Name: 生分解性インプラント材料をインビトロで研究するための直接的および間接的な培養方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学ぶ 生分解性インプラント材料のインビトロ細胞適合性評価法。直接培養法、直接暴露培養法、暴露培養法の3手法を用いて、骨髄由来間葉系幹細胞との相互作用を解析し、生体材料の安全性と有効性を向上させる。

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著者らは、米国国立科学財団(NSF CBET賞1512764およびNSF PIRE 1545852)、国立衛生研究所(NIH NIDCR 1R03DE028631)、カリフォルニア大学(UC)リージェンツ教員開発フェローシップ、および研究種子助成金委員会(Huinan Liu)、およびUC-Riverside Dissertation Research Grant(Jiajia Lin)からの財政的支援に感謝している。著者らは、UC-RiversideのAdvanced Microscopy and Microanalysis(CFAMM)がSEM/EDSを使用し、Perry Cheung博士がXRD装置を使用したことを高く評価している。著者らはまた、部分的な編集のためにThanh Vy NguyenとQueenie Xuを高く評価している。著者はまた、ビデオのナレーションを録音してくれたシンディ・リーに感謝したいと思います。この記事で表明された意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしも国立科学財団または国立衛生研究所の見解を反映するものではありません。

著者には利益相反はありません。

異なる細胞培養法を用いて、インビボでの適用の様々な態様について、目的とする生体材料のインビトロ細胞適合性を評価することができる。この記事では、生分解性インプラント材料が人体内で使用されるさまざまなin vivoシナリオを模倣するために、3つのインビトロ培養方法、すなわち、直接培養、直接暴露培養、および暴露培養を実証する。直接培養法は、主に、移植材料に直接付着し、周囲に新たに播種された細胞の挙動を評価するために使用される。直接暴露培養法は、インプラント材料が確立された細胞および組織と直接接触するin vivoシナリオを模倣する。曝露培養法は、インプラント材料からの分解生成物および局所微小環境の変化が、インプラント材料と直接接触していない確立された細胞および組織にどのように影響するかを示すために使用することができる。
直接培養では、直接および間接接触条件下で新たに播種された細胞が評価される。直接暴露培養において、樹立された細胞は、直接および間接接触条件の両方で評価することができる。曝露培養では、間...

