Name: マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶマウス肝臓正弦波内皮細胞の単離法。コラゲナーゼ灌流とCD146磁気ビーズ選択により90%以上の純度と94%以上の生存率を達成し、肝機能と細胞間相互作用の研究に有用です。

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この研究は、NIHの国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(1RO1DK122948からSHI)とNIHシルヴィオ・O・コンテ消化器疾患研究コアセンターP30助成金機構(DK084567)の支援を受けた。また、日本学術振興会(JSPS)在外特別研究員によるKFへの支援も行いました。また、グレゴリー・J・ゴアズ博士とスティーブン・ブロンク博士がコラゲナーゼ灌流装置を独自に設計し、最適化したことにも感謝の意を表します。

動物のプロトコルは、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたとおりに実施されました。8週齢のC57BL/6J雄マウスをジャクソン研究所から購入した。マウスを、食事への自由なアクセスを有する温度制御された12:12-h明暗サイクル施設に飼育した。
コラーゲンコート培養皿またはプレートの調製
<ol><li>50 mL の 0.02 mol/L 酢酸を作るには、49.4 mL のH2O に 0.6 mL の氷酢酸を加えます。</li>
	<li>0.02 mol/L酢酸で50 μg/mLのコラーゲンタイプIを作る。希釈はロットの濃度に依存する。</li>
	<li>10cm培養皿を3mLのコラーゲン溶液でコーティングする。室温(RT)で1時間インキュベートする。 注:培養に別の皿またはプレートを使用する場合、コーティング溶液の量は培養面積に基づいて調整する必要があり、通常は6〜10μg/cm2を使用してください。</li>
	<li>コーティングされた表面から余分な流体を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。皿を風乾させます。</li>
	<li>コラーゲン溶液が滅菌されていない場合は、滅菌組織培養フード内で紫外線(UV)光に10分間曝露してコラーゲンコーティング皿を滅菌する。</li>
</ol>2. 設備のセットアップ
<ol><li>図1Bに示すように加熱加湿再循環灌流装置を設置する。</li>
	<li>灌流システムを10%漂白剤で5分間すすぎ、続いて滅菌水をさらに10分間すすいでください。</li>
	<li>コラゲナーゼ溶液を灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。</li>
	<li>コラゲナーゼ溶液を灌流系を通して注入し( 図1Bに示すように)、37°Cで予温する。 速度制御ダイヤルに示されているように、ポンプ速度を速度1に設定します(40mL/分に等しい)。</li>
	<li>この速度は、手順全体を通して同じに保ちます。LSEC単離の日中に閉回路で実行されるコラゲナーゼ溶液を再利用する。 注:ポンプ速度は、LSECの生物学的状態を乱す可能性のある機械的圧力を避けるために1に固定されています。</li>
</ol>3. 外科的処置
<ol><li>マウスの重量を量ります。</li>
	<li>90mg/kg体重のケタミンと10mg/kg体重のキシラジンを腹腔内に注射する(IP)。</li>
	<li>マウスが痛みを伴う刺激に反応しなくなったら、 図1Bに示すように、マウスを手術面に固定します。</li>
	<li>マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで〜5cmの長さの切開を行う。</li>
	<li>次に、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。</li>
	<li>静脈内(IV)カテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。</li>
	<li>通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。</li>
	<li>露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科的縫合糸を置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。</li>
	<li>肝門脈(PV)の周囲に別の5-0外科用縫合糸を、肝PVから分岐する脾静脈のすぐ上に置く。縫合糸に緩いヒッチを結びます。</li>
	<li>PV縫合糸を張力として用いて、20G IVカテーテルを1cm下の肝PVに挿入し、左右の肝PVに分岐させる。</li>
	<li>カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保管してください。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。</li>
	<li>静脈内(IV)ボトル内のバッファーA(表1)の一部を手術領域の上に置いた状態で、IVラインを使用してカテーテルに取り付けます。システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流してください。</li>
	<li>腎臓の下の下大静脈の周りに縫合糸を結びます。これにより、肝臓はレトロな灌流が可能になります。</li>
	<li>動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。 注:この手順は、肝臓の鬱血を避けるために迅速に実行する必要があります。</li>
	<li>IVカテーテルをPV縫合糸で固定する。</li>
	<li>灌流したら、胃、腸、脾臓、および肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。</li>
	<li>横隔膜と主要血管を胸腔から切り取ります。動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。</li>
