Name: 天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶ常磁性緩和増強NMR分光法による天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価。原子分解能で動的状態を同定し、弱い相互作用を定量化する手法です。

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ジンファ・イン博士とクリスティン・カノ博士の有益な議論と技術支援に感謝します。DSLは聖バルドリック奨学生であり、聖バルドリック財団(634706)の支援を認めています。この研究の一部は、ウェルチ財団(AQ-2001-20190330)からDSL、Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund(Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL)、UTHSA Startup Up FundsからDSL、Greehey Graduate Fellowship in Children's HealthからCNJに支援されました。この研究は、テキサス大学サンアントニオ校健康科学センターの機関研究コアの一部である構造生物学コア施設で実施された研究に基づいており、研究担当副学長室およびメイズがんセンターの創薬および構造生物学共有リソース(NIH P30 CA054174)。

すべての著者が原稿を読み、承認しました。利益相反は宣言されていません。

PREを用いて、天然変性タンパク質と様々な結合パートナーとの間の低集団に存在する一過性相互作用を特徴付ける方法が提示されている。示されている例では、タンパク質は自己会合性であるため、PREは分子間相互作用と分子内相互作用の組み合わせから生じる可能性があります。この方法は、2つの異なるタンパク質間の相互作用を特徴付けることができる不均一なサンプルに容易に拡張できます。タンパク質の異なる領域がどのように相互作用するかについての相補的な情報は、タンパク質内の異なる位置にスピン標識を配置することによって得られる。さらに、NMR活性(15N)種とNMR不活性(14N)種の間でスピン標識を交互に行うことで、観察されたPREの分子内および分子間の供給源を互いに区別し、遭遇した複合体に関する情報を提供することができます。ここで概説した実験は、マイクロ秒のタイムスケールで発生した場合でも、複雑な相互作用に遭遇したことを報告できます13。
この方法の中心となるのは、システイン残基への結合による目的のタンパク質へ...