何十年もの間、生分解性材料は、整形外科1,2、歯科3,4、頭蓋顎顔面5などの生物医学的用途で広く研究され、使用されてきました。永久的なインプラントや材料とは異なり、生分解性金属、セラミックス、ポリマー、およびそれらの複合材料は、生理学的環境における異なる化学反応を介して時間の経過とともに体内で徐々に分解する。例えば、マグネシウム(Mg)合金1,6,7や亜鉛(Zn)合金8,9などの生分解性金属は、骨固定装置用の有望な材料である。それらの生分解性は、骨治癒後にインプラントを除去するための二次手術の必要性を排除する可能性がある。リン酸カルシウムセメント(CPC)などの生分解性セラミックスは、経皮的脊柱後弯形成術における骨粗鬆症性椎体圧迫骨折の治療にエキサイティングな可能性を示しています10。CPCは、骨折した椎体に機械的サポートを提供し、骨折が治癒した後に徐々に劣化する。
いくつかの多糖類やポリエステルなどの生分解性ポリマーも、生物医学的用途のために広く探求されている。例えば、生分解性多糖類としてのキトサンハイドロゲルは、感染予防や皮膚組織の再生にその能力を発揮しています11。ポリ-L-乳酸(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、およびポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)は、組織工学用途のための2Dまたは3D多孔質足場を製造するための広く研究されているポリエステルである12,13,14。さらに、複合材料は、金属、セラミック、ポリマーの2つ以上の相を統合して、幅広い生物医学的用途に高度な機能を提供します15,16,17。例えば、PLGAおよびリン酸カルシウム複合体は、頭蓋骨欠損の修復などの用途のための生分解性足場を作製するために使用することができる18。これらの生分解性足場とインプラントは、細胞や組織の成長を支え、促進し、時間の経過とともに体内で徐々に分解する可能性があります。
補足表1に示すように、異なる生分解性材料は、様々な分解機構、生成物、および速度を有し得る。例えば、マグネシウム合金、例えば、Mg-2重量%Zn-0.5重量%Ca(ZC21)1、Mg-4重量%Zn-1重量%Sr(ZSr41)19、およびMg-9重量%Al-1重量%亜鉛(AZ91)20は、水と反応して分解し、それらの分解生成物は、主にMg2+イオン、OH-イオン、H2ガス、および鉱物堆積物を含む。生分解性金属の分解速度は、その異なる組成、形状、および分解環境によって異なります。例えば、Cipriano et al.19は、ZSr41ワイヤー(Ø1.1 × 15mm)が85%の質量を失い、同じ形状の純粋なMgワイヤーがラットの脛骨に47日間移植された後、40%の質量を失ったと報告した。ハイドロキシアパタイト(HA)やリン酸β三カルシウム(β-TCP)などの生分解性セラミック材料は、溶液駆動の細胞外液体溶解を介して分解するか、小さな粒子に分解し、細胞外液体溶解および細胞媒介再吸収プロセスの両方を介して分解することができる。これらのリン酸カルシウム系セラミックスの分解生成物には、Ca2+イオン、(PO4)3-イオン、OH-イオン、およびミネラル堆積物が含まれ得る21。リン酸カルシウムセラミックスの分解速度は、その結晶構造によって大きく影響される。例えば、Van Blitterswijk et al.22は、40体積%のマイクロポアを有するHAは質量を失わず、40体積%のマイクロポアを有するβ-TCPはウサギの脛骨に3ヶ月間移植された後、30±4%の質量を失ったと報告した。PLGA14,23などのポリマーは、水の存在下でのエステル結合の加水分解により分解する場合があり、分解生成物には、主に乳酸およびグリコール酸が含まれる。PLGA 50/50 では 1 か月、PLGA 95/5 では完全な劣化に達するまでに数か月かかる場合があります24。
細胞応答および細胞適合性試験は、生物医学的用途のためにこれらの生分解性インプラント材料を評価およびスクリーニングするために重要である。しかし、ISO 10993-5:2009「医療機器の生物学的評価-第5部インビトロ細胞毒性試験」などの国際標準化機構(ISO)の現在の規格は、当初、Ti合金やCr-Co合金などの非分解性生体材料の細胞毒性をin vitro25で評価するために設計されました。具体的には、ISO 10993-5:2009は、抽出物のインビトロ細胞毒性試験、直接接触試験、および間接接触試験のみをカバーしています。抽出物試験において、抽出物は、標準時間および温度条件のいずれかで血清および生理食塩水と共に培養培地などの抽出流体にサンプルを浸漬することによって調製される。次いで、回収した抽出物または希釈液を細胞培養物に添加して、細胞毒性を研究する。直接接触試験の場合、試料と細胞との直接接触は、確立された(接着された)細胞層上に試験試料を配置することによって達成される。間接接触試験では、血清および融解寒天を含む培養培地をピペットで固定し、樹立細胞を覆う。次いで、試料を、フィルターの有無にかかわらず、固化した寒天層上に置く。
ISO規格は、 インビトロで生分解性材料を評価するために適用された場合、いくつかの制限を示しています。非分解性材料とは異なり、生分解性材料の分解挙動は動的であり、異なる時間または様々な環境条件(例えば、温度、湿度、培地組成、および細胞型)で変化し得る。抽出物試験は、材料の分解産物の細胞毒性を評価するのみであり、サンプル分解の動的プロセスを反映していない。ISO規格の直接接触試験と間接接触試験は、確立された細胞とサンプル間の相互作用を特徴付けるだけです。さらに、間接接触試験では、材料および細胞は、 in vivo 環境を反映しず、生分解性材料の動的分解を捕捉しない異なる微小環境にある。
この記事の目的は、現在のISO規格に記載されている方法の上記の制限に対処するために、さまざまな生分解性インプラント材料の細胞適合性試験方法を紹介し、議論することです。本稿で紹介する手法は、インプラント材料の動的分解挙動と 、生体内における細胞-材料相互作用のさまざまな状況を考慮する。具体的には、この記事では、医療用インプラント用途の生分解性ポリマー、セラミック、金属、およびそれらの複合材料を含む様々な生分解性材料の直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの細胞適合性試験方法を提供する。
直接培養法では、培地に懸濁した細胞をサンプルに直接播種し、新たに播種した細胞とインプラントとの相互作用を評価します。直接暴露培養では、サンプルを樹立された細胞層に直接配置して、インプラントと体内の樹立宿主細胞との相互作用を模倣します。暴露培養では、サンプルをそれぞれのウェルインサートに入れ、次いで樹立細胞と共に培養ウェルに導入し、インプラントと直接接触しない場合のインプラント分解によって誘発される局所環境の変化に対する樹立細胞の応答を特徴付ける。直接培養法および直接暴露培養法では、同じ培養ウェル内の移植材料と接触する細胞を直接的または間接的に評価する。曝露培養は、同じ培養ウェル内で所定の距離内でインプラント材料と間接的に接触する細胞を特徴付ける。
この記事では、さまざまな生分解性材料の細胞適合性試験と、モデル細胞、つまり骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用について詳しく説明します。プロトコルには、細胞の採取、培養、播種、固定、染色、イメージング、および後培養材料および培地の分析が含まれ、これらはさまざまな生分解性インプラント材料および幅広い細胞タイプに適用されます。これらの方法は、 インビトロでの細胞応答および細胞適合性の点で、異なる生物医学的用途のための生分解性材料をスクリーニングするのに有用である。

