Name: その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶマウス胚脳スライス培養における軸索成長と成長円錐ダイナミクスの可視化手法。電気穿孔によるDNA導入と高解像度イメージングで、神経発生の動的メカニズムを生理学的環境で解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

手順を撮影してくれたマリア・エウジェニア・ベルニスに感謝します。また、原稿を読んで議論してくれたエミリー・バーンサイド、エミリー・ハンドリー、ソーベン・ピエトララ、マックス・シェルスキー、シーナ・スターンにも感謝します。私たちは、優れた技術アシスタントであるジェシカ・ゴニエ、ブランカ・ランデル、アン・トゥアン・ファムに感謝しています。我々は、DZNEの光学顕微鏡施設及び動物施設の貴重な支援を認識する。この研究は、Deutsche Forschungsgesellschaft(DFG)、International Foundation for Research in Paraplegia(IRP)、Wings for Life(F.B)の支援を受けました。F.B.は、エクセレンスクラスターImmunoSensation2、SFBs1089および1158のメンバーであり、Roger De Spoelberch Prizeを受賞しています。

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

成長円錐体が周囲の環境をどのように感知し、反応して軸索の伸長とガイダンスを同時に調整するかは、まだ議論の余地があります3,18。2D基板における先駆的な研究は、軸索形成、外生、およびナビゲーション中に成長円錐ダイナミクスを駆動する力を生成する基本的な分子メカニズムを垣間見ることができた2,10,11,12,19。より最近では、3D行列の研究は、3次元が成長円錐の挙動、ひいては軸索の成長にどれほどの影響を与えるかを明らかにした8,9。それにもかかわらず、インビボでの成長円錐ダイナミクスを指示する複雑なメカニズムは、まだ徹底的に検討されていない。
IUEまたはEUE脳からの有機型スライス培養物の調製は広く利用されており、十分に文書化されている。これは、科学者が生きている脳組織におけるニューロンの発達と行動についての洞察を得ることを可能にする黄金の標準となっています20,21。実際、この技術は、その場で特定の分子プロセスおよび形態学的事象を視覚化するために、様々な高解像度イメージング技術と組み合わせて首尾よく利用されている。このような研究には、軸索形成および伸長19、22、皮質ニューロン遊走19、22、23、24、セントロソームダイナミクス25、26、微小管ダイナミクス27、ならびにシナプス前部およびシナプス前部28、29の機能的ダイナミクスが含まれる。
このプロトコルは、実験的神経生物学におけるギャップに対処し、 その場で皮質ニューロンを発達させる成長円錐ダイナミクス、 ex vivo 急性脳スライス培養物、および得られたデータを分析するためのツールを視覚化する。
急性脳スライス培養物は、(1)いくつかの実践では、生成が容易であるため、このプロトコルを確立するために利用された。(2)準生理学的環境に埋め込まれた成長円錐を研究するためのアクセス可能なシステムを提示するが、高解像度の生細胞イメージングを可能にするのに十分透明である。(3)無数のトランスジェニックマウス系統と共にその使用のために拡張することができる;(4)IUEまたはEUEのいずれかと組み合わせることで、蛍光レポーターおよび細胞骨格プローブとともに、機能レジームの喪失/獲得下でのインビボでの成長円錐および軸索の性能を評価するための分子ツールを提供する事実上無限の可能性を提供する。
この方法論は、EUEとIUEの両方の文脈で記述された。依然として信頼性の高い方法であるが、EUEは、送達方法としてIUEを用いて得られたものと比較して、無秩序なRGネットワークを示す脳スライスの発生率の増加をもたらした(図4C)。RGアレイにおける外乱は、ニューロン遊走および軸索伸長のパターン30、31に強く影響する。これらは、特定の時点で分析用の軸索を見つける場所と、それらがナビゲートしている環境の種類を予測する重要なパラメータです。著しく破壊されたRGネットワークを有する脳スライスは、典型的には、皮質ニューロン層別形成の障害を有する。これは、順番に、混沌とした軌道を持つ軸索を生成します。したがって、RGネットワークの構造的完全性を制御することを強くお勧めします。興味深いことに、構造的完全性の低さは、胚性脳の年齢の増加と相関する。実際、若いE12.5-E13.5胚においてそのような効果は典型的には観察されなかった19。