内因性障害(ID)は、安定した二次構造または三次構造に自発的に折りたたまれないが生物学的に活性であるタンパク質(IDP)またはタンパク質内の領域(IDR)を表します。一般に、IDP/IDRの機能は、生理学的条件1で生体分子との特異的でありながら可逆的な相互作用を促進することです。したがって、IDPおよびIDRは、多タンパク質複合体の動員、組織化、および安定化、例えば、スプライソソーム2の組み立ておよび活性、DNA損傷部位における成分の動員および組織化3、転写複合体4、またはクロマチンリモデリングBAF5の組織化および安定化を含む、様々な細胞機能に関与している.さらに、IDPはシグナル伝達ネクサスに見られ、異なる結合パートナーとの乱交により、細胞タンパク質ネットワークを介した情報伝達を媒介することができます6。最近の研究では、IDR領域が液-液相分離のプロセスを通じて生体分子凝縮物を自己会合形成する傾向も明らかになりました7。IDを含む前述の機能の多くは、現在、凝縮物形成8のいくつかの側面を含むと考えられています。生体分子複合体の組み立て、安定化、足場、およびシグナル伝達にとってIDは重要であるにもかかわらず、IDPおよびIDRは通常、X線結晶構造解析または極低温電子顕微鏡を使用した構造調査に適していないため、それらの特異的相互作用の原子の詳細を特定することは困難です。
核磁気共鳴(NMR)は、剛直または均質な構造アンサンブルの存在に依存せず、個々の原子核の直接の局所環境を報告するため、IDを調べるための理想的な手法です。所与の分子内の原子核の共鳴周波数または化学シフトは、局所的な電子分布によって誘発される弱い磁場の影響を受け、結合長、角度、他の原子核の近さ、結合パートナーとの相互作用、およびその他の要因に依存します9。したがって、各核は、その局所的な化学環境の変化に敏感な独自の部位特異的構造プローブとして機能します。これらの利点にもかかわらず、NMRはバルク技術であり、観測された化学シフトは特定の核によってサンプリングされたすべての環境の平均です。この号で取り上げるNMR技術の多くは、平均化された化学シフトに含まれる高エネルギーで人口の少ない生体分子立体構造に関する構造的、動的、および速度論的情報を回復するために開発されました10,11。一過性に人口が存在しますが、これらの状態の同定と定量化は、機能メカニズムの詳細を決定するために重要です12。例えば、IDPおよびIDRの場合、立体配座アンサンブルは、生理学的結合パートナーとの遭遇複合体の形成に生産的である立体配座を優先的にサンプリングするように偏っている可能性がある。これらの状態の検出、ならびに残基特異的な分子間および分子内相互作用およびダイナミクスの同定は、タンパク質機能と複合体形成の根底にある構造メカニズムを決定するために重要です。
常磁性緩和増強(PRE)NMRを使用して、IDP/IDRを介した生体分子複合体の形成に重要な過渡的で人口の少ない状態を調べるためのプロトコルについて説明します13。このアプローチは、α-シヌクレイン14,15からのアミロイド線維の集合やFUS 16の自己会合を促進するような一過性のタンパク質間相互作用の研究や、シグナル伝達タンパク質間などの特定のタンパク質間相互作用を特徴付けるのに役立ちます17。自己会合性IDPの例が提示され、特定の分子間および分子内相互作用が優先的に圧縮された状態をもたらし、自己会合を促進する部位特異的相互作用をもたらします。
PREは、原子核から常磁性中心への磁気双極子相互作用から等方性gテンソルで生じ、一般にニトロキシド基上の不対電子の形で、または常磁性金属原子として供給されます18(図1)。異方性のgテンソルを持つ原子もPRE効果を生じますが、これらの系の解析は、擬似接触シフト(PCS)または残留双極子結合(RDC)によって引き起こされる交絡効果のためにより困難です13,19。原子核と常磁性中心との間の相互作用の強さは、両者の間の<r-6>距離に依存する。この相互作用は核緩和率の増加をもたらし、不対電子の磁気モーメントが非常に強いため、長距離相互作用(~10-35 Å)でも検出可能な線の広がりを引き起こします20,21。PREによる過渡状態の検出は、次の2つの条件が満たされている場合に可能です。(1)過渡的相互作用はNMRタイムスケールで高速交換中である(観察された化学シフトは交換状態の集団加重平均である)。(2)原子核から常磁性中心までの距離は、過渡的な人口状態の方が主状態11よりも短い。横PREはΓ2と表され、実用的な目的のために、常磁性中心を含むサンプルと反磁性コントロールとの間の1H横緩和率の差から計算されます。PREの理論と、高速交換レジームと低速交換レジームにおける関連する疑似接触シフトの詳細な扱いについては、読者はCloreと同僚による包括的なレビューを参照します13,22。ここでは、1H N-Γ2が高速交換レジームにある状況のみが考慮され、PREのr-6依存性のために、観測された緩和率は、常磁性中心が核に近づく距離とそのコンフォメーションに費やす時間の両方に関連しています。したがって、近接アプローチを伴わない過渡配座は小さなPREを生成し、より近い相互作用は、たとえ短命であっても、より大きなPREを生成します。