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清学的ピペット</td><td>VWR</td><td>490019-704</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル組織培養処理プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ (ポリプロピレン)</td> <td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>18 G ニードル</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25&frac12;G ニードル</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2- フェニルインドール二乳酸 (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ (ポリプロピレン)</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m ナイロンストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-105-0135</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ 小麦粉 488-ファロイジン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A12379</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>LABCONCO</td><td>クラスII、タイプA2</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td>ローター F-35-6-30、遠心分離機5430</td><td></td></tr><tr><td>クリアフューズドクォーツラウンドディッシュ</td><td>AdValue Technology</td><td>FQ-4085</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>SANYO</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 冷凍庫容器</td><td>温度</td><td></td><td>低下を調節するように設計された</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>EDX分析ソフトウェア</td><td>Oxford Instruments</td><td>AztecSynergy</td><td></td></tr><tr><td>エネルギー分散型X線分光法(EDX)</td><td>FEI</td><td>50mm2 X-Max50 SDD</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td></td><td></td>SH30910</tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>VWR</td><td>100496-496</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>誘導結合プラズマ 発光分析 (ICP-OES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 8000</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>VWR</td><td>VistaVision</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>VWR</td><td>モデル SB70P</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>VWR</td><td>97062-730</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡(SEM)</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM 450</td><td></td></tr>外科<tr><td>用ブレード</td><td>VWR</td><td>76353-728</td><td></td></tr>組織<tr><td>培養フラスコVWR</td><td></td><td>T-75、MSPP-90076</td><td></td></tr>トラン<tr><td>ズウェルインサートコー</td><td>ニング</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-エチレンジアミン四酢酸溶液(トリプシン-EDTA)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>X線回折装置(XRD)</td><td>PANalytical</td><td>Empyrean Series 2</td><td></td></tr></tbody></table>

生分解性インプラント材料をインビトロで研究するための直接的および間接的な培養方法

Direct and Indirect Culture Methods for Studying Biodegradable Implant Materials In Vitro