現在のプロトコルは徹底的かつ単純です。それにもかかわらず、最適な結果を得るために特別な注意と注意を払わなければならないいくつかの重要なステップがあります。これらはプロトコルに明示的に記載されており、(1)エレクトロポレーションで使用されるDNAの量を調整してまばらな標識を得ることを含む。(2)脳の抽出中の損傷を避ける;(3)脳ケーシング中のアガロースの温度を制御する工程;(4)所定の年齢の脳に対するアガロースの理想的な割合をトラブルシューティングする。(5)蛍光色素の選択、その経験は以下の通りである。プロトコルの最適化中に、生細胞in situイメージングにおける いくつかの蛍光色素の性能が試験されました。LifeActタグ付きプラスミドおよびLynタグ付きプラスミドの調製のための単量体GFP変異体EGFPおよびNeonGreenを、このプロトコールについて選択した(図5A、B)。さらに、RFPバリアントmScarletがテストされ、このセットアップに非常に適していることが判明しました(データは示されていません)。多量体tRFP(二量体)およびZsGreen(四量体)(図5C および 補足ビデオ1、 右)も試験した。これらの高速フォールディング超高輝度蛍光色素分子は、DNA送達後に迅速な蛍光シグナル生成が必要な場合に推奨されます。
スライス培養を使用する際の一般的な方法は、異なる脳からのスライスを利用して、制御および実験条件をテストすることです。これは、望ましくない変動性の固有の原因を表します。ここでは、同定のために隣接するニューロンおよびレポーターの発現の独立した改変を可能にする発現系を用いた。なお、このデモンストレーション(図5C)では、いずれの蛍光色素分子を発現するニューロン間に差異はなかった。しかしながら、一例として、Cre感受性遺伝子を保有するトランスジェニックマウス系統と組み合わせたこのようなプラスミドミックスは、野生型として残ったtRFP(Dre感受性)ニューロンで標識するであろう。対照的に、ZsGreen(またCre感受性)は、組換えニューロンにラベルを付けます。したがって、2つの異なる遺伝子型の成長円錐形、そしておそらく表現型も、同じ脳スライス内で同時に並べて研究することができた。
分析のための軸索および成長円錐の局在化は重要な考慮事項である。皮質ニューロンは、心室帯(VZ)から皮質板(CP)に向かって放射状に移動しながら分極する。このプロセスの間、ニューロンは、軸索となる先行プロセス(将来の樹状突起)および後続プロセスを形成し、最終的に中間ゾーン(IZ)における先駆的な軸索を結合し、軸索管32を確立する。したがって、軸索成長円錐体を捕捉するために、CPから出る軸索および軸索束に既に関連する早期に生成された軸索を含む、IZ内の軸索線維についてイメージングが行われた。または最終的には、IZを横切ってその下に延びる繊維で(図7)。
このプロトコルは、有機型スライス内のニューロンの超解像イメージングを実行することを実現可能にする。歴史的に、光散乱は厚い試料をイメージングする際に直面する大きな問題でした。過去20年間、光学技術の広範な進歩により、厚い試料のイメージングが可能になりました。ここでは、成長円錐などの小さな構造をよりよく視覚化するために、長い作動距離対物レンズを使用しました。必然的に、このプロトコルは、逆行性アクチン流または微小管ダイナミクスなどのより詳細な事象を捕捉しない。長い作動距離対物レンズは、より低い開口数(NA)を必要とし、厚いスライスからの情報を保持します。しかし、このプロトコルを作動距離の短縮を目的として使用するために適合させることも可能であった。これには、構造的完全性を維持するために、スライスをガラス底の皿にスムーズに移す必要がありました。しかし、この方法を使用すると、ガス交換の喪失により、生存期間が短くなり、〜15時間が短縮されました(データは示されていません)。2D カルチャとは異なり、3D の成長円錐はより大きな体積を占め、Z 軸での動き - アーチファクト補正を必要とします。詳細な事象を画像化する能力を高めるためには、現代の共焦点技術を利用する必要があります。したがって、高感度共焦点顕微鏡33で利用可能なz−Galvoのような高速走査zスタックモータを使用することが推奨される。
注目すべきは、このプロトコルには 3 つの主な制限があります。第1に、任意のプラスミドの発現レベル/発現細胞数を インビボで制御することはしばしば困難である。これにより、同じプラスミド濃度を維持した場合でも、すべてのスライス間にばらつきが生じます。したがって、使用する発現ベクターにおける調節エレメントの選択は、注意して予め決められていなければならない。第二に、メンブレンインサートを用いて詳細な事象を画像化することは、現在実現不可能である。この第2の制限は、前の段落で提案された方法論的更新によって克服することができる。最後に、成長円錐は非常に感光性があり、すぐに光漂白される可能性があります。したがって、成長円錐の頻繁な画像化は、レーザー走査顕微鏡を用いてわずか5分間、成長円錐を崩壊させることが多い。これに関して、生成された装置のライトシート顕微鏡における新たな進歩は、脳スライス34の長期画像化に適合させることができる。
このようなプロトコルは、新しい研究の道を開き、成長円錐が複雑な in vivo 環境を読み取って反応するために必要なものをよりよく理解できるようにし、さらに重要なことに、この洗練された相互作用のメカニズムを解明することが想定されています。