	<li>IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。 注:ステップ3.16-3.18は5分以内に行う必要があるため、肝臓はバッファAで長時間灌流されません。</li>
	<li>カプセルが斑点になり、濁って見えるまで肝臓に灌流させます(10〜15分以上、期間はコラゲナーゼのロットによって異なります)。</li>
	<li>肝臓が灌流されている間、剖検バッグに処分する前に動物が死亡していることを確認してください。</li>
	<li>消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20mLの無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む10cmのシャーレに入れます。</li>
	<li>いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。</li>
	<li>肝臓懸濁液を70μmのセルストレーナーを通して50mLの円錐管に濾過する。</li>
	<li>細胞懸濁液を50 x g でRTで2分間遠心分離し、非実質肝細胞を含む上清を回収する。 注:肝細胞はペレット中に沈殿し、これは先に記載したようにグラジエント遠心分離を用いてさらに精製することができる15。</li>
</ol>4. 非実質肝細胞の分離とLSECの精製
メモ:CD146+ LSECは、製造元の指示に従って、免疫磁気ビーズを使用して精製してください。
<ol><li>上清を300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。</li>
	<li>細胞ペレットを収集し、1mLの単離緩衝液に再懸濁し(表1)、製造業者の指示に従って自動セルカウンタを用いて細胞数を決定する。</li>
	<li>細胞懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。</li>
	<li>ペレットを全細胞107個あたり90μLの単離緩衝液で再懸濁する 。</li>
	<li>全細胞107 個あたり10μLのCD146磁気ビーズを加える。よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。</li>
	<li>細胞を洗浄するには、107 細胞あたり1〜2mLの単離緩衝液を添加し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。</li>
	<li>最大109 個の細胞を500 μLの単離バッファーに再懸濁する(表1)。 メモ: セル番号が大きい場合は、それに応じてバッファボリュームをスケールアップします。</li>
	<li>分離カラムを準備し、3mLの単離緩衝液ですすいでください。</li>
	<li>細胞懸濁液を、70 μm の予備分離フィルターで積み重ねたカラムに塗布します。</li>
	<li>カラムを3 mLの単離バッファーで3回洗浄する。 注: カラムを洗浄するときは、カラムリザーバが空になったらすぐに分離バッファーを追加する必要があります。</li>
	<li>カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。カラム上に5 mLの単離バッファーをピペットする。</li>
	<li>標識された細胞を磁気ビーズで回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。</li>
	<li>300 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離機を遠心分離し、顕微鏡検査と下流分析の準備ができています。</li>
</ol>5. LSECのイムノフェノタイピングとフローサイトメトリーによる純度評価
<ol><li>製造元の指示に従って、自動セルカウンタを使用して、分離されたLSECのセル番号を決定します。</li>
	<li>細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。</li>
	<li>1 x106 細胞/チューブを取り、90 μLの染色バッファーで再懸濁する(表1)。</li>
	<li>マウスFcRブロック10 μL/チューブと生存率色素1 μLを加え、4°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>染色バッファーで1:50に希釈したCD45、CD146、およびスタビリン-2抗体の組み合わせで細胞を染色する。4°Cで20分間インキュベートする。</li>
	<li>細胞を5mLの染色緩衝液で洗浄し、300 x g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引する。</li>
	<li>細胞を300 μLの染色バッファーで再懸濁し、フローサイトメーターに通します。</li>
</ol>6. LSECの文化と検討
<ol><li>6ウェルプレートに1 x106 細胞/ウェルの種子を、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%内皮細胞増殖サプリメント、および1%プリモシン溶液からなる内皮細胞増殖培地で培養する。</li>
	<li>単離されたLSECを光学顕微鏡で調べる。10倍の倍率で明視野画像を取得します。</li>
</ol>7. 走査型電子顕微鏡によるLSECの形態とフェネストレー検査
<ol><li>細胞培養インサート(孔径3μm)をコラーゲン溶液で予めコーティングする。</li>
	<li>単離したLSEC(120,000細胞)を内皮細胞増殖培地と共にインサート上で37°C加湿雰囲気下で24ウェルプレート中で培養した。細胞が落ち着いて2時間接着するのを許します。</li>
	<li>細胞固定のために、37°Cで予温したトランプの固定液を等価量の細胞培養培地に加える。</li>
	<li>10分間インキュベートした後、50%希釈されたトランプの固定液を希釈されていないトランプの固定液と交換する。</li>
	<li>トランプ固定液で細胞を2時間固定し、次いで1%四酸化オスミウム中で1時間インキュベートする。</li>
	<li>試料脱水、臨界点乾燥装置での乾燥、実装、スパッタ塗布、走査型電子顕微鏡を用いた検査などを進める。</li>
</ol>

