Name: 水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ 水生生物生息地から炭化水素代謝細菌を単離・増殖・同定する方法。16S rRNAを用いた細菌種の同定とバイオレメディエーションへの応用可能性を評価する標準的な実験室プロトコルです。

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Karthik Krishnan博士とRPラボのメンバーの有益なコメントや提案に感謝します。DSは、SNU-Doctorフェローシップとアースウォッチ・インスティテュート・インド・フェローシップの支援を受けています。RPラボは、シブナダール大学からのCSIR-EMR助成金とスタートアップ資金によってサポートされています。

1. サンプルの収集、処理、分析
注:ここでは、水生生物の生息地から細菌を分離するためのプロトコルを示します。一部の分離株は病原性である可能性があるため、手袋を着用し、使用の前後に作業領域を消毒してください。
<ol><li>水域のさまざまな場所から500 mLの水サンプルを5つの滅菌ガラス瓶に収集します。各サンプルのpHと温度をそれぞれpHメーターと温度計で測定します。 注:このプロトコルはサイト固有ではなく、炭化水素で汚染された水域から生物を分離するためにも簡単に適合させることができます。</li>
	<li>100 mLのバッチで、0.22 μmの孔径のフィルターシートを通して、無菌状態でサンプルをろ過します。 注意: ろ紙の直径は、ペトリ皿の直径を超えてはなりません。たとえば、直径85 mmを超えないろ紙は、100〜120 mmのペトリ皿に最適です。</li>
	<li>ろ紙をさまざまな栄養培地プレート(PYE 19、R2A 20、M9、LB、NB、TSB、M6321およびM2G22)の上に置いてください。異なるタイプの増殖培地は、異なる微生物の選択および濃縮を可能にする。種々の増殖培地の組成を表1に列挙する。各メディアプレートに1枚の紙を使用し、滅菌鉗子を使用して2時間後に剥がします。</li>
	<li>無濾過水サンプル(106 希釈)を滅菌二重蒸留水で100 μLの滅菌水に100 μL添加して段階希釈します。これにより、1:10に希釈されます。このサンプルから100 μLを取り、900 μLの滅菌水を加えて1:100希釈を得ます。希釈倍率が1:1,000,000になるまで希釈を繰り返します。ピペッティングで混合します。各希釈液の最終容量は1mLになります。</li>
	<li>100 μLの希釈水サンプルを、ステップ3で説明したすべての増殖培地プレートに個別に3回に分けて広げます。</li>
	<li>コロニーの成長に応じて、プレートを30°Cで24〜48時間インキュベートします。 注:ほとんどの環境分離株は、30°Cの最適温度で成長します。 極端な温度の環境からサンプルを分離する場合は、収集サイトと同じ温度でプレートをインキュベートします。</li>
	<li>次に、滅菌したつまようじまたはピペットチップを使用してコロニーを選び、象限ストリーキングを実行してコロニーを分離します。</li>
	<li>プレートを一晩インキュベートします。翌日、色、質感、形状、サイズ、マージン、標高などの形態学的特徴に基づいてコロニーをスクリーニングします。純粋な培養物を得るためにコロニーを再構築します。</li>
	<li>各純培養液23 のグラム染色を行い、グリセロールストック調製を進める。</li>
	<li>グリセロールストックを調製するには、単一コロニーを3 mLの適切な増殖培地に接種し、30°Cでインキュベートします。 一晩培養から700μLを取り、300μLの100%グリセロール(オートクレーブ滅菌)をクライオバイアル24に加える。長期保存のためにバイアルを-80°Cで凍結します。</li>
</ol>2.炭化水素の分解
注:以下の例は、スチレンを分解する可能性のある分離株をスクリーニングすることです。これは、以前のレポート25で採用された方法のわずかな変更です。無菌条件下での手順に従ってください。
<ol><li>縞模様の新鮮なプレートからコロニーを選び、5 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)/栄養ブロス(NB)に接種します。吸光度が~2に達するまで、200 rpmで振とうしながら30°Cで一晩培養物を増殖させます。 注:TSB / NB以外に、細菌が高い細胞密度に達する任意の増殖培地を選択できます。</li>
	<li>翌日、細胞を2862 x g で4°Cで5分間ペレット化し、上清を廃棄します。</li>
