Name: SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶSNAREタンパク質を用いた再循環エンドソームの蛍光顕微鏡解析法。マウス皮膚メラノサイトを用いて、メラノソームの形成と色素沈着メカニズムを可視化し、細胞内輸送の動態を定量的に評価する技術です。

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この作業は、バイオテクノロジー省(BT/PR32489/BRB/10/1786/2019からSRGS)によって支えられた。理工学研究委員会(CRG/2019/000281 SRGS)DBT-NBACD(BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20からSRGS)とIISc-DBTパートナーシッププログラム(SRGSへ)。この部門のインフラストラクチャは、DST-FIST、DBT、および UGC によってサポートされていました。AMB は DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02) によってサポートされました。

プロトコルは、プラスミドのトランスフェクションに続いてメラノサイトの播種を伴う。さらにステップには、細胞の固定、免疫染色、イメージング、および分析が含まれ、レの長さと数を測定する。プロトコルの詳細な説明は以下の通りです。
1. 前処理されたカバーリップ上のマウスメラノサイトの播種
<ol><li>ガラスカバーリップをペトリ皿(すなわち、35mm皿の4-5)に基膜マトリックス培地(完全RPMI培地では1:20:RPMI + 10%熱不活性化FBS + 1xグルタミン+1x抗生物質ミックス)でコーティングし、ティッシュ培養フードで15分間乾燥させます。使用前に1倍PBSでカバーリップを1回洗ってください。</li>
	<li>野生型マウスメラノサイト(C57BL/6Jのメランインク4a-Arf-1、 a/a、 Ink4a-Arf--マウス 、20 年に記載され、ウェルカムトラスト機能ゲノミクスセルバンクで入手可能)をペトリ皿(すなわち、35または60mm皿)で維持する。<ol>
<li>1x PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシン細胞をトリプシンするためのトリプシンEDTA(0.25%)溶液を0.5または1mL添加します。37°Cで2〜5分間細胞をインキュベートし、ペトリ皿から剥離します。</li>
		<li>完全なRPMI培地の1〜2mLを加え、中断し、遠心分離管に細胞を移します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞懸濁液を4°Cで遠心し、376 x g で5分間、ペレットを1x PBSで再懸濁させた。</li>
	<li>遠心分離工程を繰り返し、完全RPMI培地の1mLで細胞を再懸濁します。</li>
	<li>50~60%の合流度で基膜培地コーティングカバーリップの上に細胞を播種します(4~5個のカバーリップを含む35mm細胞培養皿の約6 x 105 細胞)。完全なRPMI媒体のメッキされた細胞懸濁液にPMAの200 nM(作業ストック40 μMの40 μMの40 μLの12-myristate 13-アセテートを加える)を加えます。</li>
	<li>播種後、37°Cでプレートを12〜24時間インキュベートする。</li>
</ol>2. STX13プラスミドを用いて細胞をトランスフェクションする
<ol><li>以下の試薬を使用してください: pEGFP-C1-STX13WT および pEGFP-C1-STX13Δ129 (説明 12) 。mCherry-Rab11は、グラサ・ラポソ、キュリー研究所、パリからの親切な贈り物でした(参考19に記載されています)。ATCCからの抗TYRP1抗体(TA99)。</li>
	<li>12〜24時間の播種後、脂質系トランスフェクション試薬を用いてプラスミドで細胞をトランスフェクトする。35mmの皿の場合、マイクロ遠心分離管内のOPTI-MEM培地の250μLにトランスフェクション試薬を5μLとし、OPTI-MEMの250μLで各プラスミドの約200ngを取ります。</li>
	<li>DNAとトランスフェクション試薬を含むチューブを5分間インキュベートします。繰り返しピペットを使わずに混合します(総体積は約500μLになります)。室温で30分間インキュベートします。RTで30分間、10分ごとにチューブの手タップを行います。</li>
	<li>インキュベーション中に、細胞を1x PBSで2回、OPTI-MEMで1回洗浄し、細胞に1mLのOPTI-MEMを加えます。</li>
	<li>インキュベーションのポスト30分、皿を覆うことによって細胞にトランスフェクション試薬-DNAミックスを加える。</li>
	<li>37°Cで6時間培養する。トランスフェクション試薬でOPTI-MEM培地を吸引し、PMAの200 nMを添加した完全なRPMI培地を添加する。</li>
	<li>37°Cで48時間培養します。</li>
</ol>3. 細胞の固定
注:以下の手順は、組織培養フードの外側で行われます。
<ol><li>48時間のトランスフェクションの後、1x PBSで細胞を2回洗浄し、3%ホルムアルデヒド(1x PBSで作りたての)で細胞を30分間固定します。</li>
	<li>固定後、細胞を1x PBSで2回洗浄し、さらに使用するまでカバーリップを1倍PBSに保管します。あるいは、セルはガラススライド(下記参照)に取り付けたり、4°Cで保存することができます。</li>
</ol>4. 細胞の免疫染色
<ol><li>湿気の多いチャンバーを準備する:ペトリ皿の湿った濾紙にパラフィンフィルムカットピースを置き、アルミニウム箔で覆います。</li>
	<li>一次抗体溶液25μL(1x PBSでは0.2%サポニン、1x PBSでは0.1%BSA、1x PBSでは0.02%のアジドナトリウム)を調製します。1:200の希釈時に抗体を加える。湿気の多いチャンバーのパラフィンフィルムに滴としてこの溶液を追加します。</li>
	<li>慎重に鉗子でカバースリップを持ち上げ、一次抗体染色溶液のこの滴でそれを反転させ、湿潤チャンバーの蓋を覆う。室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>同様に、2次抗体溶液を1:500の希釈で調製し、湿気の多いチャンバーのカバースリップの隣のパラフィンフィルムに置きます。核を染色するには、DAPI (1:20,000 ~ 1:30,000) を溶液に加えます。</li>
	<li>鉗子を使用して、慎重に一次抗体溶液からカバースリップを拾い、それを1x PBS(ガラスビーカー)に3回浸します。</li>
	<li>ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップの余分なPBSを取り除きます。湿気の多いチャンバー内の二次抗体染色液の上に置き、溶液中に蛍光タグ付き抗体が存在するため、光にさらしません。</li>
	<li>カバースリップを室温で30分間再びインキュベートします。これらの手順を通して、セルを持つカバースリップの側面を常にメモしてください。</li>
	<li>インキュベーション後、二次抗体溶液からカバースリップを慎重に取り出し、1x PBSに3回浸します。さらに、ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップ上の余分なPBSを取り除きます。</li>
	<li>フッ素マウントG実装試薬12μLをガラススライドに配置し、取り付け試薬の上にステンドカバースリップ(ガラスに向かって向いている)を慎重に配置します。ティッシュペーパーのガラススライドを反転し、軽く押します。</li>
</ol>5. 細胞の蛍光顕微鏡
<ol><li>60x(油)のアポクロマティック目的または同様の構成を有する他の顕微鏡を用いたCCDカメラを搭載した反転蛍光顕微鏡を使用して、明視野(BF)および蛍光(IF)フィルター下の染色細胞を画像化します。</li>
</ol>RE局所タンパク質とメラノソーム間の重複の定量化:
注: フィジーソフトウェアを使用したタンパク質間のマンダーの重複係数の定量化については、以下の手順に従います(リンクから自由にダウンロード可能:https://imagej.net/software/fiji/)。TIFF イメージを複数のチャネルで使用します。
<ol><li>
生の画像を開きます。[イメージ] オプションに移動し、[色] |チャネルを分割し、分析に 2 つのチャネルを使用します。</li>
	<li>「プラグイン」オプションでJACoPプラグインを開きます。</li>
	<li>すべての明るいスポットが選択され、背景が削除されるように、両方のチャネルのしきい値を設定します。</li>