ニューロンは、神経系における基本的な計算単位を表す高度に分極した細胞である。それらは、入力部位と出力部位の区画化に依存する情報(樹状突起および軸索、それぞれ1)を受信し、放出する。開発中、軸索は、信じられないほど複雑な環境をナビゲートしながら、目的地に到達しながら拡張します。軸索ナビゲーションは、発達中の軸索の先端に位置する感覚構造である成長円錐によって導かれる。成長円錐は、環境の手がかりを検出し、それらをその細胞骨格の動的空間再編成に変換する役割を担っています2,3。結果として生じる形態力学的反応は、成長円錐に誘発合図から伸縮するように指示し、特定の軸索操作をもたらす。
軸索伸長および成長円錐ダイナミクスの現在の理解は、2次元(2D)基質2、4、5、6、7にわたる軸索成長を評価する研究に由来する。これらの先駆的な研究は、成長円錐と成長基質との間の洗練された相互作用を同定し、接着性および剛性などの基質特性に依存する顕著な違いを明らかにした8,9。これらの洞察に導かれて、細胞外環境手がかりが軸索成長を指示する仮説が立てられ、成長円錐細胞骨格がこの成長を実行する2、10、11、12。注目すべきことに、ニューロンは、非接着性基質(例えば、ポリリジン、ポリオルニチン)中の軸索を伸長させることができる13。さらに、基質剛性は、細胞接着複合体8とは無関係に軸索増殖速度に影響を与え得る。したがって、2D基板における成長円錐ダイナミクスを研究するだけでは、軸索成長円錐と生理学的に関連する3次元(3D)環境(生体内に見られるような)との相互作用から生じる力のバランスを正確にモデル化することはできません。
2Dアッセイの限界を克服するために、軸索成長および成長円錐ダイナミクスが3D行列8、9において研究されてきた。これらのマトリックスは、より生理学的文脈をもたらすが、軸索成長の細胞内因性メカニズムを研究することを可能にする。これは、様々な条件および薬理学的処置における単一細胞様式での成長円錐検査を可能にする9。このような3D環境において、軸索は明確な細胞骨格ダイナミクスを示し、2D培養ニューロンで観察されたものよりも速く成長した9。これらの優雅な研究は、成長円錐体細胞骨格の再編成、ひいてはその挙動に対する余分な次元の影響を実証した。
ネイティブ様のニューロンの発達および軸索成長をサポートする上で、2D表面上の3Dマトリックスによって提示される明らかな利点にもかかわらず、それらは、中枢神経系(CNS)組織で観察されるダイナミクスの複雑さを反映することができない単純化された合成足場のままである。ここで、 ex utero および in utero electroporationによるレポータープラスミドの送達を、脳器官型スライス培養および in situ ライブ超解像画像と組み合わせて、生理学的文脈における成長円錐ダイナミクスを分析する。この方法論は、 生体内 環境の3次元性とその物理化学的組成の複雑さを経験しながら、発達中の軸索の視覚化を可能にする。最後に、一般的にライセンスされ、一般に入手可能なソフトウェアを使用して軸索の成長および成長円錐のダイナミクスを測定するためのユーザーフレンドリーな手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>ヤギ抗マウス</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>ヤギ抗マウス抗ビ</td></tr><tr><td>メンチン抗体</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>モノクローナルマウス、クローンLN-6、腹水</td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml;hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ unevirsal electrode puller</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Electric razor</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2 Speed model</td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2.5% (重量/vol)</td></tr><tr><td>エッペンドルフ マイクロローダー ピペットチップ</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>色素含有量 &ge; 85 %</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封入剤</td><td>sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>14025092 カルシウム、マグネシウム、フェノールなし 赤い</td></tr><tr><td>馬の血清</td><td>パンバイオテクノロジー</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>イマリス 9.7.2</td><td>ビットプレーン</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ビルバック</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>アイソトニック生理食塩水解決策</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S vibratome</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 with Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット収納ジャー</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp;16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab Millicell Cell Culture Insert</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp;mm、親水性PTFE、0.4&nbsp;&マイクロ;m</td></tr><tr><td>モリア穴あきスプーンファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>モリアスプーン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベースルミディアム、マイナスフェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>ニューロパン-2サプリメント</td><td>パンバイオテクノロジー</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>アブ</td><td>カム ab138478</td><td></td></tr><tr><td>はさみファインサイエンスツール付きオルセンヘガーニードル</td><td></td><td>ホルダー12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>S 133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>API 175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>プラチナTweezertrodes</td><td>ハーバード装置</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxiキット</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr>反射<tr><td>創閉鎖クリップワールド</td><td>精密機器</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattexミニトリオ</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>矩形波エレクトロポレーションシステムECM830</td><td>ハーバード装置</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>ブラウン・アスキナ</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>滅菌潤滑剤眼軟膏</td><td>バイエル・バイタル・</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>滅菌手術用手袋</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ロス</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>スープラミド 5-0 外科用シルク縫合糸</td><td>B. ブラウン</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>バンナス スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-スライド 8 ウェルガラスボトム</td><td>同上</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