	<li>ペレットを2 mLのオートクレーブ生理食塩水(0.9%NaCl)で2回洗浄し、2862 x g で4°Cで5分間回転させます。 注:生理食塩水は等張性であるため、細菌細胞内の浸透圧を維持します。</li>
	<li>ペレットを2 mLの液体カーボンフリー基礎培地(LCFBM)に再懸濁します。吸光度(OD600)を測定します。</li>
	<li>対照と実験群のために150mLの容量を持つ2つの滅菌三角フラスコを取ります。それらをAおよびBとしてラベル付けします。</li>
	<li>未接種/対照群(フラスコA)に、40 mLのLCFBMとスチレン(5 mM)を追加します。</li>
	<li>フラスコBに、35mLのLCFBMとスチレンを加える(スチレンの最終濃度を5mMに調整する)。細胞の最終OD600 ≈ 0.1の細胞懸濁液を加え、残りの容量を最大40 mLのLCFBMで補います。フラスコを30°Cで200rpmで30日間振とうしながらインキュベートします。 注:過剰な炭化水素は微生物にとって有毒である可能性があるため、低濃度から始めて徐々に増やします。</li>
	<li>炭化水素の分解を評価する必要がある追加の菌株ごとに上記を繰り返します。</li>
	<li>各フラスコのOD600 を5日ごとに測定し、成長曲線をプロットします。細菌がスチレンを利用できる場合は、インキュベーションを最大45日間増やします。OD600 の増加は、細菌がスチレンを代謝できることを示しています。</li>
</ol>3. 細菌分離株によるカテコール分解のスクリーニング
注:スチレン、ベンゼン、キシレン、ナフタレン、フェノールなどの芳香族炭化水素の分解は、反応中間体としてカテコールを生成します。カテコールは、それぞれオルト切断経路およびメタ切断経路を介して、カテコール1,2-ジオキシゲナーゼおよびカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ酵素の助けを借りて細菌によってさらに代謝される26。これらの酵素は、クロロベンゼン27などの他の炭化水素の分解にも関与しています。以下に述べるプロトコルは、カテコール2,3−ジオキシゲナーゼ酵素アッセイ28のために全細胞ライセートを使用する。同じ溶解法を用いて、カテコール1,2−ジオキシゲナーゼの活性をスクリーニングすることができる。しかしながら、反応混合物の組成は変化するであろう。両方の酵素は本質的に誘導性であり、増殖培地へのフェノールの添加によって誘導することができる。
<ol><li>滅菌ループの助けを借りて、縞模様の新鮮なプレートから1〜4 mMのフェノールを添加したミネラル塩培地(MSM)に細菌コロニーを接種します。培養液を30°Cおよび200rpmでインキュベートします。OD600 が1.4〜1.6の間に達すると(すなわち、指数関数的後期に)、4500 x g で20分間回転させることにより、4°Cで培養物を収穫します。</li>
	<li>細胞ペレットをリン酸緩衝液(0.5 M、pH 7.5)で洗浄します。</li>
	<li>細胞を上記のリン酸緩衝液に再懸濁し、最終OD600 ≈ 1.0に調整します。</li>
	<li>1.5分間パルス超音波処理によって細胞を溶解し、各パルスの持続時間は15秒である。このステップの後、懸濁液は透明または濁りの少ないものでなければなりません。そうでない場合は、パルス数を増やして、サスペンションがクリアかどうかを確認します。各パルスの後、タンパク質の分解を避けるためにサンプルを氷上に保ちます。</li>
	<li>低温(4°C)を維持しながら、9,000 x g で30分間遠心分離することにより、細胞破片と壊れていない細胞を取り除きます。</li>
	<li>透明な上清を注意深くピペットで入れます。この画分は、酵素アッセイ用の粗抽出物を有する。</li>
	<li>粗抽出物のタンパク質濃度をブラッドフォードまたはローリーの方法29,30のいずれかで決定します。</li>
	<li>カテコール2,3-ジオキシゲナーゼの活性を測定するために、分光光度計によって反応最終生成物(2-ヒドロキシムコンセミアルデヒド)の形成を測定する。</li>
	<li>20 μLのカテコール(50 mM)、960 μLのリン酸緩衝液(50 mM、pH 7.5)、および20 μLの粗抽出物を加えて反応混合物を調製します。</li>
	<li>陰性対照の場合は、粗抽出物をリン酸緩衝液に交換し、最終容量を1 mLに調整します。</li>
	<li>反応混合物を30分間インキュベートする。設定した時間間隔で、375 nmの吸光度を測定します。吸光度の増加は、反応最終生成物である2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド(2-HMS)の形成を示す。三重に分けて実験を行います。 注意: カテコールは光に敏感で酸素に敏感です。反応混合物を暗所に保管し、カテコールの自然な分解を防ぐためにチューブをしっかりと閉じます。.</li>