	<li>[解析]オプションに移動し、マンダーの重なり係数を取得するには、M1とM2係数を選択します。</li>
	<li>JACoPプラグインの 分析オプション を押して、マンダーの重なり係数を表示する結果を確認します。</li>
</ol>7. エンドソームの管数と長さのリサイクルの定量化:
注: フィジーソフトウェアを使用した管の数と長さの定量化については、次の手順に従います。
<ol><li>未加工の画像を開く 画像に移動 ]オプションを選択し、[ カラー]|チャネルを分割 し、目的のチャネルを使用して解析します。</li>
	<li>もう一度 [イメージ] に移動し、[ 種類] | 8 ビット イメージに変換します。</li>
	<li>次にプラグインに移動 し、[分析] を選択 |チューブネス。 シグマ 値を 0.1075 に設定します。 [OK] を押します。</li>
	<li>もう一度 [イメージ] に移動し、[ 種類] を選択| 8 ビットイメージに変換します。</li>
	<li>イメージ |に移動|を調整するしきい値(すべての画像に同じしきい値を使用します。画像の強度はほぼ等しい必要があります)。</li>
	<li>プロセス |に移動バイナリ|マスクに変換します。</li>
	<li>[プロセス] に移動し、[バイナリ] を選択して、[スケルトン化] を選択します。</li>
	<li>[解析]に移動し、[スケルトン]を選択して、[スケルトンを解析]を選択します。結果と出力|選択(a)最大最短経路|を計算(b)は、(c)ラベル付きスケルトンを表示|詳細情報を表示します。[OK] を押します。 注: 結果は、表形式で開きます。[平均分岐長]の列には、選択されたセル内のすべての異なる細管の長さが表示されます(マイクロメートルで値を取得するためのスケールを設定します)。</li>
	<li>セル内のチューブの数を取得するには、[ 解析] に移動し、[ パーティクルの分析 ] オプションを選択します。 [OK] を押します。 注: 取得した結果では、count 列に特定のセル内の管の数が表示されます。</li>
	<li>データを保存して分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+building+BLOC%28k%29s+of+lysosomes+and+related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).</li>
<li>Raposo, G., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanosomes--dark+organelles+enlighten+endosomal+membrane+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).</li>
<li>Ohbayashi, N., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+the+molecular+basis+of+melanogenesis+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).</li>
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<li>Sitaram, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+a+dileucine-based+sorting+signal+by+AP-1+and+AP-3+reveals+a+requirement+for+both+BLOC-1+and+AP-3+in+delivery+of+OCA2+to+melanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).</li>
<li>Nag, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4A+organizes+endosomal+domains+for+sorting+cargo+to+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles.</a> Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).</li>
<li>Dennis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLOC-2+targets+recycling+endosomal+tubules+to+melanosomes+for+cargo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).</li>
<li>Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STX13+regulates+cargo+delivery+from+recycling+endosomes+during+melanosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis.</a> Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).</li>
<li>Shakya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab22A+recruits+BLOC-1+and+BLOC-2+to+promote+the+biogenesis+of+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes.</a> EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).</li>
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<li>Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+lysosome-related+organelles%3A+Insights+from+Hermansky-Pudlak+syndrome+and+other+rare+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases.</a> Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).</li>
<li>Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+13+mediates+cycling+of+plasma+membrane+proteins+via+tubulovesicular+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes.</a> Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).</li>
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<li>Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-related+organelles+as+functional+adaptations+of+the+endolysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).</li>
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<li>Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tethering+complex+for+endosomal+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A modular tethering complex for endosomal recycling.</a> Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).</li>
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</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

