Name: 透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学ぶ 連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用手法。細胞膜透過性をリアルタイムで電気的にモニタリングし、最適なパルス条件を決定することで、効率的な細胞導入を実現します。

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著者らは、全米科学財団(NSF CBET 0967598、DBI IDBR 1353918)および米国教育省の精密および個別化医療の新興分野における大学院トレーニング(P200A150131)による、大学院生J.J.S.のフェローシップへの資金提供に対する財政的支援に感謝したいと思います。

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<li>Nuxoll, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMEMS+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">BioMEMS in drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).</li>
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<li>Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nano-localized single-cell nano-electroporation.</a> Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).</li>
<li>Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pulse+duration+on+localized+single-cell+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation.</a> Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).</li>
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<li>Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+arrays+with+real-time+monitoring+and+feedback+control%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control.</a> Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).</li>
<li>Ye, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+and+real-time+electrical+monitoring+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%222020+33rd+Ieee+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28Mems+2020%29%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip.</a> 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).</li>
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<li>Guo, X. L., Zhu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+in-situ+cell+electroporation+with+cell+positioning+and+impedance+monitoring+using+micro+electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+through+device+for+simultaneous+dielectrophoretic+cell+trapping+and+AC+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Wang, H. Y., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+delivery+of+small+molecules+and+genes+into+cells+using+a+common+DC+power+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).</li>
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<li>Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+electroporation+detection+methods+-+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro electroporation detection methods - An overview.</a> Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).</li>
<li>MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU. , Available from: 
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<li>SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf">https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf</a> (2001).</li>
<li>Substrate Preparation. MicroChemicals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf">https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLisinenkova%2C+M+%224M+2006+-+Second+International+Conference+on+Multi-Material+Micro+Manufacture%22">4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture</a>. , Elsevier. 91-94 (2006).</li>
<li>Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS-glass+bonding+using+grafted+polymeric+adhesive+-+alternative+process+flow+for+compatibility+with+patterned+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).</li>
<li>PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf">https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf</a> (2021).</li>
<li>Lissandrello, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+continuous-flow+microfluidic+electroporation+of+mRNA+into+primary+human+T+cells+for+applications+in+cellular+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18045(2020).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコル内で提示される方法論は、主にマイクロ流体デバイスの微細加工に焦点を当てており、その後、特殊なエレクトロポレーション実験セットアップに統合されます。微細加工プロセスの詳細を説明するときによく使用される「レシピ」という用語は、機能するデバイスを正常に製造するために各ステップに従う/最適化することの重要性を示唆しています。ただし、UV露光時間/エネルギー、PVDスパッタリング速度/持続時間、酸素プラズマ発生器の設定など、最適化されていない場合、プロセス内の特定の重要なステップは、製造プロセスとエレクトロポレーション実験の成功の両方にとって問題になる可能性があります。製造プロセスのトラブルシューティングは、主に試行錯誤またはより制御された実験計画法の実験計画によって行われます。さらに、ディープリアクティブイオンエッチング(DRIE)などの代替微細加工技術があり、プロトコル内のさまざまなステップを実行するために置き換えることができます(つまり、DRIEエッチング成形構造を使用してソフトリソグラフィプロセスを実行します)。さらに、レシピの最適化とデバイスの設計/製造は、この分野の初心者にとって時間がかかる可能性があります。ただし、微細...

