ナノ粒子追跡解析における細胞外小胞の研究のための最小限の情報を満たす再現性の向上2018ガイドライン

このプロトコルは、NanoSight LM10の初心者オペレータ向けに開発されました。ステップバイステップの指示に従うことで、正確で再現性のある結果を得ることができます。この手法は、ユーザーのスキル レベルに関係なく、複数の試用期間にわたって一貫した結果を保証するのに役立ちます。

ナノ粒子の特性評価、特に定量化は、細胞外小胞研究分野で引き続き課題となっています。このプロトコルは、懸濁液中のナノ粒子の一貫したサイズおよび濃度分析を可能にする。レーザーモジュールのガラス表面を良質のレンズクリーナーとレンズペーパーでクリーニングすることから始めます。

モジュールを組み立てる前に、Oリングシールがフローセルカバーの溝に正しく取り付けられていることを確認してください。次に、フローセルカバーをレーザーモジュールの上に置き、電気接点が正しい向きになっていることを確認します。次に、4本のバネ式つまみネジをフローセルプレートに通し、個別に締め付けることなくレーザーモジュールのネジを噛み合わせます。

フローセルカバーに均一な圧力をかけながら、蝶ネジをぴったりと収まるまで交互の斜めに均一に締め付けます。スリップロックアダプター付きのツベルクリン注射器2本を1ミリリットルのDPBSで3回流します。ジリンジを残りのポートに挿入する前に、第1のツベルクリンシリンジからプランジャーを取り外して廃棄し、空隙化した希釈剤またはサンプルリザーバとして機能させる。

次に、2番目のシリンジに1ミリリットルのDPBSを充填し、フローセルカバーの入口ポートに取り付けます。DPBSがレーザーモジュールにゆっくりと注入されるときに、チャンバーから空気がパージされるように、出口シリンジポートを高くしてレーザーモジュールを傾けたままにします。残りのDPBSをレーザーモジュールから流し、1ミリリットルの空気を入口ポートに注入します。

フラッシングを 2 回繰り返します。最後のフラッシュの後、レーザーモジュールをできるだけ完全に空にし、フォーカスと位置決めのためにモジュールをロードします。ソフトウェアを開きます。

左上隅のボックスの [キャプチャ] タブで、[カメラの開始] をクリックします。5 分後にカメラが自動的にシャットダウンする場合は、[カメラの開始] をクリックして再起動します。同じタブで、カメラレベルを14〜16に調整してレーザーラインを明るくし、粒子の識別とフォーカスを簡素化します。

ヘッドピースの左側にある上部スライダを内外に動かして、カメラからアイピースに画像をそらします。視野で、拇印と中心と呼ばれる密度の高い領域を見つけ、拇印を垂直方向に焦点を合わせます。視野内でレーザーラインを中央に配置し、上部のスライダーを動かして、コンピュータ画面で観察されたようにカメラに光をそらします。

コンピュータ画面上の画像は、顕微鏡接眼レンズ内のビューからの鏡像である。フォーカスノブで画面上の個々の移動粒子の画像をシャープにするためにフォーカスを調整します。サンプルをロードするには、すすぎた1ミリリットルのツベルクリンシリンジにサンプル1ミリリットルを引き出し、シリンジをフローセルカバーの入口ポートに取り付けます。

出口ポートに取り付けられた開いたシリンジに液体が見えるまでプランジャーを進め続けます。レーザーモジュールから空気をパージできるように、モジュールを傾ける必要があります。カメラビューで、レーザーラインの右側にフォーカスを移動して、均一な数のパーティクルの領域に移動します。

垂直方向を調整して、ライトの水平バンドを中央に配置し、最大数のパーティクルが表示されるまで焦点を合わせ直します。フォーカスの位置を、後続のすべての対策で一貫して維持することを確認します。カメラ ビューの右上で暗い情報記号が断続的にオン/オフに点滅するようにカメラ レベルを調整します。

ナノ粒子追跡解析 (NTA) の場合は、再生時間を 30 秒または 60 秒に設定し、ビデオ数を 5 に設定します。既存のベース ファイル名を変更するには、新しいファイル名で生成されたデータの新しいストレージ サイトのタブをクリックします。次に、目標温度ボックスにチェックを入れて希望の温度を入力し、[スクリプトの作成]をクリックして標準測定値を再利用します。

サンプルが読み込まれ、実験を実行する準備ができたら、[スクリプトの作成と実行] をクリックします。レポート詳細設定ポップアップ画面で、オペレータ、サンプル、希釈剤に関する必要な情報をフィールドに入力します。必要なフィールドがすべて入力されたら、「設定OK」をクリックしてスクリプトを開始します。

各ビデオキャプチャの前に、プランジャーを手動で進めるためのプロンプトを探します。約0.05ミリリットルのサンプルをレーザーチャンバーに注入する。パーティクルが静止したら、[OK]をクリックします。5番目のビデオキャプチャが完了すると、プロセスボックスとともに設定確認ボックスが表示されます。

フレームがビデオ画面の下部から手動で進められるので、画面上に粒子を作る青い十字の数を書き留め、サンプルの処理のための検出しきい値を設定します。完了通知が表示される前に、結果のヒストグラムでビデオが自動的に処理されるのを待ってから、[OK]をクリックします。エクスポート設定ボックスが表示されたら、[エクスポート] をクリックして結果を保存します。現在の実験に一覧表示されている 5 つのキャプチャ ビデオをすべて強調表示します。

次に、[選択したファイルを処理]をクリックし、プロセスボックスに設定確認ボックスが点滅して検出しきい値を変更するのを待ってから、検出しきい値を目的のレベルに調整し、[設定]に移動して[OK]をクリックします。ビデオは結果のヒストグラムで自動的に処理され、完了のダイアログボックス通知が表示されます。クリック OK.In 代表的な分析、ナノトラッキング分析の結果、またはNTA、リポソームサンプルおよび代表的なDPBS希釈剤の結果が示されている。濾過されたサンプルは、平均粒子径が108ナノメートルであり、1ミリリットル当たり10〜8番目の粒子の7.4倍の濃度を有していた。

対照的に、濾過されていないサンプルは、平均粒子径が159ナノメートルであり、1ミリリットル当たり10〜8番目の粒子の7.6倍の濃度を有していた。組み合わせたカメラレベルでは、検出閾値が2から5に増加するにつれて、平均粒径およびモード粒径は、濾過されたサンプルの粒径の有意な減少を示した。複合カメラレベルでの粒子濃度は、検出閾値が増加するにつれて減少した。

濾過されたサンプルと濾過されていないサンプルとの間の粒子濃度に有意差は検出されなかった。複合検出閾値では、カメラレベルが12から14に増加するにつれて、濾過されたサンプルの平均およびモード粒径の減少が認められた。複合検出閾値での粒子濃度は、カメラレベルが12から14に増加するにつれて増加しました。

濾過されたサンプルと濾過されていないサンプルの間に有意差は観察されなかった。手順 4.1 ~ 5.2 は、正しい表示領域を見つけるために重要です。複数の試運転で一貫した結果を達成するには、この反復可能なスキルが必要です。

動的光散乱は、主に粒子の表面電荷であるゼータ電位を得るために、ナノ粒子追跡分析のコンパニオンとしてよく使用されます。ナノ粒子分析において、NTAは細胞外小胞研究に有用な粒子を定量する非常に貴重な方法であり続けている。