エンドソームのリサイクルは、エンドサイトオルガネラのコホートであり、全ての細胞型で細胞表面への貨物のリサイクルを仲介します21,22,23,24,25。メラノサイトなどの特殊な細胞型では、これらのオルガネラは、その生物形成のためのメラノソームに向かって彼らの人身売買ルートを部分的に転用する3,16,26。さらに、早期/仕分け用の遠分化の貨物分類後に生成されたレは、形態学的に管状-小胞構造として現れる。それらのダイナミクス(数および長さ)は、運動タンパク質21、22</sup...

メラニン色素の生合成は、メラノソーム、従来のリソソームと共存するメラノサイト特異的リソソーガネラ(LRO)で起こる。エンドサイト系は、色素体の生物形成において重要な役割を果たし、放射線電離放射線に対する皮膚色と光保護に必要な1,2,3です。この過程で、メラニン合成酵素は早期/選別エンドーソームで選別され、その後、循環性エンドーソーム(RE)4,5,6,7,8,9,10と呼ばれる管状または小胞性子宮体を介して早期メラノソームに輸送されます。これらのオルガネラの標的化および融合は、完全に機能性色素性メラノソーム7,11,12,13,14の成熟を調節する。これらのオルガネラまたはこれらのオルガネラへの貨物選別の形成における欠陥は、オキュロチュネアアルビニズムおよび他の臨床表現型を引き起こし、ヘルマンスキー・プドラク症候群15,16で観察された。
ここでは、Rを研究し、分析するための単純な顕微鏡ベースの手法について説明します。この方法では、endoソーム17のリサイクルに存在する膜貫通タンパク質であるQa-SNAREシンコシンシン(STX)13と、メラノサイトにおけるエンドーソームとメラノソーム間のサイクルを利用しています12,18。また、N末端非構造化制御ドメイン(すなわちSynNまたはSTX13Δ129)を削除すると、SNAREはメラノソームに立ち往生し、メラノソーム12に向かう前方の入稿経路を測定する。私たちの研究では、既知の循環型内経マーカーRab GTPase(Rab)11を使用しています14,19。タンパク質GFP-STX13WT、GFP-STX13Δ129、mCherry-Rab11、およびIRP1のタンパク質の蛍光イメージングは、その後、それらの相対的な局在化の定量化に続いて、メラノソームへの標的化に加えて、REの性質とダイナミクスを提供する。このように、これはメラノサイトのRのダイナミクスを可視化し、測定するために使用できる簡単な技術です。

<table><tbody><tr><td>抗TYRP1抗体 (TA99)</td><td>ATCC</td><td>HB-8704</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668-500</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>022600-050</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr></tbody></table>

snare人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

循環性の子宮体(R)は、すべての細胞タイプの早期/選別用の子宮間から生成される管状小胞性小器官である。これらのオルガネラは、メラノサイトによって産生されるリソソーム関連小器官であるメラノソームの生物形成において重要な役割を果たす。Rは、メラノサイト特有の貨物を形成中に早期メラノソームに提供します。レスキー・プドラック症候群のいくつかの変異体で観察される、レージの生成における閉塞は、皮膚、髪、および眼の色素沈着をもたらす。したがって、レジェのダイナミクス(数と長さを参照)を研究することは、正常および疾患状態におけるこれらのオルガネラの機能を理解するのに有用である。本研究では、居住SNARE STX13を用いてREダイナミクスを測定することを目指す。

STX13Δ129変異体のメラノソームへの定量化 マウス野生型メラノサイトにおけるSTX13の免疫蛍光顕微鏡検査は、GFP-STX13WTを細胞表面に加えて環状構造として局在した小胞および管状構造として局在し、GFP-STX133WTを示した(図1A)。また、細胞内リング様GFP-STX13Δ129は、メラノソームタンパク質のTYRP1(図1A)と明視野画像メラノソーム(データは示さない)と共局在化を示した。前に示したように、過剰発現GFP-STX13WTのコホートはメラノソーム12で観察される。メラノソームへのGFP-STX13WTとGFP-STX13Δ129の相対的な局在を測定するため...

子宮内膜のリサイクルは、内膜管状ネットワークの一部です。ここでは、GFP-STX13をオルガネラマーカーとして使用して、エンドーソームのリサイクルのダイナミクスを定量化する方法を紹介します。

SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

SNAREの人身売買を用いたリサイクル用の子宮体を研究し、分析するための顕微鏡ベースのアッセイ。これらは皮膚メラノサイトです。細胞の中に見える黒い色のオルガネラはメラノソームと呼ばれます。メラノソームはリソゾーム関連小器官またはLROと呼ばれるオルガネラのクラスとして知られています。循環性の循環は、初期の尿細管状小胞小器官であり、すべての細胞タイプの中で子宮内ソームを選別する。これらのオルガネラはメラノソームの生物形成において重要な役割を果たす, メラノサイトによって生成されるリゾゾーム関連小器官.エンドーソームのリサイクルは、メラノサイト特有の貨物を形成中に早期のメラノソームに送達します。いくつかの症候群で観察される循環性の増殖性の生成は、皮膚、髪、および眼の色素沈着の細胞である。したがって、子宮体をリサイクルするダイナミクスを研究することは、正常および疾患状態におけるこれらのオルガネラの機能を理解するのに有用である。本研究は、逮捕SNARE構文-13を用いて、循環型の内ソームのダイナミクスを測定することを目的としている。最初のステップは、前処理されたカバーリップ上のマウスメラノサイトの播種です。基質膜マトリックス媒体でペトリ皿にガラスカバーリップをコーティングします。そして、ティッシュ培養フードで15分間乾燥させます。使用前に1X PBSでカバーリップを1回洗ってください。50〜60%のコンピテンシーで基部膜媒体コーティングカバーリップ上の細胞を播種します。完全なRPMI培地で、常に200ナノモルのPMAをメッキ細胞懸濁液に添加してください。細胞を播種した後、CO2インキュベーターに細胞を含む皿を12〜24時間インキュベートする。第2のステップは、シンサクシン-13プラスミドを有する細胞のトランスフェクションである。DNAとトランスフェクション試薬を含む先端をインキュベートし、5分間混合し、ピペット処理を繰り返さずに混合します。室温で30分間、10分おきに手でチューブをタップします。インキュベーション中に、細胞を1X PBSで2回、OPTI-MEMで1回洗浄し、細胞に1マイルのOPTI-MEMを加えます。インキュベーションのポスト30分、トランスフェクション試薬DNAを滴下して皿を覆って細胞に加える。細胞を摂氏37度で6時間インキュベートします。トランスフェクション試薬でOPTI-MEM培地を吸引し、PMAの200ナノモルを添加した完全なRPMI培地を添加する。48時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。第3のステップは、細胞の固定です。以下の手順は、組織培養フードの外側で行われます。48時間のトランスフェクションの後、1X PBSで細胞を2回洗浄し、3%ホルムアルデヒドで30分間細胞を固定します。固定後、細胞を1X PBSで2回洗浄し、さらに使用するまでカバーリップを1X PBSに保管します。あるいは、細胞をガラス板に取り付けたり、摂氏4度で貯蔵したりすることもできます。第4のステップは、細胞の免疫染色である。湿気の多いチャンバーを準備します。ペトリ皿のマウスフィルター紙にパラフィルムカットピースを置きます。アルミホイルで覆います。25マイクロリットルの一次抗体溶液を調製します。1~200の希釈で抗体を追加します。湿気の多いチャンバーのパラフィルムにドロップとしてこのソリューションを追加します。慎重に鉗子でカバースリップを持ち上げます。一次抗体染色液の滴下でそれを反転し、次に湿気の多いチャンバーの蓋を覆う。室温で30分間インキュベートします。同様に、二次抗体溶液を1~500の希釈で調製し、湿気の多いチャンバーのカバースリップの隣のパラフィルムに置きます。核を染色する場合は、溶液に120,000~130,000の希釈でDAPIを加えます。鉗子を使用して、慎重に一次抗体溶液からカバースリップをピックアップし、1X PBSに2回浸します。ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップの余分なPBSを取り除きます。二次抗体染色液を湿気の多いチャンバーに置き、溶液中に蛍光染色抗体が存在するため、光にさらしません。インキュベーション後、二次抗体溶液からカバースリップを慎重に取り出し、1X PBSに2回浸します。さらに、ティッシュペーパーのカバースリップをタップして、カバースリップ上の余分なPBSを取り除きます。