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<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li>
</ol>

すべての著者は、開示する矛盾はありません。

現在の原稿では、2段階のコラゲナーゼ灌流とそれに続く磁気活性化細胞選別(MACS)からなるマウス肝臓からのLSEC単離のためのプロトコルを記述している。このプロトコルは、以下の3つのステップからなる:(1)PVをカルシウムを含まない緩衝液で灌流し、続いてコラゲナーゼ含有緩衝液を用いて肝細胞分散を達成する。(2)低速遠心分離による肝細胞の排除;(3)抗CD146磁気ビーズを用いた非実質細胞(NPC)からのLSECのMACSベースのポジティブセレクション。全体の手順は3時間以内に完了することができます。さらに、すべての消耗品を含むこの手順のコストは、マウスあたり約150米ドルであり、このLSEC分離方法が全体的に効率的で費用対効果が高いことを示唆しています。原発性マウス肝細胞の単離にもステップ(1)と(2)を用いているが、これは現在の原稿の範囲を超えている。
門脈カニューレおよび肝臓灌流にはいくつかの重要なステップがある:(i)カテーテル位置決め:カテーテル先端は、通常肝臓の丘陵部で同定される成体マウスのPV分岐部に対して3mm以上遠位に配置するべきである。PV内のカテーテル先端の深い...