IDPの場合、PREは、単一分子内(分子内)および別々の分子間(分子間)で発生する相互作用を測定および区別するために使用されます。NMR可視(例えば、15N標識)またはNMR不可視(例えば、天然存在比14N)タンパク質に常磁性中心を結合させることにより、PREの供給源(分子間または分子内)を決定することができます(図2)。システイン残基を導入する部位特異的突然変異誘発は、常磁性中心(スピン標識)をタンパク質23に結合させるための便利なアプローチである。スピン標識として使用するために、金属キレート化(EDTAベース)およびフリーラジカル(ニトロキシドベース)を含むいくつかのタイプの分子が提案されています24。さまざまなニトロキシドスピン標識が記載されており、メタンチオスルホン酸塩、マレイミド、ヨードアセトアミドなどのさまざまなシステイン反応性化学物質で利用できます25,26(図1)。タグまたはリンカーの固有の柔軟性は、特定の分析にとって問題となる可能性があり、このような状況では、かさばる化学基を追加したり、タグをタンパク質に固定するための第2のリンカーの使用(2部位の結合)など、タグの動きを制限するためのさまざまな戦略が提案されています27。28。さらに、市販のタグはジアステレオマータンパク質を含み得るが、一般にこれは観察されたPRE29に寄与しないであろう。マレイミド化学を介して遊離システインに結合した3-マレイミド-PROXYLの使用は、容易に入手可能で、費用効果が高く、非可逆的であり、還元剤トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)が標識反応全体を通して溶液中に維持できるため、説明されています。3-Maleimido-PROXYLは等方性のgテンソルを有するため、PCSまたはRDCは誘導されず、常磁性および反磁性サンプルの両方に同じ化学シフト割り当てを使用することができる13。
1HN−T 2は、8〜12の時点30からなる完全な進化系列を収集するのと同じくらい正確であることが以前に示されている2つの時点戦略(Ta、Tb)を使用して測定される。第1の時点(Ta)は、実用可能な限りゼロに近く設定され、第2の時点の最適な長さは、所与の試料について予想される最大PREの大きさに依存し、Tb ~ 1.15/(R2,dia + Γ2)から推定することができ、ここでR2,diaは反磁性試料13のR2を表す。最大のPREの大きさが不明な場合は、Tbをタンパク質の1H T2の~1倍に設定することが適切な初期推定値であり、T2を調整してS/N比を改善することによってさらに最適化されます。この2点測定戦略は、PRESの測定に必要な実験時間を大幅に短縮し、特に分子間の非特異的接触の影響を最小限に抑えるために比較的希薄なサンプルが使用されるため、より多くのシグナル平均化のための時間を可能にします。HSQCベースのパルスシーケンスは、1HN−T2を測定するために使用され、他の場所で詳細に説明されている30。感度を向上させるために、順方向および後方のINEPT転送のハードパルスを成形パルスに置き換えることができます。あるいは、配列は、TROSYベースの読み出し31に容易に変換される。IDPは通常、横方向の緩和速度がはるかに長いため、同様のサイズの球状タンパク質よりも(固有の障害のために)線幅が狭くなるため、間接次元での長い取得時間を使用して、スペクトル分解能を向上させ、IDPに固有の化学シフト分散の制限を緩和できます。
PREは、タンパク質間およびタンパク質間相互作用、特に一過性または人口の少ない相互作用を研究するための有用なツールです。タンパク質精製、部位特異的スピン標識、パルスプログラムの設定とキャリブレーション、NMRデータの処理と解釈の手順など、PREの測定に適したNMRサンプルを調製するための詳細なプロトコルが提供されています。サンプル濃度、スピン標識の選択、常磁性成分の除去など、データ品質と実験結果に影響を与える可能性のある重要な実験上の考慮事項が全体を通して注目されています。