CAR-T(キメラ抗原受容体改変T細胞)細胞療法やCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復DNA配列)/Cas9を使用した遺伝子編集など、生物医学研究における現在の治療革新は、外因性物質を細胞内空間にうまく効率的に送達する能力に大きく依存しています1。CAR-T療法において、細胞治療製造における遺伝子送達工程を行うゴールドスタンダードは、ウイルスベクター2を用いることである。ウイルス媒介遺伝子送達は効率的な送達モダリティであるが、いくつかの欠点もある。これらには、製造コスト、細胞毒性、免疫原性、突然変異誘発/腫瘍形成の可能性、および送達される遺伝子のサイズ制限が含まれます3。これらの制限は、代替の非ウイルス送達技術の研究開発につながっています。
ウイルスを介した遺伝子送達に代わるエレクトロポレーションは、細胞のDNA、RNA、およびタンパク質トランスフェクションを実行するために、最適な電気パルス波形の適用に依存しています。外部電界の適用後、細胞膜は一時的に損なわれ、細胞は、そうでなければ不透過性の外因性物質の細胞内送達の影響を受けやすくなる4。ウイルス媒介送達と比較して、エレクトロポレーションは、一般的に安全で、操作が容易で、運用コストが低いため、有利です。エレクトロポレーションは、低分子と高分子の両方の貨物を送達でき、系統に関係なく細胞のトランスフェクションに効率的です5。エレクトロポレーション後に望ましい結果、すなわち良好な生存率と良好なエレクトロトランスフェクション効率を達成するには、さまざまな実験パラメータを共最適化する必要があります。これらには、細胞タイプ6、細胞密度、分子濃度7、エレクトロポレーションバッファー特性(分子組成、導電率、浸透圧など)8、電極サイズ/形状9、および電気パルス波形(形状、極性、パルス数)10 が含まれます(図 1 を参照)。これらの各パラメータはエレクトロポレーション実験の結果に大きな影響を与える可能性がありますが、印加されたパルスの電気エネルギーが、結果として生じる細胞生存率とエレクトロトランスフェクション効率との間の固有のトレードオフの根源であるため、パルス波形は特に詳細に研究されています8。
通常、エレクトロポレーション実験はマクロスケールで行われ、細胞はエレクトロポレーションキュベット内の大きな平行平板電極のセットの間に数百マイクロリットルのバッファーに懸濁されます。電極は通常、電極距離が1〜4mmのアルミニウムで製造されます。細胞がピペットで手動でロードされると、キュベットはかさばる電気パルス発生器に電気的に接続され、ユーザーはパルス波形パラメータを設定して適用し、細胞懸濁液をエレクトロポレーションすることができます。マクロスケールまたはバルクエレクトロポレーションは細胞密度&gt;106 cells/mLを処理できますが、この機能は電気パルス波形設定を最適化するときに無駄になる可能性があります。これは、細胞集団数が制限される可能性のある初代細胞タイプをエレクトロポレーションする場合に特に懸念される。さらに、電極間の距離が大きいため、パルス発生器は電界強度&gt;1kV / cm11を達成するために大きな電圧を供給できなければなりません。これらの高電圧は、電解質バッファーを介した抵抗性電力散逸を引き起こし、ジュール加熱をもたらし、結果として生じるセル生存率に有害であり得る12。最後に、細胞の高密度懸濁液に対してエレクトロポレーションを行うことは、結果として生じるエレクトロトランスフェクション効率と細胞生存率の生来の変動性を一貫して負担します。懸濁液中の各細胞は、周囲の細胞のために異なる電界強度を経験する可能性があります。経験した電界強度が増加するか減少するかに応じて、結果として生じる細胞の生存率または電気トランスフェクション効率はそれぞれ悪影響を受ける可能性があります11。マクロスケールのエレクトロポレーションのこれらの欠点は、マイクロスケールで動作し、単一細胞レベルでのより良い制御を可能にする代替技術の追求と開発につながっています。
BioMEMS、または生物医学マイクロ電気機械システムの分野は、マイクロエレクトロニクス業界で行われた技術の進歩に由来しています。具体的には、微細加工プロセスを利用して、バイオメディカル研究の進歩のためのマイクロデバイスを開発します。これらの進歩には、in vivo電気モニタリング用の微小電極アレイ13、in situエレクトロポレーション用の容量性微小電極14、小型化された臓器オンチップデバイス15、マイクロ流体ポイントオブケア診断16、バイオセンサー17、およびナノおよびマイクロエレクトロポレーションデバイス19,20,21を含む薬物送達システム18の開発が含まれます。.生物学的細胞と同じサイズスケールでデバイスを設計および製造する能力のために、ナノおよびマイクロエレクトロポレーション技術は、それらのマクロスケールの対応物と比較して有利である22,23。これらのエレクトロポレーションデバイスは、通常、数十から数百マイクロメートルの間隔の電極セットが統合されているため、高電圧パルスアプリケーションの要件を排除します。この機能により、電解液を流れる電流が大幅に減少し、有毒な電解生成物の蓄積とこれらのシステムでのジュール加熱の影響が減少します。マイクロスケールチャネルはまた、パルス印加中にはるかに均一な電界が細胞に確実に印加されることを保証し、より一貫した結果をもたらす24。さらに、マイクロエレクトロポレーションデバイスがマイクロ流体プラットフォームに統合されることも一般的であり、これは完全に自動化された技術への将来の統合に役立ち、細胞治療製造において非常に望ましい機能である25。最後に、マイクロスケールのエレクトロポレーションは、エレクトロポレーションイベントの電気的尋問を可能にする。例えば、細胞膜透過処理の程度は、単一細胞レベルでリアルタイムでモニターすることができる26、27。この方法の目的は、エレクトロポレーションプロトコルを最適化するために細胞膜透過の程度を測定できるマイクロ流体シングルセルマイクロエレクトロポレーションデバイスの微細加工、システム操作、および分析を説明することですが、以前の最先端よりもスループットを向上させます。