ニューロンの発達の間、軸索は皮質環境をナビゲートして最終目的地に到達し、シナプス接続を確立する。成長円錐 - 軸索を発達させる遠位先端に位置する感覚構造 - は、このプロセスを実行します。成長円錐の構造とダイナミクスを研究することは、軸索の発達と、神経回路を形成することを可能にする周囲の中枢神経系(CNS)との相互作用を理解するために不可欠です。これは、基礎研究や前臨床の文脈で損傷後に軸索を神経回路に再統合する方法を考案する際に不可欠です。これまでのところ、成長円錐ダイナミクスの一般的な理解は、主に2次元(2D)で培養されたニューロンの研究に基づいています。成長円錐構造ダイナミクスと刺激に対する応答に関する現在の知識にとって間違いなく基本的なものですが、2D研究は、無傷のCNS組織においてニューロン成長円錐体が遭遇する生理学的3次元(3D)環境を誤って表現しています。より最近では、コラーゲンゲルがこれらの制限のいくつかを克服するために使用され、3Dでのニューロン発達の調査が可能になりました。しかし、合成2Dおよび3D環境の両方に、CNS組織内のシグナル伝達手がかりがなく、発達中の軸索の伸長および経路探索を指示する。このプロトコルは、発達中の軸索が生理学的に関連する物理的および化学的手がかりに遭遇する有機型脳スライスを使用して軸索および成長円錐を研究するための方法を提供する。このプロトコルは、子宮 内 エレクトロポレーションと 子宮外 エレクトロポレーションを組み合わせて蛍光レポーターをまばらに配信し、超解像顕微鏡とともに、軸索と成長円錐のダイナミクスを その場で視覚化するための方法論的パイプラインを提示します。さらに、長期および生細胞画像化データの分析の詳細なツールキット記述が含まれる。