<table><tbody><tr><td>0.45 以上mおよび0.22 &micro;mシリンジフィルター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>最初の精製ステップの前とサイズ排除クロマトグラフィーの前に溶解液をろ過します。</td></tr><tr><td>100 mmシャー</td>レ<td>フィッシャー</td><td>FB0875713</td><td>細菌形質転換用の寒天プレート。</td></tr><tr><td>14N 塩化アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>M9培地で15Nを使用すると、NMR可視タンパク質が生成されます14NはNMR不可視タンパク質を生成します</td></tr><tr><td>15N塩化アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>M9培地で15Nを使用すると、NMR可視タンパク質が生成されます 14NはNMR目に見えないタンパク質を生成します</td></tr><tr><td>3 L Fernbach バッフルフラスコ</td><td>コーニング</td><td>431523</td><td>細菌発現培養</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Nitroxideスピンラベル</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-432-22</td><td>溶液/タンパク質貯蔵</td></tr><tr><td>アミコン遠心フィルター</td><td>ミリポア シグマ</td><td>UFC900308</td><td>タンパク質濃度</td></tr><tr><td>アンピシラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5354</td><td>選択的マーカーのための抗生物質、正確な選択は発現コンストラクト プラスミド</td></tr><tr><td>分析バランス</td><td>オアフス</td><td>30061978</td><td>エクスプローラー プロ、試薬の計量用</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>AX1775</td><td>ニトロキシドスピンラベルの削減</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td><td></td><td>ガラス器具と培養培地の滅菌</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C4901</td><td>M9培地成分</td></tr><tr><td>遠心分離ボトル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>010-1459</td><td>組換えタンパク質発現後の大腸菌細胞の採取</td></tr><tr><td>遠心分離機、手回しクランク</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>0241C68</td><td>Boekelの手動駆動低速遠心分離機、NMRチューブを収容できる15mLバケット付き</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>緩衝液から汚染常磁性化合物を除去</td></tr><tr><td>コンピュータワークステーション</td><td></td><td></td><td>LinuxまたはMac OSと互換性があり、NMRPipeやSparky酸化重水素などのNMRデータ処理および分析ソフトウェアパッケージ</td></tr>に対応 <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>NMRロックシグナルに必要</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 培地成分</td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 培地成分</td></tr><tr><td>エルマン試薬 (5,5-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>22582</td><td>遊離シスチエン残基の定量</td></tr><tr><td>高速遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3114-0050</td><td>細菌溶解物を除去するために使用されます。</td></tr><tr><td>ハイフィールドNMR装置(600 - 800 MHz)</td><td>ブルカー</td><td></td><td>マルチチャンネル極低温プローブと温度制御</td></tr><tr><td>IMACカラムを装備、HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>粗細菌溶解物</td></tr><tr><td>イソプロピルB-D-チオガラクトシド(IPTG)</td>の初期分画 <td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td> lacオペレーターLB寒天熱の<td>制御下で遺伝子のタンパク質発現を誘導</td></tr><tr><td></td><td>フィッシャー</td><td>22700025</td><td>アイテムは、目的のタンパク質を発現するために大腸菌を変換するために使用され、これらのアイテムのいずれかと同様の製品との代替物は許容されます。</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>低圧クロマトグラフィーシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>7318300</td><td>BioRad BioLogicは、IMACカラムなどの低圧チョコレートグラフに使用されます</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 培地コンポーネント</td></tr><tr><td>中圧クロマトグラフィーシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>BioRad NGC は、多波長検出器、pHおよび導電率モニター、自動フラクションコレクター</td></tr>を装備 <tr><td>MEMビタミン溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 培地成分</td></tr><tr><td>マイクロフルイダイザー</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>迅速かつ効率的な細菌細胞溶解</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td>を提供 <td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>適切にフィットする使い捨てチップを備えたマイクロピペットの較正セット(エッペンドルフなどの複数のメーカーから入手可能)</td></tr><tr><td>モノ塩基性リン酸カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>1551139</td><td>M9培地成分</td></tr><tr><td>NMRピペット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>255688</td><td>NMRチューブからサンプルを取り外すには</td></tr><tr><td>NMRサンプルチューブ</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>高磁場NMR分光計に適しています</td></tr><tr><td>分取遠心機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アバンティ J-HC</td><td>組換えタンパク質発現後の大腸菌細胞の収穫</td></tr><tr><td>丸底ポリスチレン遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>352057</td><td>透明な細菌溶解物</td></tr><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>S44I200005</td><td>大腸菌のスターターおよび発現培養物の温度制御された増殖</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td> シ<td>グマ・アルドリッチ</td><td>S5886</td><td>M9メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>超音波処理 水浴と真空源</td><td>トーマス・サイエンティフィ</td><td></td>ック <td>緩衝液の脱気に使用</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FB505110</td><td>細菌細胞の溶解または細菌のDNAのせん断に使用</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>インプリメン</td><td>OD600 希釈光度計</td><td>大腸菌タンパク質発現培養物の成長を監視する</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600サイズ exculsioncolum</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>最終タンパク質精製ステップ</td></tr><tr><td>Topspinソフトウェア、バージョン3.2以降</td><td>ブルカー</td><td></td><td>NMR装置用オペレーティングソフトウェア</td></tr><tr><td>形質転換能力 大腸菌細胞</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C600003</td><td>ワンショット BL21 スター (DE3) ケミカルコンピテント大腸菌、他の菌株は互換性があるかもしれません</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>20490</td><td>一部のスルフヒドリル反応性抱合体と互換性のある還元剤</td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td><td>NP80</td><td>を実装</td><td>タンパク質濃度を測定します。</td></tr><tr><td>ウォーターバス、温度制御</td><td>サーモフィッシャー</td><td>FSGPD25</td><td>細菌形質転換のヒートショックステップ用</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>必要に応じてM9培地を補充するため</td></tr></tbody></table>

