを調整します。
次に、チューブの縁の下に液滴を置いて、スピン標識の濃度の10倍を超える過剰モルでアスコルビン酸をNMRチューブに加えます。チューブに蓋をし、慎重に反転させて混ぜます。ハンドクランク遠心分離機で200〜400 Gで10〜20秒間回転させ、チューブの底にサンプルを沈降させます。
チューブをホイルで包んだ後、反応を少なくとも3時間進行させます。次に、常磁性サンプルに使用したのと同じパラメーターを使用して、反磁性サンプルにアミドプロトンT2を記録します。分子内アミドプロトンガンマPREは、RNA結合タンパク質EWSR1の低複雑性ドメインに由来する自己会合性の天然変性断片上に記録されました。
スピンラベル付着点に連続して近接する残基は、大幅に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から順次間隔を空けているが増強ガンマを示した残基は、スピン標識に空間的に近かった。天然変性タンパク質の場合、ピューレを記録および分析すると、分子内接触および一過性相互作用表面に関する情報が得られます。
PRE測定を動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、計算方法などの他の生物物理学的方法と組み合わせることで、より深い洞察を得ることができます。PRE測定は、過渡的な人口の少ない状態を特徴付けるのに役立ちます。このアプローチは、分子認識、アロステリック立体配座選択、相分離による膜のないオルガネラの組み立てを含むアセンブリプロセスなど、無数の生物学的プロセスに重要な相互作用を特徴付けるために拡張できます。
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概要
本記事では、内在性不規則タンパク質における弱く一過性の相互作用を検出するために、常磁性緩和増強（PRE）NMR分光法を利用するプロトコルを紹介します。この手法により、分子間距離の特性評価および低占有率のバイオ分子相互作用の定量化が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 構造生物学
背景
- 常磁性緩和増強（Paramagnetic relaxation enhancement）は、強力なNMR手法です。
- 他の手法では捉えられないことが多い動的な状態を特定することができます。
- タンパク質相互作用を理解することは、生物学的プロセスを解明する上で不可欠です。
- 固有不規則タンパク質（Intrinsically disordered proteins）は、細胞機能において重要な役割を果たしています。
研究目的
- PRE NMR分光法を適用するための詳細なプロトコルを提供すること。
- タンパク質の凝集が起こる前に生じる相互作用を捉えること。
- NMR測定の感度と分解能を向上させること。
使用した手法
- 3-maleimido-PROXYLスピンラベルの利用。
- 20倍モル過剰のストックソリューションの調製。
- ピーク高を測定するためのNMRスペクトルの慎重な解析。
- NMR実験のセットアップおよびパルス校正への留意。
主な結果
- 一過性のタンパク質相互作用の検出に成功。
- ダイナミックな状態を原子分解能で同定。
- 従来は不可視であった生体分子相互作用の定量化。
- 弱い相互作用を捕捉する本手法の感度を実証。
結論
- PRE NMR分光法は、本質性無秩序タンパク質の研究に有効です。
- このプロトコルにより、タンパク質ダイナミクスの理解が深まります。
- 今後の応用として、さまざまな生体分子相互作用への展開が期待されます。
よくある質問
業界における重要性
常磁性緩和増強（PRE）NMRを用いることで、従来の構造解析手法では検出不可能な、弱く一過性のバイオ分子間相互作用の検出および定量が可能になります。この機能は、治療標的として注目が集まっている天然変性タンパク質における低集団の遭遇複合体を特性評価することで、ターゲットバリデーションを支援します。本手法は、分子認識や相分離プロセスに関連する動的状態について、原子分解能での知見を提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値： 一過性のタンパク質-タンパク質相互作用またはタンパク質-核酸相互作用を検出することで、治療的仮説を検証する。
- 運用的価値： 動的システムにおける分子間距離の測定を通じて、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 非構造領域における非特異的結合を促進する相互作用面の特性を明らかにすることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：相互作用インターフェースを定義することで、ダウンストリームスクリーニング用に検証済みの生物学的システムを調製します。
- 定量的な出力：疎な集団状態における距離拘束および集団推定値を提供します。
- 再現性：信頼性の高い測定を確実にするために、慎重なスピンラベルの除去とピーク高さの解析が必要です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性： 相分離によるバイオ分子凝縮物および膜のないオルガネラの形成に適用可能。
- トランスレーショナルな連続性： 相互作用の熱力学を特性評価することで、基礎研究と前臨床研究を橋渡しする。
- メカニズムによるリスク低減： 観察された効果が、特異的な結合によるものか、あるいは非特異的な凝集によるものかを明確にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
PRE NMRは、標的仮説の検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、特に従来の構造解析手法では困難な天然変性タンパク質標的に対して有効です。
- 探索生物学：安定した複合体形成前のエンカウンター複合体を検出することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：アミドプロトンT2緩和における定量可能なPRE効果を通じて、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析：結合条件を比較するための定量的な従属変数測定（PRE速度、距離推定）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：アセンブリプロセスに関連する相互作用を特性付けることで、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数の天然変性タンパク質ターゲットにわたる弱い相互作用を調べるための、再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 一過性の低親和性相互作用の検出による、ターゲットエンゲージメントの予測信頼性の向上。
- 運用の価値： 制御されたスピンラベル結合および反磁性/常磁性サンプルの比較による標準化。
- 戦略的価値： 無秩序タンパク質システムにおけるメカニズムの曖昧さを排除し、go/no-go決定に寄与する。
- ポートフォリオへの影響： 相互作用の強度と特異性に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の注意点
- NMR分光法およびスピンラベル化学における専門知識が必要です。
- パルス校正機能を備えた高磁場NMR装置が必要です。
- サンプル調製およびデータ解析におけるチーム間の標準化が求められます。
- スピンラベルの接近性と緩和に影響を与えるタンパク質固有の要因を考慮する必要があります。
- スピンラベル化が天然の相互作用を乱さない系に限定されます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Conjugating the 3-Maleimido-PROXYL Nitroxide Spin Label
1:38
Preparing the NMR Sample for Measuring Intramolecular PRE
2:11
Setting Up the NMR Spectrometer and Experiment Specific Parameters
3:51
Setting Up the 1HN-T2 Experiment
4:58
Making a Diamagnetic Sample by Reducing Spin-Label with Ascorbic Acid
5:52
Results: 1HN-T2 Rates for Residues 171 - 264 of the Intrinsically Disordered Domain of EWSR1
6:30
Conclusion
![過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の測定[1-13C]ピルビン酸](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.672Z&w=384&q=75)