記載された方法ワークフローで得られた代表的な結果が示されている。E15.5マウスが本実証で使用されたが、このプロトコルはE11からE17後期までの事実上すべての胚年齢に容易に適応可能である。このプロトコルでは、子宮外エレクトロポレーション(EUE;図2A、2C−I)または子宮エレクトロポレーション(IUE;図2B、C、および2J−Q)を用いて、プラスミドを側脳室を裏打ちする前駆ニューロンに送達した。これらの前駆細胞は、将来の皮質突出ニューロン(CPN)の源である15,16。膜標的(Lyn)-mNeonGreen(図1A)またはLifeAct増強(E)GFP(図1B)のいずれかのまばらなニューロン特異的発現を駆動するようにプラスミドミックスを調製し、それぞれ成長円錐における全体的な挙動およびアクチンダイナミクスを評価した。さらに、個々のニューロンをturbo(t)-RFPまたはzoanthus sp.(Zs)緑色蛍光タンパク質(ZsGreen)のいずれかで標識することを目的としたプラスミドミックス(図1C)が含まれていた。これにより、独立した隣接ニューロンからの成長円錐行動のモニタリングが容易になる。
エレクトロポレーションされた胚からの脳解剖は、天然の脳構造を維持しながら、高品質のスライスを得るために慎重に行う必要がある重要なステップです。解剖器具およびビブラトームを予め調製し、注意深くエタノール滅菌した(図3A、B)。次に、エレクトロポレーションされた胚の頭部を注意深く解剖し、脳を抽出した。ここでは、E15(図3C-F)およびE12.5(図3G-J)でEUEを受けた胚からの脳の代表的な解剖が示されている。脳を直ちにアガロースマトリックスに包み、スライスし、インキュベーションのために底ガラス皿内のPTFE膜インサート上に置かれる(図3K-M)。
脳スライスの健康状態は、信頼性の高い結果を保証するための制御にとって重要なポイントです。汚染がないか目視検査を毎日実施した。さらに、培養が確定したら、脳スライスを固定し、免疫組織化学に供する。ここで、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて、グリア組織を明らかにするために、全体的な細胞組織およびビメンチン染色を制御した。特に、放射状グリア(RG)足場。典型的には、IUEまたはEUEのいずれかに由来する首尾よく培養された脳スライスは、DAPIおよび頂端配向した孔鞘接触プロセス17 を有するRGの幾分組織化された配列によって明らかにされるように、正常な細胞分布を示す(それぞれ図4A、B)。時折、培養脳スライスにおけるRG足場の顕著な障害が、特にEUEエレクトロポレーションに由来するものにおいて観察される(図4C)。極端に組織化されていないRG足場を有する脳スライスは、ニューロン遊走障害および軸索成長の欠陥を示す(図示せず)。したがって、RG足場を制御することは、信頼性の高い脳スライスから得られたデータをソートするための簡単な後培養方法です。
Lyn-mNeonGreen発現プラスミドミックスを用いたIUEまたはEUEのいずれかに由来する脳スライスは、同様のまばらなニューロン標識をもたらす。Lyn-mNeonGreen とその成長円錐の動的挙動を表す代表的なピラミッド型 CPN を例として示します (図 5A および 補足ビデオ 1、 左上)。さらに、ニューロンをアクチンプローブを発現するプラスミドを用いて標識し、その場で軸索成長円錐のアクチン動態を分析し た (図5B および 補足ビデオ1、 左下)。また、デュアルCre/Dre蛍光色素発現プラスミド設計を用いて in situ 実験も実施しました(図1C および 補足ビデオ1、右)。このプラスミド中のtRFPまたはZsGreen蛍光色素は、隣接するニューロンにおいて、それぞれDreまたはCreリコンビナーゼのいずれかによって特異的かつ個別に活性化され得る(図5C)。この実験ラインアップは、隣接する修飾ニューロン(任意の所与の機能の損失または利得)を有する対照ニューロンからの成長円錐の並列分析を可能にする。これにより、異なるスライスを使用して制御条件と実験条件をテストすることから生じる変動性が回避されます。
記録した動画から生成されたキモグラフを解析し、そこから経時的な突出活動や成長長などの動的成長パラメータを容易に求めることができます(図6A)。なお、タイムラプスの時間分解能を簡易に調整することで、軸索伸長速度を2時間測定できる(図6A)。さらに、成長円錐体積の経時変化(一般的な成長円錐動的活動の尺度)は、この場合、ライセンスされたソフトウェアを使用して容易に得ることができる(図6Bおよび図6E,F)。これは、アクチントレッドミリングの速度および成長円錐探索活動中のフィロポディア/ラメリポディアのバランスを評価するために使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> 図1:プロトコルで使用されたプラスミドのスキーム。 (A)pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen.(B) p-Tub-α-1-LifeAct-GFP.(C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA.プラスミド成分と蛍光色素分子の起源に関する関連情報は、ボックスに記載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> 図2:E15.5マウスの子宮外および子宮内エレクトロポレーションのワークフロー。 (A)子宮外エレクトロポレーションのための手術ステーションの設置。(B)子宮内エレクトロポレーションのための手術ステーションの設置。(c)麻酔マウスの腹腔の外側に引き出された子宮角。(D)子宮袋からの胚の抽出。(e)対角線切開を介した完全な脊髄切断による胚屠殺;斬首は避けられたことに注意してください。(F)胚をホルダーに入れ、DNA/ファストグリーン混合液を左側脳室に注入する。(G,H)胚の頭を白金ピンセット電極の間に配置して、陰極(赤い矢印)を皮質の上に60°の角度で配置します。(I)胚の腕(黒い矢印)をホルダーの外側に配置し、処置中の胚の滑りを防止する。(J)子宮袋内の胚を回転させて頭を露出させる。(K、L)子宮壁を通って胚の側脳室へのDNA/ファストグリーン混合物の注入。