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

天然変性タンパク質およびタンパク質内の天然変性領域は、ヒトプロテオームの大きく機能的に重要な部分を構成しています。これらの配列の柔軟性が高いため、多様な生体分子パートナーと弱く、長距離で、一過性の相互作用を形成することができます。特異的でありながら親和性の低い相互作用は、無差別結合を促進し、単一の天然変性セグメントが多数の標的部位と相互作用することを可能にします。これらの相互作用は一過性であるため、タンパク質に依存して単一の優勢な立体配座を形成する構造生物学的手法では、それらを特徴付けるのが難しい場合があります。常磁性緩和増強NMRは、弱い相互作用や過渡的相互作用の構造的基盤を同定し、定義するための有用なツールです。常磁性緩和増強を使用して、天然変性タンパク質とそのタンパク質、核酸、または他の生体分子パートナーとの間に形成される低人口エンカウンター複合体を特徴付けるための詳細なプロトコルが記載されている。

RNA結合タンパク質EWSR142の低複雑性ドメインに由来する自己会合性天然変性フラグメント(残基171-264)に分子内1H N-Γ2 PREを記録しました(図3)。スピン標識付着点に連続して近接する残基(例えば、図3の残基178または260)は、有意に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から連続して間隔を空けているが、増強Γを示す残基2は、スピン標識に空間的に近い(10〜35 Å)。EWSR1 171-264の場合、PRE効果の原因は、残基間接触と残基内接触の組み合わせから生じる可能性があり、原子核から常磁性中心までの距離、その立体配座の集団、および電子スピンと核スピンを接続するベクトルのダイナミクスに依存するため、複雑です。さらに、分子内接触から生じるPREの大きさは濃度に依存しませんが、分子間接触から生じるPREは濃度だ...

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

常磁性緩和増強技術は、分子間距離を特徴付けて測定し、一過性および/または人口の少ない生体分子相互作用を定量化するために利用できます。ここでは、この手法を適用して、タンパク質の凝縮に先行する相互作用をキャプチャしました。PREの感度により、他のNMR技術では目に見えず、アクセスできない動的状態の原子分解能の同定、検出、定量が可能になります。このプロトコルの重要なステップには、非共役ニトロキシドスピン標識の除去と、ピーク高さを正確に測定するためのスペクトルの慎重な分析が含まれます。さらに、NMR実験のセットアップとパルスキャリブレーションの際には注意が必要です。まず、ストック溶液から目的の15N同位体標識タンパク質の20倍モル過剰で3-マレイミド-PROXYLを加えます。室温または摂氏4度で、光と酸素から保護し、穏やかな揺り動かしまたは栄養補給しながら一晩インキュベートします。翌日、タンパク質サンプルの広範な透析またはゲルろ過を使用して、非特異的溶媒PREを防ぐために、非反応フリースピン標識を除去します。次に、Ellman試薬を使用して、溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量します。マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し、検量線を作成します。分子内PREを測定するには、NMRに適したバッファー中で、15N同位体濃縮スピン標識タンパク質を100マイクロモル以上300マイクロモル以下の濃度に調製します。次に、ロングステムガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、NMRサンプルを高磁場磁石での使用に適した5ミリメートルNMRチューブに移します。サンプルを磁石に入れます。lockコマンドを使用して重水素信号をロックし、施設のプロトコルに従ってプロトンチャネルを調整して一致させます。次に、トップシムサブルーチンを使用してシムを調整し、溶媒シグナル抑制を最適化します。次に、P-OPTプログラムを使用してプロトンパルスを校正します。次に、標準サンプルに対して15Nパルスを校正します。シェーピングパルスの正しい減衰を決定するには、シェイプツールサブルーチンを使用します。次に、フォルダアイコンをクリックして、適切なパルス形状ファイルを開きます。成形パルスは、取得パラメータのパルスパラメータセクションにあります。パルス定義ファイルをロードしたら、「波形の解析」、「形状の統合」の順にクリックします。校正済みのプロトン90度ハードパルス、希望形状パルス長、および回転を入力します。次に、校正された90度パルスの減衰に電力レベルの変化を加えて、成形パルスの電力レベルを計算します。標準プロトン15N HSQCを記録して、掃引幅、キャリア周波数を最適化し、水抑制を確認します。最後に、SW[SW]コマンドと[TD]コマンドを使用して、または適切なダイアログ ボックスで直接、スイープ幅と間接寸法増分数を調整します。前に示したように、成形パルスを校正します。次に、[集録パラメータ]タブの[パルスパラメータ]セクションに校正済みのパルス長を入力します。2時間遅延点アプローチを使用してアミドプロトンT2を測定するには、VDリストファイルを編集して時間遅延を設定します。最初の遅延は 0.01 ミリ秒に設定されます。予想される最大PREとの関係を使用して、2番目の遅延を選択します。次に、第1および第2の遅延スペクトルの第1の増分を比較し、信号がその初期値の40〜50%の間に減衰するように第2の遅延を調整することによって、適切な値を決定する。十分な信号平均化のために、記録する複素点の数とスキャンの数を決定します。次に、コマンドEXPTを使用して実験時間を計算し、コマンドZGで実験を開始します。アスコルビン酸ナトリウムをNMRバッファーに溶解した後、元のNMRバッファーと一致するようにpHを調整します。次に、チューブの縁の下に液滴を置いて、スピン標識の濃度の10倍を超える過剰モルでアスコルビン酸をNMRチューブに加えます。チューブに蓋をし、慎重に反転させて混ぜます。ハンドクランク遠心分離機で200〜400 Gで10〜20秒間回転させ、チューブの底にサンプルを沈降させます。チューブをホイルで包んだ後、反応を少なくとも3時間進行させます。次に、常磁性サンプルに使用したのと同じパラメーターを使用して、反磁性サンプルにアミドプロトンT2を記録します。分子内アミドプロトンガンマPREは、RNA結合タンパク質EWSR1の低複雑性ドメインに由来する自己会合性の天然変性断片上に記録されました。スピンラベル付着点に連続して近接する残基は、大幅に広がることが予想され、スペクトルでは検出できません。付着点から順次間隔を空けているが増強ガンマを示した残基は、スピン標識に空間的に近かった。天然変性タンパク質の場合、ピューレを記録および分析すると、分子内接触および一過性相互作用表面に関する情報が得られます。PRE測定を動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、計算方法などの他の生物物理学的方法と組み合わせることで、より深い洞察を得ることができます。PRE測定は、過渡的な人口の少ない状態を特徴付けるのに役立ちます。このアプローチは、分子認識、アロステリック立体配座選択、相分離による膜のないオルガネラの組み立てを含むアセンブリプロセスなど、無数の生物学的プロセスに重要な相互作用を特徴付けるために拡張できます。