12マイクロリットルのイメージング試薬をガラススライドに置き、染色カバースリップを取り付け試薬に慎重に置きます。ティッシュペーパーのガラススライドを反転させ、軽く押します。次に、蛍光顕微鏡を用いてカバースリップを画像化し、ImageJを用いて画像を解析する。第六ステップは、循環性の内在性タンパク質とメラノソームの間の重複の定量です。メラノソームとのシンサクシン-13 delta-129の共局化の定量化。マウス野生型メラノサイトにおけるシンコシン-13の免疫蛍光顕微鏡は、小胞および管状構造として局在するGFP-syntaxin-13野生型を示した。GFP-syntaxin-13 delta-129は、細胞表面に加えてリング状の構造を局所化します。また、細胞内環様GFP-syntaxin-13 delta-129は、明るい視野画像メラノソームにおけるメラノソームタンパク質TYRP1との共局在化を示した。前に示したように、過剰発現GFP-syntaxin-13野生型のコホートはメラノソームで観察される。GFP-syntaxin-13野生型とGFP-syntaxin-13 delta-129をメラノソームに対して相対的に局在化するために、フィジーのソフトウェアを使用し、JACOPプラグインで分析を行いました。測定されたマンダーのオーバーラップ係数、すなわちMOCは、TYRP1を有するGFP-syntaxin-13デルタ-129の間で、TYRP1のGFP-syntaxin-13野生型と比較して約1.5倍高い。興味深いことに、TYRP1はGFP-シンタックス13の野生型と比較してGFP-syntaxin-13 delta-129で2.9倍高いMOC値を示した。これらのデータは、GFP-syntaxin-13 delta-129メラノソームの局在化が、安定状態でのGFP-syntaxin-13野生型と比較して比較的高いことを示している。リサイクルエンドーソームのシンセクシン-13野生型の局在化の定量化。GFP-シンセニン-13野生型の免疫蛍光顕微鏡は、既知の循環型の内皮タンパク質Rab11と共局在化を示した。mCherry-Rab11を持つGFP-シンセニン-13野生型の間のMOCは、GFP-syntaxin-13野生型のmCherry-Rab11と比較して約1.4倍高い。GFP-syntaxin-13野生型正の内皮細管の数と長さを測定するために、フィジーのソフトウェアはプロトコルセクションで説明されているように使用されました。mCherry-Rab11は実験において陽性対照を用いる。GFP-syntaxin-13野生型にトランスフェクトしたメラノサイトは、mCherry-Rab11を発現する細胞と比較して、細胞当たりの細管数が多いことを示した。しかし、細胞内のGFP-シンセニン-13野生型とmCherry-Rab11の両方の共発現時に細管が減少する。第7のステップは、エンドソームの管内数と長さのリサイクルの定量化です。この尿細管は、細胞内のGFP-シンタックス13型とmCherry-Rab11の両方を共発現させると減少する。興味深いことに、GFP-シンタックス-13野生型およびmCherry-Rab11の両方からの平均細管長は、個別または一緒に発現する細胞において互いに匹敵する。これらのデータを組み合わせることで、GFP-syntaxin-13野生型はRab11と同様に内性体をリサイクルするために局所化することを示唆している。この研究は、GFP-syntaxin-13 delta-129であるシンシン13突然変異体のN末端送達は、培養物を細胞表面およびLROにリサイクルすることから、小胞性密売にレポーターとして使用できる可能性のあるメラノソームGFP-syntaxin-13 delta-129に局地化することを示した。一方、GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11と同様に、エンドーソームのリサイクルに局部的に対応しています。この研究は、GFP-syntaxin-13野生型がメラノサイトの内無代性のリサイクル性をマーキングするためにも使用できることを示した。GFP-syntaxin-13野生型は、Rab11が内皮ダイナミクスを変化させるので、Rab11よりも優れた内皮マーカーをリサイクルする可能性があります。GFP-syntaxin-13野生型は、一緒に、定常状態のダイナミクスを研究するために潜在的な循環性内皮マーカーを作用させる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。...