</ol>4. 純粋培養のゲノムDNA単離
注:これは、ゲノムDNAを単離するための一般的なプロトコルです。グラム染色は、サンプルの収集、処理、および分析ステップ中に実行されました。グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞壁の厚さがばらつくため、それに応じて細胞溶解法が変更されます。分離中は手袋を着用し、ヌクレアーゼがDNAを分解しないように70%エタノールで作業台を消毒します。下記の化学物質のいくつかは、皮膚に重度の火傷を引き起こす可能性があるため、取り扱いには適切な注意を払う必要があります。
<ol><li>グラム陰性菌からのゲノムDNAの単離31.<ol><li>単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。</li>
		<li>チューブを200 rpmのインキュベーターシェーカーに入れ、細菌を30°Cで一晩増殖させます。</li>
		<li>翌日、1.5 mLの培養液を12,400 x g で3分間一晩発酵させます。</li>
		<li>上清を除去し、ペレットを200 μLの溶解バッファー(40 mM トリス酢酸、pH 7.8、20 mM 酢酸ナトリウム、1 mM EDTA、1% SDS)に再懸濁します。</li>
		<li>66 μLのNaCl溶液(5 M)を加えてよく混ぜます。</li>
		<li>得られた混合物を12,400 x g で10分間(4°C)ペレット化します。</li>
		<li>透明な上清を新鮮な微量遠心チューブでピペットで送り、等量のクロロホルムを加えます。</li>
		<li>乳白色の溶液が観察されるまで、溶液を複数回反転混合します。</li>
		<li>12,400 x g で3分間スピンし、上清をきれいなバイアルに移します。</li>
		<li>氷冷した100%エタノール1mLを加えます。DNAの白い鎖が沈殿するまで反転によって混合します。</li>
		<li>沈殿したDNAを2,200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
		<li>DNAペレットを1 mLの70%エタノールで洗浄し、DNAペレットを室温で5分間乾燥させます。</li>
		<li>乾燥後、ペレットを100 μLの1x Tris-EDTA(TE)バッファーに再懸濁し、DNAを-20°Cで保存します。</li>
		<li>分光光度計を使用して濃度(A260/280)を測定し、アガロースゲル(1%)上でDNAを走らせてDNA24の品質を評価します。</li>
	</ol></li>
	<li>グラム陽性株からのゲノムDNAの単離32<ol><li>単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。</li>
		<li>チューブを200 rpmのインキュベーターシェーカーに入れ、適切な成長温度で細菌を一晩増殖させます。</li>
		<li>翌日、増殖した培養液1.5 mLを取り、8,600 x g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を除去し、細胞をTEバッファーに再懸濁します。</li>
		<li>TEバッファーでOD600 = 1.0を調整し、740 μLの細胞懸濁液を清潔な微量遠心チューブに移します。</li>
		<li>20 μLのリゾチーム(100 mg/mLストック)を加え、ピペッティングでよく混ぜます。37°Cで30分間インキュベートします(ドライバス中)。</li>
		<li>40 μLの10%SDSを添加し、よく混合します。</li>
		<li>8 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL) を加えます。よく混合し、56°Cで1〜3時間(ドライバス中で)インキュベートします。懸濁液は粘度が上がると透明になり、効率的な細胞溶解を示すはずです。 注:細胞が適切に溶解されていない場合は、懸濁液を一晩放置することができます。</li>
		<li>CTAB/NaCl混合物を65°C(ドライバス中)で予熱し、この混合物100 μLを細胞懸濁液に加えます。よく混ぜる。</li>
		<li>65°Cで10分間インキュベートします(ドライバス中)。</li>
		<li>クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)500 μLを加え、よく混ぜます。16,900 x g で 25 °C で 10 分間回転させます。</li>
