多発性骨髄腫の骨髄塗抹標本の その場での 相間蛍光ハイブリダイゼーション

FISHと呼ばれる蛍光In situハイブリダイゼーションを多発性骨髄腫における遺伝的リスク層別化に適用することは不可欠です。FISHレポートの重要な部分は、すべての有核細胞ではなく、抗CD138磁気ビーズで選別するか、またはcIg FISHと呼ばれるFISH試験で細胞質カッパまたはラムダ軽鎖免疫グロブリンでマーキングすることによって、特異的に精製または同定されたクローン形質細胞である。形質細胞選別またはcIg FISH後の相間FISHは、骨髄中の形質細胞の割合が比較的低いため、多発性骨髄腫の診断において有意であることが判明した。

しかし、これらの方法には、複雑なプロセス、高い試料要求、高い実験コストなど、いくつかの欠点があります。形質細胞は、骨髄塗抹標本中に迅速に配置することができる。これに基づき、骨髄塗抹標本FISHを用いて多発性骨髄腫細胞を検出した。

この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、武漢大学中南病院の倫理委員会によって承認された。検体は、中国武漢大学中南病院血液科の多発性骨髄腫患者から採取した。最初の0.2ミリリットルの骨髄溶液を清潔な使い捨てスライドガラスの上に置き、骨髄を素早く取り外してから自然に乾燥させることによって、骨髄塗抹標本を均一な厚さと鋭い尾に広げる。

骨髄フィルムを1ミリリットルのライト・ギムザ溶液で室温で約10秒間覆う。1ミリリットルのリン酸緩衝液をスライドに加え、色素溶液がスライドから乾燥または流出するのを防ぐために注意が必要であった。色素溶液を穏やかに混合し、室温で15分間維持する。

スライドをきれいな水ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。悪性形質細胞を検出するために前方光顕微鏡を使用して、形質細胞はよく分散している必要があります。今、私たちが現場で見ているのは、かなり分散している形質細胞です。

これは典型的な二核核プラズマセルです。ハイブリダイズした領域を固定液で10分間覆い、形質細胞を変色させて固定する。スライドをイオン交換水ですすぎ、室温で空気中で乾燥させます。

2回のSSC緩衝液を含むジャーを水浴中で摂氏56度に予熱する。調製した骨髄塗抹標本を予熱した2回SSC緩衝液で10分間洗浄し、続いて室温の脱イオン水に浸漬した。エタノール勾配70%85%および100%エタノールでそれぞれ1分間塗抹標本を脱水する。

塗抹標本を空気中で10分間乾燥させる。まず、17番染色体プローブ混合物のセントロメア上のTP53をハイブリダイゼーション領域に加え、それをカバースリッププレスで覆い、細かい尖ったピンセットを優しく覆い、下から気泡を除去する。カバースリップのすべての側面をゴムセメントでシールして、良好な気密性を確保します。

ゴム糊の固化後、スライドを自動FISHマシンに載せて変性を78°Cで5分間行い、続いて37°Cで一晩ハイブリダイゼーションを行った。FISHマシンからスライドを拾います。細かい尖ったピンセットを使用してゴムセメントを優しく取り除きます。

スライドを室温で2回SSCに約1〜2分間浸し、カバーの滑りを洗い流します。スライドを68°Cの予熱バッファーで水浴中で2分間洗浄します。スライドを37°Cの水浴中で2回SSCで1分間洗浄します。

ハイブリダイズした領域に10マイクロリットルのDAPIで10分間十分に乾燥させるために暗闇の中で右にセットアップし、カバースリップで覆う。蛍光顕微鏡上に設定された適切なフィルターを用いてハイブリダイズスライドを表示し、単色青色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、細胞核の蛍光強度を観察した。DAPIフィルタセットの下で細胞核画像を撮影する。

CEP17は緑色蛍光で標識された。スペクトル緑色蛍光色素分子光学フィルターを使用して、CEP17の位置を観察します。緑色のフィルタセットの下でCEP17信号画像を撮ります。

TP53遺伝子を橙色蛍光で標識した。スペクトルオレンジ色の蛍光色素光学フィルターを使用してTP53を観察し、TP53信号画像をセットの下で撮影し、これら3つの画像全体をマージし、数値異常を調べます。正常な相間細胞では、1対の正常な染色体17を示す青色蛍光を有する2つのオレンジ色および2つの緑色のシグナルが核内に観察される。

結果は、多発性骨髄腫患者における骨髄の形態および遺伝学を示した。図Aは、骨髄塗抹標本中の形質細胞の15%が、通常よりも大量の細胞質と共に、より大きくかつ暗くかつ核を有することが見出されたことを示した。図Bは、骨髄塗抹標本における有核形質細胞による代表のグレースケール画像を示した。

図Cは、形質細胞の1つの相間核において4つのオレンジ色および4つの緑色のシグナルを示し、第17染色体の4つのコピーが核内に局在していたことを示唆している。図Dは、この患者の異常な染色体核像が1つの核に2対の染色体17を確認したことを示した。骨髄塗抹標本は、抗凝固骨髄を得るために核を得るために複雑な手順を必要とするため、抗凝固剤骨髄標本よりもはるかに入手が容易である。

そこで、多発性骨髄腫細胞の検出のための骨髄塗抹標本FISHの説得力のある方法を確立した。