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

膜輸送は、細胞膜から細胞内部へのタンパク質の輸送(すなわち、エンドサイトーシス)を含み、その後、分解のためにリソソームに輸送するか、またはリサイクルのために細胞膜に輸送します。この記事で説明する方法は、細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するように設計されています。...

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。...

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

このプロトコルでは、蛍光共鳴エネルギー移動し、蛍光寿命イメージングに基づく SNARE...

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

神経細胞の興奮は、遠藤の動的過程と興奮性イオン型グルタミン酸受容体の開口放出を変調することができます。表面と内部の受容体人口プールを定量化するためのアクセス可能な高アッセイは、ここで説明しました。...

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

原形質膜からトランスゴルジネットワークへのタンパク質のエンドサイトーシスおよび逆行性輸送は、膜恒常性を維持し、シグナル伝達を調節するために不可欠です。ここでは、HeLa細胞における誘導体化抗GFPナノボディを用いた生細胞顕微鏡による膜貫通カーゴタンパク質のエンドサイトーシス輸送を画像化し、定量する方法を記述します。...

培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

学ぶSNAREタンパク質を用いた再循環エンドソームの蛍光顕微鏡解析法。マウス皮膚メラノサイトを用いて、メラノソームの形成と色素沈着メカニズムを可視化し、細胞内輸送の動態を定量的に評価する技術です。

SNARE人身売買を用いた循環型の内視鏡分析法

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