		<li>有機相(底部の粘性相)を避けて、水相を新鮮な微量遠心チューブに移します。</li>
		<li>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)500μLを慎重に加え、よく混ぜます。16,900 x g で 25 °C で 10 分間回転させます。</li>
		<li>水相を新鮮な微量遠心チューブに入れます。クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)500 μLを加え、よく混ぜます。</li>
		<li>水相を移し、0.6容量のイソプロパノールを加える(-20°Cで予冷)。</li>
		<li>沈殿したDNA鎖は糸状の形で見えなければなりません。-20°Cで2時間から一晩インキュベートします。</li>
		<li>16,900 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離し、DNA をペレット化します。</li>
		<li>イソプロパノールを注意深くデカントし、ペレットを1 mLの冷70%エタノール(-20°Cで予冷)で洗浄して不純物を取り除きます。</li>
		<li>16,900 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 上清を捨てる。</li>
		<li>ペレットを室温で20分間乾燥させるか、チューブを37°Cに保ちます。 ペレットが過度に乾燥していないことを確認してください。</li>
		<li>100 μLの1x TEバッファーに再懸濁し、DNAを-20°Cで保存します。 注:ペレットが過剰に乾燥し、再懸濁が困難な場合は、マイクロ遠心チューブをDNAペレットとヌクレアーゼフリー水で37°Cで15〜20分間インキュベートし、ピペッティングで再度懸濁します。</li>
		<li>1x TEバッファーで1:100に希釈した後、分光光度計を使用して濃度(A260/280)を測定し、DNAをアガロースゲル(1%)上で実行してDNA24の品質を評価します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 16S rRNAシーケンシング
注:以下に概説するプロトコルは、細菌同定のための16S rRNAの増幅およびシーケンシング用です。16S rRNA配列に由来する情報は、未知の生物の同定および異なる生物間の関連性を見つけるために使用されます。
<ol><li>菌株を同定するには、細菌の16S rRNA配列を標的とするユニバーサルプライマー(27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')および1492R(5'-TACGGYTACCTTTTTACGACTT-3')33を用いて、純粋な細菌培養物から単離したDNAをPCRで増幅します。</li>
	<li>18 μLのオートクレーブ/ヌクレアーゼフリー水、2.5 μLの10xバッファー、0.5 μLのフォワードプライマーとリバースプライマー(100 μMストック)、2 μLのdNTPミックス(100 μMストック)、1 μLのDNAテンプレート(2-15 ng/μL)、および1 Uの Taqポリメラーゼを使用して、氷上でPCRミックス(25 μL反応)を調製します。</li>
	<li>16S rRNA遺伝子増幅には、94°Cで10分間の初期変性、(94°Cで40秒間の最終変性、56°Cで1分間のプライマーアニーリング、74°Cで2分間の伸長)x 30サイクル、74°Cで10分間の最終伸長。</li>
	<li>サイクルが終了したら、5 μLのサンプルと1 μLの5x DNAローディング色素を混合します。1%アガロースゲル上で実行して、増幅を検証します。PCR産物は4°Cで短期間保存するか、さらに使用するまで-20°Cで凍結します。</li>
	<li>16S rRNA遺伝子シーケンシングでは、大容量(100 μL)に対して上記と同じ反応を設定します。</li>
	<li>PCR産物精製キットを使用してサンガーシーケンシング24,34用のアンプリコンを精製するか、サンプル全体をDNAローディング色素と混合し、アガロースゲルにロードしてゲル抽出法を実行します。</li>
	<li>シーケンシングが完了したら、結果ファイルをFASTA形式に変換し、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)35の基本的なローカルアラインメント検索ツール(BLAST)で配列の類似性を確認します。</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