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、肝正弦波壁に並び、肝臓1の中で最も豊富な非実質細胞である。LSECは、フェネストラの存在および古典的な基底膜または隔膜の欠如によって、体内の他の場所にある他の毛細血管内皮細胞と区別される2,3。したがって、LSECは、脂質およびリポタンパク質を含む様々な循環巨大分子を排除する透過性およびエンドサイトーシス能力を高める独特の表現型および構造特性を有する。LSECは、星状細胞や免疫細胞などの実質細胞と非実質細胞のクロストークにおいて極めて重要な役割を果たしています。LSECは、星状細胞およびクッパー細胞を静止状態に保つことによって肝臓恒常性を維持する上で重要である4。LSECsは、循環白血球の接着および経内皮遊走を媒介することによって肝免疫細胞集団の組成を調節する5,6。虚血再灌流傷害(IRI)8、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)9、および肝細胞癌(HCC)を含む急性および慢性肝障害7の間、LSECは毛細血管化として知られる表現型変化を受け、防御および基底膜10の形成を特徴とする。LSECにおけるこれらの表現型変化は、LSECの機能不全および血栓形成促進性、炎症促進性、および線維形成促進性の獲得と関連している。
マウス肝臓からLSECを単離するためのいくつかの方法が開発されている11。いくつかの技術は、非実質細胞および実質細胞を分離し、続いて密度勾配遠心分離を行い、LSECを非実質画分から精製することに依存する。この方法の限界は、LSECs単離の最終ステップにおける汚染性マクロファージの存在であり、これは単離されたLSECs12の純度に影響を与え得る。このプロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓およびCD146+磁気ビーズ陽性の非実質細胞のコラゲナーゼ灌流に基づいている。この方法を用いて単離されたLSECは、高純度で保存された形態および生存率を示す。これらのLSECは、透過性および接着アッセイを含む機能研究、ならびに関心のある経路の下流研究に最適です。さらに、臨床研究と発見科学の両方で大きなデータセットを生成することへの関心の高まりに伴い、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または他の状態の健康な肝臓と病気の両方の肝臓から分離されたこれらの高品質のLSECを個別にプールまたは使用することができ、マルチオミクスデータ生成と健康と病気の比較が可能になります13,14.さらに、単離されたLSECは、LSECにおける活性化されたシグナル伝達経路および異なる有害刺激下で、および様々な治療介入に応答して他の肝細胞との細胞間通信を解読するために、オルガノイドのような2次元および3次元のインビトロモデルを開発するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>2.0インチ20G静脈内(IV)カテーテル</td><td>テルモ、ソマセット、ニュージャージー</td>州、米国<td>SR-OX2051CA</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash;カスタマイズされた中央</td><td></td><td></td>に穴のある3インチのパフューオントレイ<td>; 自社製</td></tr><tr><td>405/520 生存率染料</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-110-205</td><td></td></tr><tr><td>4インチ規則的な湾曲したドレッシング鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FS16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>5-0 パーマハンドシルク縫合</td>糸 <td>Ethicon, Raritan, NJ, USA</td><td>A182H</td><td></td></tr><tr><td>Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluor&アチルデ;488</td><td>MBL International, Woburn, MA, USA</td><td>D317-A48</td><td></td></tr><tr><td>BSA stock</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-118-407</td><td></td></tr><tr><td>CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-110-803</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td>ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬, マウス</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach,ドイツ</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo ソフトウェア、バージョン 10.6</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硬化ファインはさみ</td><td>F.S.T, カリフォルニア州フォスターシティ、米国</td><td>14091-11</td><td></td></tr><tr><td>加熱 (37 >C)および10psiの速度で酸素注入を装備した加湿再循環灌流装置。</td><td></td><td></td><td>カスタマイズ; 自社製</td></tr><tr><td>日立 S 4700 走査型電子顕微鏡</td><td>Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA</td><td>SEM096</td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS pre-separation filters (70 &mu;m)</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACS rinsing buffer</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer (70 &mu;m)</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MACSQunt flow cytometer</td><td>Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Culture Insert</td><td>Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>PITP01250</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom cell counter</td><td>Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA</td><td>セロメーター Auto T4 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare,シカゴ、イリノイ州、米国</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>FST、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>非常に小さな湾曲したドレッシング鉗子</td><td>FST、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国</td><td>11063-07</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

肝正弦波内皮細胞(LSEC)は、循環と肝実質との界面に位置する特殊な内皮細胞である。LSECは、フェネストラの存在および基底膜の欠如を特徴とする明確な形態を有する。LSECは、代謝調節不全、炎症、線維症、血管新生、および発癌を含む肝臓における多くの病理学的障害において不可欠な役割を果たす。しかし、LSECの単離と特性評価についてはほとんど発表されていない。ここで、このプロトコルは、健常および非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)マウスの両方からのLSECの単離について論じる。プロトコールは、LSECを精製するためのマウス肝臓および非実質細胞の磁気ビーズ陽性選択のコラゲナーゼ灌流に基づいている。本研究では、フローサイトメトリーによる特異的マーカーを用いてLSECを特徴付け、走査型電子顕微鏡により特徴的な表現型の特徴を同定する。このプロトコールに従って単離されたLSECは、接着および透過性アッセイを含む機能的研究、ならびに関心のある特定の経路についての下流研究に使用することができる。さらに、これらのLSECは個別にプールまたは使用することができ、RNA-seqバルクまたは単一細胞、プロテオミクスまたはホスホプロテオミクス、およびシーケンシング(ATAC-seq)を使用したトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイなどのマルチオミクスデータ生成を可能にします。このプロトコルは、健康および疾患におけるLSECと他の肝細胞とのコミュニケーションを研究する研究者にとって有用であり、急性および慢性肝障害の病原性メカニズムにおけるLSECの役割の詳細な理解を可能にする。

実験回路図と装置のセットアップ: このプロトコールでは、マウス肝臓を閉鎖灌流回路を用いて消化し、次いで、非実質細胞および肝細胞を、50 x g で2分間の低速遠心分離によって分離した。一次LSECは、非実質画分からのCD146磁気ビーズ選択を用いて単離した。実験模式を 図1Aに示す。カニューレをPVを通して配置し、下大静脈を縛り付けて、肝臓を通るコラゲナーゼの一方向灌流を確実にした(図1B)。社内灌流チャンバには、37〜40°Cの暖かく加湿された装置空気を確保するために、加熱加湿システムが装備されています。灌流コラゲナーゼは閉鎖系を循環し、単離日中に2〜3匹のマウスに再利用して、単離をより費用対効果の高いものにすることができます。
フローサイトメトリーによる単離LSECの純度と表面マーカーの評価: 単離されたLSECの純度は、十分に特徴付けられた特異的LSEC表面マー...