過去数十年にわたり、生分解性材料は、整形外科、歯科、および頭蓋顎顔面インプラントなどの生物医学的用途のために広く探求されてきた。生物医学的用途のために生分解性材料をスクリーニングするためには、これらの材料を in vitro 細胞応答、細胞適合性、および細胞毒性の観点から評価する必要がある。国際標準化機構(ISO)規格は、生体材料の評価に広く利用されています。しかし、ほとんどのISO規格はもともと非分解性材料の細胞毒性を評価するために設立されたため、生分解性材料のスクリーニングには限られた価値しか提供されていません。 
本稿では、生分解性ポリマー、セラミックス、金属、およびそれらの複合体を含む生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を異なる細胞種で評価するための、直接培養法、直接暴露培養法、および暴露培養法の3つの異なる培養方法を紹介し、議論する。研究は、培養方法が生分解性材料に対する細胞応答に影響を与えることを示しており、その動的分解は界面および局所環境において時空間的な違いを誘発する。具体的には、直接培養法は、インプラントに直接播種された細胞の応答を明らかにする。直接暴露培養法は、インプラントと接触する確立された宿主細胞の応答を解明する。暴露培養法は、インプラントに直接接触していないが、インプラントの劣化による局所環境の変化の影響を受けている確立された宿主細胞を評価する。 
この記事では、生分解性インプラント材料のインビトロ細胞適合性および骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)との相互作用を研究するためのこれら3つの培養方法の例を提供する。また、収穫、継代、培養、種子、固定、染色、細胞の特性評価、培養後の培地および材料の分析方法についても説明します。この記事で説明するインビトロ方法は、インビボ環境のさまざまなシナリオを模倣し、さまざまな生物医学的用途に対するさまざまな生体材料のインビトロ細胞適合性試験の適用性と関連性を広げます。

図4は、異なる培養方法を用いた直接的および間接的な接触条件下でのBMSCsの代表的な蛍光画像を示す。図4A、Bは、ZC21マグネシウム合金1との同じ24時間直接培養後の直接および間接接触条件下でのBMSCsを示す。ZC21合金は、97.5重量%のマグネシウム、2重量%の亜鉛、および0.5重量%のカルシウムからなる。ZC21合金サンプルと直接接触しないセルは、サンプルと直接接触するセルよりも広がりがよくなります。図4C、Dに示すように、直接および間接接触条件下での細胞はすべて、Fe3+イオンによって架橋されたヒアルロン酸(HyA)ヒドロゲルによる24時間直接暴露後に正常な形態を示す。しかし、間接接触条件下の細胞数は、直接接触条件下の細胞数よりも少ない33。別の研究では、24時間の...

生分解性インプラント材料の in vitro 細胞適合性を評価するための直接培養、直接暴露培養、および暴露培養の3つの方法を紹介します。これらのインビ トロ法は 、異なる インビボ 細胞-インプラント相互作用を模倣し、様々な生分解性材料の研究に適用することができる。

Over the past several decades, biodegradable materials have been extensively explored for biomedical applications such as orthopedic, dental, and ...