実験室6では、地球上の細菌の約1%しか容易に培養できないことは十分に確立されています。培養可能な細菌の中でも、多くは特徴付けられていないままです。分子法の改良は、細菌群集の分析と評価に新しい次元を与えました。ただし、このような手法には制限がありますが、培養分析が冗長になるわけではありません。個々の細菌種を単離するための純粋な培養技術は、生理学的特性の特性評価のための主要なメカニズムであり続けています。土壌と水生生物の生息地には、バイオテクノロジーの用途に利用できる新しい酵素と経路を持つ多くの細菌が生息しています。この研究では、生態学的サンプルからの細菌の分離と特性評価のための簡単で安価な方法について説明します。
細菌が異なれば栄養要件も異なるため、多様な細菌種を分離する可能性を高めるために、さまざまな増殖培地が使用されました。この方法の主な制限の1つは、厳格な成長要件を持つ微生物が除外される可能性があることです。また、このステップの主な目的は、サンプルから得られる細菌種の数を最大化することです。サンプルライブラリ内の細菌種の数は、バイ...

炭化水素(HC)は、燃料としても化学用途でも広く使用されています。溶媒1としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素が広く用いられている。エチレンおよびプロピレンなどのアルケンは、それぞれポリエチレンおよびポリプロピレンポリマーの合成における前駆体として役立つ。他の炭化水素の重合、スチレンはポリスチレンを形成する。人為的活動は、その生産および輸送中に炭化水素を環境に導入します。土壌や水の炭化水素汚染は、環境と人間の健康に深刻な懸念を抱いています。微生物は、生物地球化学的循環を調節し、汚染物質や生体異物を含む幅広い基質を利用して炭素やエネルギー源に変換することにより、生態系を維持する上で主要な役割を果たしています。微生物による環境汚染物質の解毒のこのプロセスは、バイオレメディエーション3、4、5、6、7として知られています。
炭化水素を分解する能力を持つ微生物は、水生および土壌の生息地で見られます8,9,10。シュードモナス、アシネトバクター、ロドコッカス、マリノバクター、オレイバクター11など、アルカンや芳香族HCを分解する可能性のある多くの細菌が確認されています。技術的に高度な培養に依存しないアプローチの開発は、新しいHC分解微生物群集の発見に役立っています12。ソースサンプルから直接分離されたゲノム材料は、次世代シーケンシング(NGS)などのハイスループット法によって増幅およびシーケンシングされ、その後分析されるため、微生物を培養する必要がなくなります。メタゲノム解析などのNGS法は高価であり、増幅プロセスに関連する欠点に悩まされている13。炭化水素分解微生物の分離を標的とする選択的濃縮培養14などの培養技術は、研究者が細菌分離株の代謝経路を調査および操作できるようにするため、依然として有用です。
ゲノムDNAの単離とそれに続くゲノム材料の配列決定により、あらゆる生物に関する貴重な情報が明らかになります。全ゲノムシーケンシングは、抗生物質耐性、潜在的な薬物標的、病原性因子、トランスポーター、生体異物代謝酵素などをコードする遺伝子の同定に役立ちます15,16,17。16SrRNAコード遺伝子の配列決定は、細菌の系統発生を特定するための堅牢な技術であることが証明されています。長年にわたる遺伝子配列と機能の保存により、未知の細菌を同定し、分離株を最も近い種と比較するための信頼できるツールになります。また、この遺伝子の長さはバイオインフォマティクス解析に最適である18。これらすべての特徴に加えて、ユニバーサルプライマーを使用した遺伝子増幅の容易さと遺伝子シーケンシング技術の改善により、微生物の同定のゴールドスタンダードとなっています。
ここでは、環境試料からHC分解能を有する培養可能な微生物を回収する手順について述べる。以下に説明する方法は、HC分解細菌の収集と同定の概要を示しており、(1)水サンプルからの細菌の収集、(2)純粋培養物の分離、(3)細菌分離株のHC分解能力の探索、(4)ゲノムDNAの分離、および(5)16S rRNA遺伝子シーケンシングとBLAST分析に基づく同定の5つのセクションに分かれています。この手順は、多くの異なるバイオテクノロジー用途のために細菌を単離するために適応させることができます。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>ミリポア</td><td>1016141000</td><td>固体培地調製</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl<サブ>2</サブ>)</td><td>MERCK</td><td>C4901-500G</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>Catechol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>135011</td><td>炭化水素分解アッセイ</td></tr><tr><td>臭化セチルトリメチルアンモニウム、CTAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>HIMEDIA</td><td>MB109</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>gDNA 緩衝液成分</td></tr><tr><td>硫酸第一鉄、七水和物 (FeSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215422</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>成長培地コンポーネント。グリセロール株</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>HIMEDIA</td><td>MB063</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>Difco</td><td>244520</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>MERCK</td><td>M2643</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>硫酸マンガン(II)一水和物(MnSO4。H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221287</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>栄養ブロス (NB)</td><td>メルク (ミリポア)</td><td>03856-500G</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>メルク</td><td>91249-500G</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>フェノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td><td>ゲノム DNA 分離</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、二塩基性 (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>増殖培地成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>増殖培地成分</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2546</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>160016235</td><td>DNA精製</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>163038783</td><td>DNA精製</td></tr><tr><td>R2A 寒天</td><td>ミリポア</td><td>1004160500</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度計</td><td>BIO-RAD</td><td>4006221</td><td>吸光度測定</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>増殖培地成分</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>ゲノムDNA単離</td></tr><tr><td>スチレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td>スチレン生分解</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0273X</td><td>16s rRNA PCR</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td>ゲノムDNA</td></tr><tr>の再懸濁<td>トリプチン性大豆ブロス(TSB)</td><td>メルク</td><td>22092-500G</td><td>成長培地</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Y1625-1KG</td><td>成長培地成分</td></tr><tr><td>亜鉛硫酸塩七水和物(ZnSO<サブ>4</サブ>.7H<サブ>2</サブ>0)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>221376</td><td>成長培地成分</td></tr></tbody></table>