シングルセルレベルのエレクトロポレーションを実行することは、静的セルエレクトロポレーション技術の開発により2001年にRubinskyらによって最初に実証されたため、もはや新しい技術ではありません28。彼らのマイクロデバイスは、エレクトロポレーションのイベントを電気的に監視する能力を最初に実証したため、革新的でした。これにより、細胞膜透過の程度を並列に電気的に検出してデバイスのスループットを向上させることができる静的な単一細胞エレクトロポレーション技術の開発にさらにつながりました。ただし、並列化とバッチ処理を行っても、これらのデバイスは、単位時間29,30あたりに処理できるセルの総数を大幅に欠いています。この制限は、はるかに高いスループットで単一セルレベルのマイクロエレクトロポレーションを行うことができるフロースルーデバイスの開発につながった31。静的環境からフロースルー環境へのこのデバイス移行は、エレクトロポレーションパルスの適用後の細胞膜透過の程度を電気的に監視する能力を制限する。この研究で説明した方法は、これら2つの技術、つまり個々の細胞の細胞膜透過の程度を連続的に連続的に検出、パルス、および監視できるマイクロエレクトロポレーション技術の間のギャップを埋めます。
この技術は最近、Zhengらで説明されました。その作業では、この技術の機能は、エレクトロポレーションパルスの振幅と持続時間の両方を変化させ、細胞膜透過処理を示すその後の電気信号が調査されたパラメトリック研究の完了とともに導入されました32。結果は、エレクトロポレーションパルスの強度の増加(すなわち、印加電界の増加またはパルス持続時間の増加)が、測定された細胞膜透過処理の増加を引き起こすことを示した。系をさらに検証するために、エレクトロポレーションの成功を示す一般的な蛍光指標であるヨウ化プロピジウム33を細胞懸濁液に添加し、電気パルスを印加した直後に蛍光画像を撮影しました。光信号、すなわち細胞内のヨウ化プロピジウムの蛍光強度は、細胞膜透過度の電気的測定と強く相関し、この電気的測定の信頼性を検証した。しかし、この研究では、翻訳可能な重要性がほとんどまたはまったくないヨウ化プロピジウムの送達のみを考慮しました。
この研究では、生物学的に活性なプラスミドDNA(pDNA)ベクターを送達し、エレクトロポレーション後に再播種および培養された細胞の電気トランスフェクション効率を評価しながら、システムのスループットを改善するために、この技術の新しいアプリケーションを紹介します。以前の研究は、エレクトロポレーションのイベントを電気的に測定できる既存のマイクロエレクトロポレーション技術よりも優れていますが、デバイスの現在の状態では、細胞検出、パルス印加、および細胞膜透過測定を実行するために、電極セット間の長い細胞通過時間(~250ミリ秒)が必要です。単一チャネルでは、スループットが 4 セル/秒に制限されます。この制限に対処するために、細胞集団ベースのフィードバック制御エレクトロポレーションの新しい概念が導入され、pDNAエレクトロトランスフェクションが実行されます。低生理伝導率エレクトロポレーションバッファーを使用することにより、このシステムは、多数のエレクトロポレーションパルスアプリケーションにわたって単一細胞の電気的問い合わせを可能にします。次に、電気的応答に基づいて、「最適な」エレクトロポレーションパルスが決定されます。次に、「ハイスループット」モードが実装され、細胞膜透過処理の決定が無効になり、流量が増加し、エレクトロポレーションパルスデューティサイクルが細胞の通過時間に一致して、電極間を通過するセルあたり1パルスが保証されます。この作業では、マイクロデバイスの製造のための微細加工手順、実験を実行するために必要な材料/機器とそのセットアップ、およびデバイスの操作/分析とその電気トランスフェクション効率(eTE)について詳しく説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63103/63103fig01.jpg"> 図1:エレクトロポレーションの結果に影響を与える実験的要因 。 (左)細胞懸濁液-エレクトロポレーションの開始前に考慮すべき重要な要素には、ペイロード(この場合はpDNA)、濃度、細胞密度、およびエレクトロポレーションバッファーの特性が含まれます。考慮すべきエレクトロポレーションバッファーの特性は、導電率、浸透圧、およびこれらの値に寄与する正確な分子組成です。(中)パルスアプリケーション-正確なパルスタイプ(方形波対指数関数的減衰)およびパルス波形(単一パルス対パルス列)を最適化して、結果として得られる細胞生存率と電気トランスフェクション効率の両方を最大化する必要があります。