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

ここでは、初代マウス肝正弦波細胞単離またはLSECs単離のプロトコールを実証する。このプロトコルは、非実質細胞精製およびCD146磁気ビーズ選択のための肝臓コラゲナーゼ灌流および低速超遠心分離からなる。当社のLSEC単離法は非常に効率的で、健康なマウスや病気のマウス肝臓に適用できます。絶縁されたLSECは高純度を示し、構造と機能を維持します。このプロトコルを使用して単離されたLSECは、機能的および分子的研究およびマルチオミクスデータ生成に最適です。このプロトコルは、肝臓における細胞間通信を研究するのに役立ちます。10センチメートルの培養皿に3ミリリットルのコラーゲン溶液をコーティングすることから始めます。その後、ディッシュを室温で1時間インキュベートする。1時間後、コーティングされた表面から余分な流体を除去する。PBSで食器を3回洗い、風乾させます。加熱加湿再循環灌流装置を設置する。10%の漂白剤を使用して灌流システムを5分間すすぎます。その後、滅菌水でさらに10分間システムを再すすいでください。コラゲナーゼ溶液で灌流する前に、できるだけすすぎ液を排出してください。コラゲナーゼ溶液を灌流システムを通して注入し、摂氏37度に予温する。速度制御ダイヤルでポンプ速度を速度 1 に設定します。手順全体を通して同じ速度を維持します。手順のためにマウスの重量を量ります。その後、手術面に固定します。マウス腹部に70%エタノールを噴霧する。外科用はさみを使用して、腹部の下部から剣状突起まで約5センチメートルの切開を行う。その後、腹部の両側に小さな虹彩はさみを使用して2つの横方向の切り傷を作り、腹部の器官を完全に露出させます。IVカテーテルのシースを動物の背中の下に置き、腹部を持ち上げて水平にします。通常の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、腸と胃を動物の左側に静かに引き離します。次に、露出した左腎臓のすぐ下の下大静脈(IVC)の下に5-0の外科用縫合糸を置きます。縫合糸に緩いヒッチを結びます。次に、肝門脈の周りに別の5-0外科的縫合糸を置く。縫合糸を肝門脈の脾静脈分岐点のすぐ上に置きます。もう一度、縫合糸に緩いヒッチを結びます。門脈縫合糸を張力として用い、20ゲージIVカテーテルを1cm下の肝門脈に挿入し、左右の肝門脈に分岐させる。次に、カテーテルを静脈上にスライドさせますが、分岐領域の下に保ちます。血液が滴り落ち始めるまでカテーテルを下るのを許します。IVカテーテルを門脈縫合糸で固定する。IVラインを使用して、バッファAの入ったIVボトルをカテーテルに取り付けます。次に、システムへの空気の侵入を避けながら、この溶液で肝臓を洗い流します。腎臓の下のIVCの周りに縫合糸を結びます。その後、動物が出血できるように縫合糸の下のIVCをカットします。灌流したら、胃、腸、脾臓、肝臓に付着した他の内臓を切り取ります。次に、横隔膜および主要血管を胸腔から切り取ります。動物から肝臓を取り出し、それを灌流トレイの上に置きます。IVラインを慎重に取り外し、再循環チャンバ内のコラゲナーゼ溶液をフックアップする。カプセルがモデル化され、濁って見えるまで肝臓に灌流させます。通常、これには 10 ~ 15 分かかります。消化したら、肝臓をチャンバーから取り出し、約20ミリリットルの無血清DMEMを入れた10センチメートルのペトリ皿の上に置きます。いくつかのピペットチップで肝臓を優しく拾い上げ、胆道の木を捨てます。その後、肝臓懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに濾過する。細胞懸濁液を室温で2分間50倍Gで遠心分離する。次いで、非実質肝細胞を含む上清を回収する。上清を300倍Gで4°Cで5分間遠心分離する。その後、細胞ペレットを収集し、1ミリリットルの単離緩衝液に再懸濁する。製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用してセル番号を確認します。次に、細胞懸濁液を遠心分離する。上清を完全に吸引し、1000万細胞あたり90マイクロリットルの単離緩衝液でペレットを再懸濁する。総細胞1,000万個あたり10マイクロリットルのCD146マイクロビーズを加える。それをよく混ぜて、摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞を洗浄するには、1,000万個の細胞あたり1〜2ミリリットルの単離緩衝液を加える。溶液を300倍Gで10分間遠心分離する。その後、上清を完全に吸引し、500マイクロリットルの単離緩衝液に最大10億個の細胞を再懸濁する。次に、3ミリリットルの分離バッファーでリンスして分離カラムを作製する。細胞懸濁液を、70マイクロメートルの予備分離フィルターを積み重ねたカラムに塗布します。カラムを 3 ミリリットルの分離バッファーで 3 回洗浄します。その後、分離器からカラムを取り出し、15ミリリットルの遠沈管の上に置きます。5ミリリットルの単離バッファーをカラム上にピペットする。磁気ビーズ標識細胞を回収するには、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで細胞を洗い流します。最後に、細胞を300回Gで4°Cで5分間遠心分離する。単離されたLSECの純度および表面マーカーをフローサイトメトリーで評価した。ゲートLSECおよびシングルレットのデータ分析およびゲーティング戦略は、前方散乱および側方散乱データに基づいています。単離されたLSECを、生存率色素およびCD45、CD146およびスタビリン−2抗体の組み合わせで染色した。生存可能なLSECをCD45陰性集団上でゲーティングし、CD146およびスタビリン−2発現について分析した。このデータから、単離されたLSECは94%を超える生存率および90%を超える純度を有することが確認された。単離された細胞のLSEC特異的表現型を、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いてさらに確認した。単離されたLSECsを完全増殖培地中で6時間培養し、光学顕微鏡によって調べた。SEM画像の白い矢印は、LSECの特徴的な形態学的特徴であるLSECフェネストラを示している。肝臓組織の完全な灌流を確実にするための重要なステップは、適切なカテーテルテープの位置決め、カテーテルへの空気の導入の回避、およびコラゲナーゼ消化の最適なタイミングです。当社のプロトコールを用いて取得した高品質のLSECは、LSEC機能の分子機構の同定を容易にし、肝臓、健康および疾患における細胞間通信におけるそれらの役割の理解を改善する。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