(M)胚の頭を白金ピンセット電極の間に、陰極(赤い矢印)を皮質の上に60°の角度で配置する。(n)ランニングロック縫合糸を介して筋肉切開を縫合する。(O)中断された縫合糸を介して皮膚切開を縫合する。(P)外科的創傷クリップを用いた創傷の固定及びベタジンを用いた消毒。(Q)遠赤外線加温光による回収ケージへのマウスの配置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> 図3:E15.5およびE12.5脳の抽出および器官型スライス培養手順。 (A)脳の抽出手順に使用するツール。(B)有機型培養ステーションの設置(C-F)E15.5脳の抽出。(ジージー)E12.5脳の抽出。点線は切開部の位置を強調する。赤い矢印は鉗子で引っ張る方向を指しています。(K)3%の低融点アガロースを含む3cm皿に脳を埋め込み、脳の下に1〜2mmのアガロース間隔の隙間を残す。(L)150μmの脳スライスの収集。(m)パラフィン膜を用いた35mmディッシュに固定化したPTFE膜インサート上の脳スライスの配置(青矢印)。赤い星印は、ビブラートーム(L)からの所与の脳スライス収集およびPTFE膜へのその移動(M)を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> 図4:健康な有機型スライスにおける保存された放射状グリア細胞構造。 IUE(A)およびEUE(B,C)に続くRGアレイ(ビメンチン;緑色)および全細胞組織(DAPI;マゼンタ)を明らかにするE17.5脳スライスの共焦点画像。RGアレイの強い外乱は、EUE(C)によって時折生じる可能性があることに注意してください。倍率は、メイン図の赤い点線のフレーム(スケールバー、10 μm)に対応しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> 図5:急性有機型スライスにおける成長円錐ダイナミクスの in situ 可視化。 (A,B)ニューロンおよびそれらに対応する成長円錐形は、それぞれLyn-mNeonGreenおよびLifeAct-GFPで標識されている。リン-mNeonGreen発現ニューロンの成長円錐を示す赤い星。LifeAct-GFP発現ニューロンの成長円錐を示す青色のアスタリスク。(C)tRFP(マゼンタ)およびZsGreen(緑色)ならびにそれらに対応する成長円錐を含む二重プラスミド系で標識された隣接ニューロン。画像化された成長円錐形(右)は、キャプチャされたフレームの外側(左)であり、成長円錐タイムラプスを取得した直後に得られた。スケール バー、5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> 図6:軸索成長速度と成長円錐体積の分析 (A)ImageJを用いて生成されたLyn-mNeonGreen(上)およびそれに対応するキモグラフ(下)を発現するニューロン上の軸索トレース。(B)画像解析ソフトを用いた成長円錐のzスタック映像の再構成(上図)と、表面計測ツールでハイライト表示した同じ成長円錐(下図)。(c)いくつかの軸索について経時的な成長速度の変化を示すグラフ。(d)(C)において軸索の平均成長速度を定量化する。(e)経時的な成長円錐体積の変化を示すグラフ。(F)成長円錐の平均体積は、(E)において定量化される;スケール バー、5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> 図7:錐体皮質ニューロンの放射状移動とニューロン分極 発達している錐体皮質ニューロン(ピンク色)が胚室室帯(VZ)からぴあ表面に向かって放射状に移動する様子を示す図である。放射状グリアプロセス(灰色)に導かれて、分極ニューロンの移行は、中間ゾーン(IZ)に向かって下方に延び続ける先行プロセス、将来の樹状突起、および後続プロセス、将来の軸索を確立する。破線の赤いボックスは、成長円錐が画像化された皮質領域を表す。具体的にはIZ、脳室下帯(SVZ)、または結合軸索束(緑色)である。このイラストは、Web ベースのツール BioRender.com を使用して作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>プラスミド</td>
			<td>濃度(μg/μL)</td>
			<td>使用目的</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">膜標的タンパク質(Lyn)の標識</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-α-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-浴槽-アルファ-1-ライフアクト-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>成長円錐における糸状アクチン(F-アクチン)標識</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">隣接するニューロンの2つの集団の独立した標識</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-α-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-浴槽-アルファ-1-ドレ</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:プロトコルで使用したプラスミドのリスト。 各利用プラスミドの名称、濃度、及び使用目的。
補足ビデオ1:急性器官型スライスにおける成長円錐ダイナミクスのin situ可視化。 Lyn-mNeonGreen(左上)とLifeAct-GFP(左下)でラベル付けされた成長円錐のダイナミクス。隣接する成長円錐体は、tRFP(マゼンタ、右上)およびZsGreen(緑色、右下)を含む二重プラスミド系で差動的に標識される。イメージング間隔、2.5秒スケール バー、5 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で 生理学的に関連する急性脳スライスを調製する方法を説明し、ユーザーフレンドリーな分析パイプラインを提供します。