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

炭化水素汚染物質は劣化に抵抗性があり、環境への蓄積はすべての生命体に有毒です。細菌は多数の触媒酵素をコードし、自然に炭化水素を代謝することができます。科学者は、水生生態系の生物多様性を利用して、生分解とバイオレメディエーションの可能性がある細菌を分離します。環境からのこのような単離物は、代謝経路および酵素の豊富なセットを提供し、これらはさらに、工業規模で分解プロセスをスケールアップするために利用することができる。この記事では、水生生息地からの細菌種の分離、繁殖、および同定の一般的なプロセスの概要を説明し、簡単な手法を使用してin vitro で炭化水素を唯一の炭素源として利用する能力をスクリーニングします。本プロトコルは、16S rRNA分析を用いた様々な細菌種の単離およびその後の同定を記載する。このプロトコルは、細菌分離株の炭化水素分解の可能性を特徴付けるためのステップも提示しています。このプロトコルは、バイオテクノロジーアプリケーションのために環境生息地から細菌種を分離しようとする研究者に役立ちます。

水生生息地からの細菌の単離とスクリーニング、およびその後の16S rRNA分析による同定の手順全体を概説した概略図を図1に示します。インドのダドリの湿地からの水サンプルは、滅菌ガラス瓶に集められ、すぐに処理のために実験室に運ばれました。サンプルを孔径0.22μmのフィルターシートに通し、ろ紙を異なるメディアプレートに接触させた。2時間後、濾紙を除去し、コロニー形成のためにプレートを30°Cで一晩インキュベートした(図2)。翌日、個々の細菌コロニーを選択し、新鮮な培地プレート上にストリークしました(図2)。生成された純粋な培養物は保存され、その後さらなる分析に使用された。この方法を使用して、100を超えるユニークな細菌分離株のライブラリを作成することができました。私たちは、炭化水素、特に使い捨てプラスチックの主成分であるスチレンを利用できる細菌分離株を特定することを目的としていました。単離された細菌は、唯一の炭素源として液体スチ...

水生生物の生息地から炭化水素分解細菌を分離、増殖、および特性評価するプロセスを紹介します。このプロトコルは、細菌の分離、16S rRNA法による同定、およびそれらの炭化水素分解の可能性のテストの概要を示しています。この記事は、研究者が環境サンプル中の微生物の生物多様性を特徴付け、特にバイオレメディエーションの可能性がある微生物をスクリーニングするのに役立ちます。