脳微小血管内皮細胞(BMEC)は、血液と中枢神経系(CNS)を分離する高度に制御された障壁を形成する特定の接合タンパク質によって相互接続されています。このプロトコルで述べられているように、初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離により、BBBの詳細なin...

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

血管内皮細胞は、多くの重要な心血管疾患において重要な役割を果たしています。この記事では、特別な機器を使用せずにマウス大動脈から内皮細胞を分離および増殖する簡単な方法について説明します。私たちのプロトコルは、内皮細胞の生理病理学におけるメカニズムを特定する効果的な手段を提供します。...

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

同じドナーからヒト肝細胞と非実質肝細胞を分離する技術が説明されています。さまざまな肝細胞タイプが、機能的な肝臓モデルと組織工学の基礎を構築します。この新しい方法は、肝細胞を高収量で生存率で単離することを目的としています。...

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

このプロトコルは、イメージングや分子生物学的実験を行う目的でマウスの冠状細胞を分離する方法を共有するために準備されています。...

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV...

精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

ここでは、健康で機能的なプライマリ...

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。...

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。...

マウス膵臓内皮細胞の単離

学ぶマウス肝臓正弦波内皮細胞の単離法。コラゲナーゼ灌流とCD146磁気ビーズ選択により90%以上の純度と94%以上の生存率を達成し、肝機能と細胞間相互作用の研究に有用です。

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

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