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

軸索が複雑な中枢神経系マトリックスをどのようにナビゲートするかは、神経生物学における基本的な問題である。このプロトコルは、高解像度イメージングによる生理学的環境における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの研究を可能にする。このプロトコルは、マウス胚性脳におけるDNAの送達のためのユーザーフレンドリーなエンドツーエンドパイプライン、高品質の有機型スライスの準備、および画像取得および分析のためのステップバイステップガイドを記述しています。もともとは胚性中枢神経系における軸索ダイナミクスを研究するために設計されていたが、このプロトコルは、外傷性または病理学的状態後の器官型培養および軸索可塑性の視覚化を可能にするように調整することができる。プロトコル自体は比較的簡単です。しかし、脳構造の最初のラベリングと保存を達成することは重要なポイントです。したがって、エレクトロポレーション、脳解剖、およびスライスのステップには特別な注意が必要です。手順のデモンストレーションは役に立ち、博士課程の学生はブラケットの研究室の出身です。妊娠中の雌マウスを麻酔した後、温かい生理食塩水または鉗子に浸した綿芽を使用して両方の子宮角を引き出す切開を行い、胚の間の空間を慎重につかむ。その後、湿ったガーゼの上に胚を置きます。子宮嚢を切り開いた後、各胚を除去する。胚を、氷上のグルコースを添加したHBSSを含む10センチメートルの皿に入れる。元子宮エレクトロポレーションのために、胚を拾い上げてホルダーに入れます。次に、DNAファストグリーンミックスを含むガラスキャピラリーを胚頭蓋骨を通して側脳室に慎重に挿入し、DNAプラスミドミックスを各心室に2〜3マイクロリットル注入する。次に、胚の頭を白金ピンセット電極の間に適切な角度で保持して、所望の脳領域を標的とし、陰極をDNA転写が意図される領域に向ける。子宮エレクトロポレーションでは、子宮の角を引き出し、前述のように胚を湿ったガーゼの上に置いた後、指先を使用して、子羊矯正縫合糸とたるみ縫合糸が見つかるまで子宮内で胚を静かに回転させます。次に、DNAファストグリーンミックスを含むガラスキャピラリーを子宮壁および胚頭蓋骨を通って側脳室に慎重に挿入し、DNAプラスミドミックスの2〜3マイクロリットルを、必要に応じて片方または両方の心室に、心室あたり最大2マイクロリットルで注入する。注射後、胚の頭を白金ピンセット電極の間に適切な角度で保持し、DNA移植が意図されている領域に陰極を向けて所望の脳領域を標的とする。必要な胚がすべてエレクトロポレーションされたら、生理食塩水に浸した綿棒を使用して、子宮の角を腹腔内に静かに戻します。5-0の縫合材料を用いて筋肉および皮膚切開部を縫合し、次いで縫合クリップを用いて創傷を固定し、ベタジンを噴霧することによって創傷を消毒する。マウスを回復ケージに戻し、遠赤外線加温光を使用して、処置後に少なくとも20分間暖かさを維持します。解剖顕微鏡下で胚の頭を固定する。次に、頭の付け根から鼻に向かって正中線に沿って切断することによって、頭蓋骨の皮膚を除去します。頭蓋骨の皮膚を横方向に剥がし、脳を切除するのに十分な大きさの隙間を作ります。次に、無菌解剖ハサミの閉じた先端を嗅球の下から脳幹に向かって移動させて挿入して脳を取り外す。その後、脳幹を切り取り、脳の周りの髄膜の多くの緩い部分をトリミングします。穴あきスプーンを使って脳を拾い上げ、スプーンの底を乾いたティッシュペーパーに叩きつけて余分な液体を取り除きます。その後、氷の上のアガロース皿に脳を置きます。次に、小さなスプーンを使用してアガロースを10秒間混ぜて冷却し、脳を皿の真ん中まで動かし、背側を上にして水平に置き、あらゆる方向からアガロースで完全に覆われていることを確認します。Vibratomeワークステーションからアガロースブロックを優しく拾い上げ、ティッシュペーパーに軽く叩いて底を乾かします。次に、脳の吻側を上に向けて標本ホルダーの接着領域にブロックを置き、試料ホルダーを氷の上に置きます。接着剤を1分間乾燥させます。脳をコロナスライスで15度の角度で切断する。その後、きれいなヘラを用いて、脳スライスを収集し、パラフィンを用いて35ミリメートルのガラス底皿に固定化したPTFE膜上にそれらを置く。膜ごとに最大5つの脳スライスを収集します。次に、200マイクロリットルのピペットを用いて、スライスを半乾燥させたまま、膜上のスライスの周囲から過剰なHBSSグルコース溶液を除去し、次いで、500マイクロリットルの予め加温したスライス培地を膜の下の空間に直接加え、5%の二酸化炭素と共に摂氏35度でスライスをインキュベートする。軸索の成長をイメージングするために、低~中程度の細胞密度を有する皮質領域を見つける。成長円錐ダイナミクスを画像化するために、皮質の即時ゾーンまたは脳室下ゾーンに成長円錐の位置を特定する。次に、Z スタックサイズを定義します。大きなZスタック内の軸索成長の場合、ステップサイズを2マイクロメートルに設定し、より小さなZスタック内の成長円錐の場合、ステップサイズを1マイクロメートルに設定する。データ分析を行うには、[ファイル] をクリックしてフィジーの画像ファイルを開き、次に開いて画像を選択します。