インビトロで生分解性インプラント材料を研究するための直接的および間接的な培養方法。過去数十年にわたり、生分解性材料は、整形外科、歯科、頭蓋顎顔面インプラントなどの生物医学的用途のために広く探求されてきました。生物医学的用途のために生分解性材料をスクリーニングするためには、これらの材料をin vitro細胞応答、細胞適合性、および細胞毒性の観点から評価することが必要である。国際標準化機構の規格は、生体材料の評価に広く利用されています。しかし、ほとんどのISO規格はもともと非分解性材料のスタイル毒性を評価するために設立されたため、生分解性材料のスクリーニングには限られた価値しか提供されていません。このビデオでは、生分解性インプラント材料のin vitro細胞適合性を評価するための直接培養法、直接暴露培養法、および暴露培養法の3つの異なる培養方法を紹介し、議論する。具体的には、直接培養法は、新たに播種された細胞とインプラントとの間の相互作用を評価する。直接暴露培養は、体内の確立された細胞とインプラントとの間の相互作用を模倣する。暴露培養は、樹立された細胞とインプラントが互いに直接接触していないが、材料が分解する同じ環境にある場合の相互作用を特徴付ける。このビデオでは、生分解性インプラント材料のin vitro細胞適合性および骨髄由来間葉系幹細胞との相互作用を研究するために、これら3つの培養方法を使用する例を提供します。このビデオで説明されているin vitro方法は、in vivo環境のさまざまなシナリオを模倣し、さまざまな生物医学的用途に対するさまざまな材料のin vitro細胞適合性試験の適用性と関連性を広げます。私たちは、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用コミュニティによって承認されたプロトコルに従って、細胞および組織の採取を行います。細胞培養調製物。このビデオで説明されている 3 つの培養方法は、一般に、接着しているさまざまな細胞タイプに適用できます。ここでは、ラット離乳から採取したBMSCsを、ラット離乳期から骨髄由来間葉系幹細胞を採取する細胞培養調製の一例として紹介する。この図の模式図は、ラット離乳からBMSCを収穫するステップを示す。皮膚および筋肉および結合組織を除去して、安楽死させたラットから大腿骨を解剖する。大腿骨を細胞培養培地を含む15mL円錐管に入れる。細胞抽出を行う時点まで円錐形のチューブを氷の上に置く。骨を生物学的安全キャビネット内のペトリ皿に移す。手術用刃を用いて骨の端部を切断し、25 1/2ゲージ針の付いたシリンジを用いて骨髄腔を細胞培養培地で洗浄することにより、骨髄を50mL円錐管に流す。70マイクロメートルのフィルターを用いて細胞懸濁液をろ過し、続いて重力126倍で5分間遠心分離を行い、細胞ペレットを取り出し、上清培地を吸引し、10mLの新鮮な培地を補充する。穏やかにピペットを上下させ、10mL血清学的ピペットを用いて細胞を再懸濁する。懸濁液をT-75フラスコの内側の底に直接ピペットで留め、媒体を加えて体積を最大25ミリリットルにします。細胞を37°Cである標準的な滅菌細胞培養環境、5%二酸化炭素および95%空気で加湿雰囲気中の培養器で培養する。3〜7日後、古い培地を吸引し、新鮮な培地を補充することによって、非接着細胞を洗い流す。細胞の継代、凍結、または実験での使用の準備が整うまで、細胞を培養し、新鮮な培地で細胞を供給し続けます。サンプル調製および滅菌。細胞培養の前にすべてのサンプルを滅菌または消毒する。異なるサンプルタイプの滅菌または消毒方法は、材料の異なる特性に応じて異なる。一般に、in vitro研究のために生分解性金属を消毒するために紫外線を使用する。細胞培養方法。この図の模式図は、直接培養法の各工程を示している。このビデオでは、BMSCsを12穴組織培養処理プレートのウェルの内部に配置したマグネシウム由来プレート上で培養し、その培養方法を例示する。90%コンフルエントフラスコを使用して、血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞濃度を決定した。新鮮な培地を使用して細胞懸濁液を、インビトロでの細胞研究に必要な所定の細胞濃度に希釈する。サンプルを12穴組織培養プレートの中央に配置する。培養プレートを2 mLのPBSおよび2 mLのDMEMで順次すすぎ、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3mLを目的のサンプル上の各ウェルに加える。