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

このプロトコルは、生態学的生息地からの炭化水素分解微生物の分離、培養、および同定の概要を示しています。この方法は、高度な機器を必要とせず、標準的な実験室のセットアップで簡単に実行できます。また、他の基質の研究にも簡単に適合させることができます。この技術は、さまざまな生態学的ニッチに簡単に変換でき、さまざまな基質の分解を評価できます。手順を実演するのは、リチャ・プリヤダルシニ博士の研究室の博士課程の学生であるディーパ・セティです。まず、異なる水域の場所から5つの滅菌ガラス瓶に500ミリリットルの水サンプルを収集し、各サンプルのpHと温度を測定します。次に、無菌条件下でサンプルを100ミリリットルのバッチで0.22ミクロンの孔径フィルターシートでろ過します。そして、シートを異なる栄養培地プレートの上に置き、プレートごとに1枚の紙を置きます。2時間後、滅菌鉗子を使用して紙をはがします。次に、回収した水サンプル100マイクロリットルを滅菌二重蒸留水900マイクロリットルに加えて、ろ過されていない水サンプルを希釈します。1対1, 000, 000の希釈比に達するまで10倍希釈を続けます。ピペッティングで混合し、各希釈液の最終容量が1ミリリットルになるようにします。100マイクロリットルの希釈水サンプルを、すべての増殖培地プレートに個別に3回に分けて広げます。コロニーの成長に応じて、プレートを摂氏30度で24〜48時間インキュベートします。コロニーを分離するには、滅菌爪楊枝またはピペットチップを使用してコロニーを選択します。象限ストリーキングを実行し、プレートを一晩インキュベートします。翌日、色、質感、形状、サイズ、余白、標高などの形態学的特徴に基づいてコロニーをスクリーニングします。純粋な培養物を得るためにコロニーを再ストリークします。各純培養物のグラム染色を行った後、3ミリリットルの適切な増殖培地に単一のコロニーを接種し、摂氏30度でインキュベートすることにより、グリセロールストックを調製します。翌日、700マイクロリットルの一晩培養物と300マイクロリットルの100%グリセロールをクライオバイアルに加える。長期保存のためにバイアルを摂氏マイナス80度で凍結します。縞模様のプレートからコロニーを選び、5ミリリットルのトリプシック大豆ブロスまたは栄養ブロスに接種します。吸光度が約2に達するまで、200 RPMで振とうしながら、摂氏30度で一晩培養物を成長させます。翌日、細胞をペレット化します。上清を捨て、ペレットを2ミリリットルのオートクレーブ生理食塩水で2回洗浄する。細胞を再度回転させ、ペレットを2ミリリットルの液体カーボンフリー基礎培地(LCFBM)に再懸濁し、吸光度を測定します。次に、2つの滅菌150ミリリットル三角フラスコをAおよびBとしてラベル付けし、それぞれ対照群および実験群について示す。フラスコAに、40ミリリットルのLCFBMを加え、続いて5ミリモルの最終濃度のスチレンを加える。フラスコBに、35ミリリットルのLCFBMとスチレンを加えます。次に、最終吸光度が約0.1の細胞懸濁液を追加します。フラスコBの容量をLCFBMで40ミリリットルにした後、両方のフラスコを摂氏30度で200RPMで30日間振とうしながらインキュベートします。各フラスコの吸光度を5日毎に測定し、成長曲線をプロットした。細菌がスチレンを利用できる場合は、インキュベーションを最大45日間増やします。吸光度の増加は、細菌がスチレンを代謝できることを示しています。グラム陰性菌からゲノムDNAを単離するには、単一のコロニーを選び、滅菌試験管内の新鮮な増殖培地に接種します。振とうインキュベーター内で一晩インキュベートした後、増殖した培養物を1.5ミリリットルペレット化する。上清を除去し、ペレットを200マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。次に、66マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム溶液を加え、よく混ぜます。得られた混合物を遠心分離した後、透明な仰臥位を新鮮なマイクロ遠心管でピペットで送り、等量のクロロホルムを加える。乳白色の溶液が観察されるまで、溶液を複数回反転させて混合します。チューブを再度回転させ、上清をきれいなバイアルに移します。次に、氷冷した100%エタノール1ミリリットルを加え、反転させて混合し、白いDNA鎖が沈殿するまで混ぜます。沈殿したDNAを遠心分離します。上清を捨てる。そしてペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗浄する。洗浄液を廃棄した後、DNAペレットを室温で5分間乾燥させます。乾燥したら、ペレットを100マイクロリットルのTris-EDTAバッファーに再懸濁します。分光光度計を使用してDNA濃度を測定し、1%アガロースゲル上でDNAを実行してその品質を評価します。株を同定するには、細菌の16SリボソームRNA配列を標的とするユニバーサルプライマーを用いて、純粋な細菌培養物から単離されたDNAをPCRによって増幅します。氷上で25マイクロリットルのPCRミックスを準備し、1マイクロリットルのDNAテンプレートを追加し、遺伝子増幅のサイクリング条件を設定します。PCR後、5マイクロリットルのサンプルを1マイクロリットルの5倍DNAローディング色素と混合します。そして、それを1%アガロースゲル上で実行して、増幅を検証します。16Sリボソームの場合、rNA遺伝子配列決定は、先に述べたのと同じ反応を、しかしより高い量で設定する。次に、サンガーシーケンシング用のアンプリコンを精製し、サンプル全体をDNAローディング色素と混合し、アガロースゲルにロードしてゲル抽出法を実行します。シーケンシングが完了したら、結果ファイルをより高速な形式に変換し、NCBIのBLASTツールを使用してシーケンスの類似性を確認します。インドのダドリの湿地からの水サンプルから分離された細菌コロニーがここに示されています。単離された細菌は、液体スチレンを唯一の炭素源として、それぞれの培地で個別に増殖させた。細菌分離株の炭化水素分解電位を、カテコール分解アッセイを用いて評価した。単離株の1つの代表的なアッセイをここに示します。ゲノムDNAの完全性は、アガロースゲル上の小さなDNAサンプルを視覚化することによって確認されました。そして16SリボソームrNA遺伝子をユニバーサルプライマーを用いて増幅した。湿地から分離されたエクシグオバクテリウム株と既知のエクシグオバクテリウム種との関連性を示すために系統樹が構築されました。プロトコルの重要なステップは、テスト対象の基板の使用率を確認することです。成長特性によっては、微生物が試験対象の基質の利用にすぐに適応しない場合があり、濃縮プロセスが必要になる場合があります。この方法は、環境サンプル中の培養可能な細菌集団に焦点を当てています。研究者はさらに、細菌の全ゲノム配列決定や代謝プロファイリングなどの実験を実行して、炭化水素分解に関与する遺伝子と経路に関する貴重な洞察を提供することができます。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

