ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

神経変性および行動研究における強力な動物モデルとして、C.elegansは、ハンチントン病様モデルを使用して、ポリグルタミン神経毒性に対する毒性化合物を効率的にスクリーニングおよび評価するために使用できます。この手法の主な利点は、異なるC.elegansモデルにおける複数の表現型のプロファイリングと統合です。また、実際にはC.elegansモデルのようにこの方法で使用されます。

それは、他の神経変性遅延および実際に他の遅延のための治療候補のスクリーニングおよび調査にサイズを提供する。C.elegansの成長に使用される温度に注意を払い、ナミカル発達の適切な段階でテストを実行してください。手順を実演するのは、3人の大学院生であるJiang Yiyi、Xioa Yue、Wang Qiangqiangです。

まず、AM141線虫の300〜500匹の同期L1幼虫を、大腸菌のOP500株とアストラガランのミリリットルあたり5ミリグラムを含む500マイクロリットルのS培地を用いて、48ウェルプレートの各ウェルに移すことから始めます。プレートをパラフィルムで密封し、摂氏20度、毎分120回転で所望の時間間隔でインキュベートします。線虫を滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、遠心分離によりM9バッファーで3回洗浄して、残りのOP50細胞を除去します。

次いで、AM141線虫をM9緩衝液に再懸濁する。次に、10〜15個の線虫を384ウェルプレートの各ウェルに移し、処理ごとに10個の複製ウェルを設定し、各ウェルに10マイクロリットルの200ミリモルアジ化ナトリウムを追加して、線虫を底まで落ち着かせて麻痺させます。プレートをハイコンテントイメージングシステムに入れて、蛍光画像を取得します。

画像取得ソフトウェアを開き、テキスト原稿に記載されているパラメータを設定します。レビュープレートデータウィンドウを開き、画像解析用のテストプレートを選択して、画像データを解析します。テストウェルをダブルクリックして、その画像を表示します。

次に、分析方法としてカウント核を選択し、設定の構成ボタンをクリックします。FITCチャンネルからソース画像を定義し、標準アルゴリズムを選択します。本文に記載されているように画像解析パラメータを設定し、それらをテストして解析方法を最適化します。

設定を保存し、すべてのウェルで分析を実行します。全核を各ウェルのQ40:YFP凝集体の総数としてエクスポートします。各ウェルの線虫の数を数え、各グループの線虫あたりのQ40:YFP凝集体の平均数を計算します。

次に、阻害指数を計算します。polyQ神経毒性アッセイ用の線虫を調製するには、300〜500匹のHA759線虫の同期L1幼虫を、大腸菌のOP50株および1ミリリットル当たり5ミリグラムのアストラガラを含む500マイクロリットルのS培地を用いて、48ウェルプレートの各ウェルに移す。プレートを密封した後、前に示したように、線虫をインキュベートし、収穫し、M9バッファーに再懸濁します。

次に、100ミリリットルのM9バッファーに2グラムのアガロースを加えてアガロースパッドで調製し、溶液を電子レンジで沸騰近くまで加熱します。厚さ2ミリメートルのガラス板の2枚の間に置かれた厚さ1ミリメートルの顕微鏡用ガラススライドの中心に0.5ミリリットルの溶融アガロースを分注し、別のスライドで垂直に覆います。アガロースが冷えて固まったら、上部のスライドをそっと取り外します。

ASHニューロン生存アッセイを開始するには、20ミリモルのアジ化ナトリウムをアグロスパッドに滴下し、15〜20個のHA759線虫をドロップに移して固定化します。線虫の上にカバースリップをそっと置きます。次に、スライドをデジタルカメラを取り付けた蛍光顕微鏡の下に置きます。

40倍の対物レンズとFITCフィルターを選択して、線虫の頭部領域のGFP陽性ASHニューロンを検出します。各グループの50を超える線虫をランダムに選択して、頭部領域にGFP標識された両側ASHニューロンを持つ線虫の数を数え、ASHニューロンの生存率を計算します。浸透圧回避アッセイでは、中央に8モルのグリセロールラインを作成して、食品を含まないNGMプレートを正常ゾーンとトラップゾーンに分割します。

次に、グリセロールラインから約1センチメートル離れた場所に200ミリモルのアジ化ナトリウムラインを広げて、グリセロールバリアを通過する線虫をトラップゾーンに麻痺させます。それぞれ約200個の線虫を、各グループの3つの複製プレートの正常ゾーンに移します。次に、線虫を引き付けるためにトラップゾーンに1%ブタンジオンの滴を追加します。

すぐにペトリ皿の蓋を覆い、摂氏23度で90分間インキュベートします。顕微鏡下で両方のゾーンの線虫の数をスコアリングし、回避指数を計算します。トランスジェニックpolyQ株AM141は、この自動イメージングおよび分析プロトコルによって同定された体壁筋細胞にQ40:YFP融合タンパク質を強く発現し、その増加量はレンゲ治療によって抑制され、その保護の可能性が実証されました。

線虫の頭部領域におけるGFP蛍光および両側ASHニューロンの喪失は、ASHニューロン死を示す。このASHニューロン生存アッセイは、カエノラブディティスエレガンスニューロンに対するテスト化合物の神経保護効果を視覚的に評価するために使用できます。化学感覚回避アッセイを使用して、polyQ凝集によって媒介されるASHニューロンの機能喪失に対する効果的なテストサンプルを調べました。

レンゲで15°Cで3日間処理したHA759線虫の回避指数は0.6以上に増加し、行動障害に対する多糖類の神経保護効果を示しました。試験化合物の全体的な神経保護能力を評価するために、個々のアッセイからのデータを統合し、対照群よりも大きいアストラガラン治療群の三角形の面積を示すレーダーチャートとして提示し、多糖の抗polyQ効果を示した。食物、温度、湿気がC.elegansの行動に影響を与える可能性があることに注意してください。