細胞をインキュベーター内で標準的な細胞培養条件下で24時間培養する。図中の模式図は、直接暴露培養の工程を示す。異なる細胞タイプおよび意図された用途のための実験計画に基づいて、必要な濃度の細胞を有する細胞懸濁液を調製する。培養プレートを2 mLのPBSおよび2 mLのDMEMで順次すすぎ、滅菌条件下で浸透圧を較正した。希釈した細胞懸濁液3 mLを各ウェルに加える。標準的な細胞培養条件下で加湿インキュベーター内で細胞を24時間、または細胞が50%〜80%コンフルエントに達するまで培養する。24時間リンス後、ウェルプレート内の細胞をPBSでピペットを用いて、浮遊死細胞を除去した。消毒または滅菌したサンプルを接着細胞に直接置きます。3 mL の新鮮な培地を各ウェルに加えます。細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。この図の模式図は、露光培養法の工程を示す。細胞調製のための初期ステップは、直接暴露培養と同じである。その後、膜孔径が0.4マイクロメートルのウェルインサートにサンプルを入れ、サンプルを含むウェルインサートを細胞のある各ウェルに入れます。細胞を標準的な細胞培養条件下でさらに24時間培養する。細胞の培養後特性評価。直接培養および直接暴露培養の場合、ウェルプレートおよびサンプルの両方に付着した細胞を固定、染色、画像化および分析する。暴露培養のために、ウェルプレートに接着した細胞を分析する。各ウェルから後培養培地を対応する15mL円錐管に集め、さらなる分析を行う。さらなる分析のために培養後のすべてのサンプルを収集します。サンプルおよびウェルプレートの両方に付着した細胞をPBSを用いて3回すすぎます。1mLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルプレートに加える。蓋をウェルプレートに戻し、PFAを20分間反応させます。20分後、PFAを吸引し、廃棄物ボトルに分配する。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、PFAを除去し、廃棄物を廃棄物ボトルに移す。製造元の指示に従って染色剤の作業ストックを準備します。希釈したAlexa Fluor 488ファロイジン染色剤200〜400マイクロリットルを各ウェルに加え、ウェルプレート上の細胞およびサンプルを覆う。ウェルプレートをアルミホイルで包んで光暴露を防ぎ、Alexa Fluor 488ファロイジンが室温で20分間反応できるようにします。Alexa Fluor 488 ファロイジン染色剤を集め、対応する廃棄物ボトルに分配します。PBSを使用して壁板を3回すすぎ、余分なAlexa Fluor 488ファロイジンを除去し、使用済みのPBSを対応する廃棄物ボトルに分配します。200~400マイクロリットルの希釈DAPIを各ウェルに加え、ウェル内およびサンプル上の細胞を覆う。ウェルプレートをアルミ箔で包み、DAPIを室温で5分間反応させます。PBSを使用してウェルプレートを3回すすぎ、使用済みPBSを対応する廃液ボトルに分注します。染色後、蛍光顕微鏡を用いて細胞を画像化する。可能な限り、蛍光画像に加えて細胞の位相差画像を撮影してください。生分解性サンプル上の細胞をできるだけ早く、または染色直後に画像化して、サンプルの連続的な分解によって引き起こされる可能性のある変化を回避または低減する。直接培養と直接露光培養の場合、2種類の細胞を画像化して評価する。1つは、サンプル上の細胞がサンプルと直接接触し、2つは、図に示すようにサンプルと直接接触するサンプルを囲むウェルプレート上に細胞が接着した。ここに示すように、暴露培養では、細胞の蛍光画像を撮影するときに画像ガイドを使用して、サンプルの動的分解勾配に応答して細胞の応答が異なるかどうかを判断します。中心から3.5mm離れた内輪内の領域と、中心から7mm離れた外輪の領域にある細胞を別々に画像化して解析します。各サンプルについて、および培養プレート内にいる間、細胞が予め定義された距離でサンプルと間接的に接触または間接的に接触している各関心領域から少なくとも5つの画像をランダムに撮影する。ステップ4.3から得られた全ての細胞画像から、画像解析のために細胞拡散面積及びアスペクト比を測定して細胞形態を定量化する。各画像領域のセル数を数えます。直接・間接接触条件下での細胞接着密度を単位面積当たりの細胞数として算出する。培地およびサンプルの後培養分析。自己固定の前に、ポストカルチャーメディアを収集します。