環境bacterioplanktonは、有機炭素（DOC）化合物とDNA標識試薬、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を溶解モデルとインキュベートされています。その後、DOC分解細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して自身の昇格BrdUの取り込みに基づいてバルクコミュニティから分離されています。これらの細胞は、その後の分子生物学的解析によって識別されます。...

ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton

出典: Ghadigaonkar、D.およびRath、A.水系抗生物質耐性菌の単離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価。 J. Vis. 経験。...

分子分析のための水サンプルからの抗生物質耐性菌の単離

出典: Villela, H. D. M. ほか 生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp.

海洋細菌の汚染分解菌株の分離スクリーニング

出典: Villela, H. D. M. ほか生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp.

海水サンプルから選抜的に分解する海洋細菌の濃縮と分離

汚染はすべてのバイオームに影響を与える。海洋環境は特に影響を受けており、特に地球上で最も敏感な生態系の一つであるサンゴ礁が影響を受けています。バイオレメディエーションは、汚染物質を分解する生物の能力です。ここでは、サンゴのバイオレメディエーション能力と潜在的なプロバイオティクス特性を提示する微生物を分離および試験する方法論について説明する。...

メタ生物研究と保存のためのバイオレメディエーションおよびプロバイオティクス開発のための微生物株の探知

地熱泉からの重金属耐性微生物の単離は、バイオレメディエーションおよび環境モニタリングバイオシステムの開発にとってホットな話題である。この研究は、温泉から重金属耐性菌を単離し同定するための方法論的アプローチを提供する。...

環境汚染に対処するための極限環境微生物のバイオプロスペクティング

ここでは、水からの抗生物質耐性菌の分離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子(ARG)の分子特性評価のための詳細なプロトコルを紹介します。培養ベースおよび非培養ベース(メタゲノム解析)技術の使用は、インドのムンバイからの淡水に存在する細菌の多様性全体とさまざまなARGの総プールに関する完全な情報を提供します。...

水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価

これは、ヨーロッパサンショウウオ(Speleomantes genus)の皮膚微生物叢から培養可能な細菌を採取し、単離する方法です。...

陸生両生類の皮膚からの細菌株の単離と同定

ここでは、シアノファージ(およびその宿主)を単離するための海洋および淡水生態系のユーフォティックゾーンからのサンプリング方法と、単一の遺伝子型を濃縮し、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクスを特徴付けるサンプリング後のプロセスについて説明します。...

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

野生動物は、一般的にさまざまな蠕虫に寄生されます。蠕虫には、主に "回虫" (線虫)、"トゲトゲミズ" (Acanthocephalans)、"吸虫" (吸虫)、"条虫" (条虫) の 4 種類があります。ここでは、脊椎動物から蠕虫を採取する方法と、蠕虫の保存方法と分類学的識別方法について説明します。...

野生生物からの蠕虫の収集と同定

学ぶ 水生生物生息地から炭化水素代謝細菌を単離・増殖・同定する方法。16S rRNAを用いた細菌種の同定とバイオレメディエーションへの応用可能性を評価する標準的な実験室プロトコルです。

水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

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