画像をクリックしてタイムラプスの最大強度投影を取得し、その後にスタック、Z投影、最大強度投影を続けます。タイムラプスを通過し、成長している軸索を見つけます。位置が見つかったら、最初のフレームの軸索の先端から始まり、時間経過全体を通して軸索をたどり、成長する軸索に線を引きます。次に、プラグインkymoをワイドに再スライスして歌います。キーモグラフのスケールを設定するには、画像に移動してからプロパティに移動します。距離をマイクロメートル単位、ピクセル幅と時間を秒または分単位、ピクセルの高さで設定した後、分析に移動して[測定]をクリックします。成長円錐の体積を測定するには、画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開き、ファイルをクリックして開き、目的のファイルを選択します。次に、手順 1 で [新しいサーフェスの追加] ウィザードを選択し、アルゴリズム設定で対象領域のみをセグメント化し、手順 2 で、すべてのフレームの成長円錐全体に収まるようにフレームをトリミングします。次にステップ3で、閾値を絶対強度に保ち、ステップ4で、成長円錐領域全体が閾値化されていることを確認する。次に、ステップ5で、フィルタタイプの下でボクセルLMGの数を1つに選択します。「実行」(Execute) ボタンを選択してすべての作成ステップを実行し、新規サーフェスの追加ウィザードを終了します。最後に、ウィザードウィンドウの上部にある統計タブで、詳細タブで特定の値とボリュームを選択します。典型的には、子宮内または子宮外エレクトロポレーションのいずれかに由来する首尾よく培養された脳スライスは、正常な細胞分布および頂端配向したピロ接触プロセスを有する放射状グリアの組織化された配列を示す。時折、元子宮エレクトロポレーションが放射状グリア足場および培養脳スライスに顕著な障害を観察し、この対照染色を推奨する。Lyn-mNeonGreenを発現する代表的な錐体皮質突出ニューロンとその成長円錐の動的挙動がここに示されている。さらに、ニューロンをアクチンプローブを発現するプラスミドを用いて標識し、その場で軸索成長円錐のアクチン動態を分析した。また、in situ実験は、プラスミド設計を発現するデュアルcre dre蛍光色素を用いても実施され、tRFPまたはZsGreen蛍光色素は、隣接するニューロンにおいてそれぞれdreまたはcreリコンビナーゼのいずれかによって特異的かつ個別に活性化され得る。キモグラフから、いくつかの軸索の成長速度および経時的な成長円錐体積などの動的成長パラメータが容易に得られる。これは、アクチントレッドミリングの速度および成長円錐探索活動中の糸状体と層状突起との間のバランスを評価するために使用することができる。脳の構造を維持し、プラスミド濃度を微調整してまばらな標識を達成することが重要です。これは、皮質内の軸索および成長円錐を正確に視覚化するために重要である。選択された血漿および遺伝的背景に応じて、このプロトコルは、ユーザーがニューロンまたはそれらが成長する環境を変更することを可能にし、幅広い研究を可能にする。その場でニューロンへの高解像度アクセスを可能にすることにより、この技術は、神経科学者が形態学的および分子的レベルの両方で成長円錐と中枢神経系メトリックとの間の動的相互作用を調査することを可能にする。

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。...

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

このビデオは、トランスジェニックマウス胚からの眼球運動切片のex...

トランスジェニックマウス胚からの眼球運動切片のEx Vivo培養とイメージング

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

神経前駆有糸分裂は、神経新生の重要なパラメータである。神経前駆糸分裂の我々の理解の多くは、固定された組織の分析に基づいている。胚性脳スライス内のライブイメージングは​​、制御された環境で、高い時間·空間分解能で有糸分裂を評価するための汎用的な手法である。...

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション...

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5...

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

学ぶマウス胚脳スライス培養における軸索成長と成長円錐ダイナミクスの可視化手法。電気穿孔によるDNA導入と高解像度イメージングで、神経発生の動的メカニズムを生理学的環境で解析する方法です。

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

さらに動画を探す

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

さらに動画を探す

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化