収集直後の各ウェルにおける後培養培地のpH値を、予め較正されたpHメーターを用いて測定する。pH測定の前工程に続いて、イオン濃度の最適な測定のために望ましい希釈係数を使用して培地を収集して希釈します。ICP-OESと略称される誘導結合プラズマ発光分析装置を用いて培養後培地中の目的のイオンの濃度を測定する。インビトロ細胞研究の後、生分解性サンプルは、寸法、質量、表面形態、微細構造、および組成において変化し得る。サンプルの培養後分析は、サンプルの分解メカニズムを理解するのに役立ちます。細胞培養後、サンプルの写真を撮って、サンプルの寸法、色、形態、およびその他の目に見える特性の可能な変化を示します。培養後サンプルを乾燥または脱水し、サンプルの質量、寸法、および体積を測定して、質量、寸法、および体積の変化を定量化します。走査型電子顕微鏡を使用して、サンプルの微細構造と形態を特徴付けます。エネルギー分散型X線分光法とX線屈折を使用して、サンプル上の分解生成物の組成と相を特徴付けます。FTIR または ATR を使用して、サンプル表面の化学結合を検出します。代表的な結果。ここで、図は、異なる培養方法を用いた直接的および間接的な接触条件下での骨髄由来幹細胞の代表的な蛍光画像を示す。この図は、細胞接着密度を定量化するためのデータ例を示す。図Aに示すように、24時間の直接暴露培養において、ZC21と直接接触するBMSCは、他のどの群よりも有意に大きい細胞接着密度を有する。図Bに示すように、直接暴露培養の間接接触条件において、BMSC接着密度はマグネシウム群よりもZC21群に対して有意に高い。しかしながら、対照群のみのT64および細胞と比較して有意差を示さない。ここで、図Aは、直接暴露培養及び直接培養後の後培養培地のpH値を示す。直接暴露培養の場合、培地のpH値はすべてのサンプルで8.3~8.4の範囲です。直接培養では、培地のpH値はグループ全体で7.9〜8の範囲です。図Bは、後培養培地中のマグネシウムイオン濃度を示す。直接暴露培養および直接培養の両方において、ZC21およびマグネシウム群におけるそれらのマグネシウムイオン濃度は、他の対照群よりも有意に高い。この図は、3日間の暴露培養後のZSr41および純マグネシウムについてのXRDパターンを示す。マグネシウム、酸化亜鉛、ハイドロキシアパタイトなどの異なる組成の結晶相が観察された。ここで、図Aは、酸化マグネシウム被覆マグネシウムの表面元素組成のSEM画像およびEDXマップのオーバーレイ、ならびにBMSCsによる直接培養の24時間後のマグネシウム基板およびガラスの対照を示す。図Bは、試料表面の定量的表面元素組成を示し、細胞培養中に形成された異なる沈着を示す。結論。このビデオでは、さまざまな実験計画と意図されたアプリケーションに基づいて、生分解性インプラント材料の細胞適合性を評価するための3つの異なるin vitro方法を紹介しました。物質と様々な種類の細胞との相互作用を、直接培養法、直接暴露培養法、暴露培養法によって調べることができました。このビデオでは、さまざまな医療用インプラント用途の細胞挙動に対する生分解性材料とその分解産物の影響を研究するための重要なin vitro方法を紹介しました。

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本プロトコルは、 in vitro インプラント表面の除染および粗さ研究に使用でき、臨床上の意思決定に貢献できるインク染色に基づく実験モデルを示しています。...

インプラント周囲炎治療における機械的方法がインプラント表面の除染と粗さに及ぼす影響

本試験中の パイロット試験では...

インプラント表面に対する洗浄能力と異なる除染方法の影響を評価するパイロット in vitro 試験

我々は、非対称受容体柄の基板上にセルローリング軌跡を観察し、分析するためのプロトコルについて説明します。結果のデータは、ラベルフリー細胞分離と解析のための受容体柄の基板のエンジニアリングするのに便利です。...

非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強

学ぶ 生分解性インプラント材料のインビトロ細胞適合性評価法。直接培養法、直接暴露培養法、暴露培養法の3手法を用いて、骨髄由来間葉系幹細胞との相互作用を解析し、生体材料の安全性と有効性を向上させる。

生分解性インプラント材料をインビトロで研究するための直接的および間接的な培養方法

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