paramagnetic-relaxation-enhancement-for-detecting-characterizing-self

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この実験の目的は、水中で自己組織ディスコ両親媒性物質のサイズ、形状と安定性を決定し、制御することである。水性ベースの超分子ポリマーの制御のようなレベルは非常に困難である。私たちは、反発と引力相互作用の両方を使用して戦略を適用します。このシステムを特徴づけるために適用された実験的な技術が広く適用されます。...

水中での超分子ポリマーのサイズ、形状と安定性を制御する

この記事では、電子常磁性共鳴研究のためのサイト指向スピンラベリングと五量体配位子依存性チャネルの再構成の方法について説明します。このプロトコールは、あらゆる膜タンパク質に適合させることができます。ここで説明する再構成法は、定義された脂質システムにおける巨視的電流および単一チャネル電流のパッチクランプ測定にも使用できます。...

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

我々は、高速フィールドサイクル緩和測定を用いて、動的核偏光によって過偏光する13C濃縮化合物のスピン格子緩和時間の磁場依存性を測定するプロトコルを提示する。具体的には[1-13...

過偏光のスピン格子緩和磁場依存性の測定[1-13C]ピルビン酸

ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを...

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

ここでは、溶液中のタンパク質-糖鎖相互作用の特性評価を目的とした一連のNMR実験の取得、処理、および分析を詳述したプロトコールを紹介します。最も一般的なリガンドベースおよびタンパク質ベースの方法論が概説されており、構造糖鎖生物学および分子認識研究の分野に貢献していることは間違いありません。...

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

核磁気共鳴(NMR)分光法は、構造タンパク質のダイナミクスを残留物特異的な方法で特徴付けることができます。私たちは、ピコ秒からナノ秒の時間スケールに敏感なNMR 15N R1 およびR2...

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR...

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

ここでは、新しい蛍光染色ポリアクリルアミドゲルの総蛋白質の検出の技術をまとめた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルを利用して Ag+を検出する銀イオン固有蛍光ターンオン...

蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損

学ぶ常磁性緩和増強NMR分光法による天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価。原子分解能で動的状態を同定し、弱い相互作用を定量化する手法です。

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

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