エレクトロポレーションプロセスで実装される一般的なパルス列は、通常、一連の高電圧(HV)パルス、またはHVパルスと低電圧(LV)パルス振幅の間で回転する一連のパルスで構成されます。(右)細胞回収-下流処理ステップ、特に細胞が転送される回収細胞培養培地を最適化する必要があります。特徴のない(左端)、エレクトロポレーションプロセス全体の最適化のために、追加のアップストリームセル処理ステップを実装できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63103/63103fig1v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>直径150mmのシャーレ</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>ステップ6.1.1 ウェーハを固定</td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>ステップ10.3.6 エレクトロポレーションセル</td></tr><tr><td>33220A 波形/関数発生器</td><td>Agilent</td><td></td><td>ステップ9.2.3 エレクトロポレーションパルス発生器</td></tr><tr><td>4インチSiウェーハ</td><td>大学ウェーハ</td><td></td><td>サブセクション2.1マイクロ流体チャネル製造用</td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>ステップ8.1.8をプレート細胞</td></tr><tr><td>にAcetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td>ステップ<td>2.1.2クリーニング用および&nbsp;ステップ5.1フォトレジストリフトオフ</td></tr><tr><td>Allegra X-22R遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td>ステップ8.1.4、8.3.2.および8.3.細胞をスピンダウンする</td></tr><tr><td>AutoCAD 2018</td><td>オートデスク</td><td></td><td>サブセクション1.1.透明マスクを設計するには、</td></tr><tr><td>HF</td><td></td><td></td><td>エッチング</td></tr><tr><td>CCDモノクロ顕微鏡カメラ</td><td>浜松</td><td>オルカ285 C4742-96-12G04</td><td>ステップ11.2.3.イメージング</td></tr><tr><td>用CMOSカメラ-Sensicam QE 1.4MP</td><td>PCO</td><td></td><td>サブセクション9.3実験セットアップの一部</td></tr><tr><td>導電性エポキシ</td><td>CircuitWorks</td><td>CW2400</td><td>サブセクション 7.6. ワイヤー取り付け用</td></tr><tr><td>円錐形遠心分離チューブ用、15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>ステップ 8.1.4. 細胞遠心分離用</td></tr><tr><td>Dektak 3ST 表面形状測定装置</td><td>Veeco (Sloan/Dektak)</td><td></td> <td>ステップ 2.1.15 および 5.4 表面プロフィロメトリー用</td></tr><tr><td>使い捨て生検パンチ、0.75 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP075</td><td>ステップ 6.2.3 入口アクセス用</td></tr><tr><td>使い捨て生検パンチ、3 mm</td><td>Robbins Instruments</td><td>RBP30P</td><td>ステップ 6.2.3 アウトレット</td></tr><tr><td>アクセス DRAQ5</td><td>abcam</td><td>ab108410</td><td>ステップ 11.2.2. 生細胞染色</td></tr><tr><td>用 Dulbecco'のモディファイドイーグル」s 中</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>ステップ 8.1.2. 培地組成の一部</td></tr><tr><td>E3631A バイポーラ トリプル DC 電源</td><td>Agilent</td><td></td><td>ステップ 9.2.1.-9.2.2.実験セットアップの一部</td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Inverted&nbsp;マイクロスコープ</td><td>ニコン</td><td></td><td>&nbsp;サブセクション9.3。実験装置</td></tr><tr><td>EVG620 UV露光装置</td><td>EVG</td><td></td><td>の一部&nbsp;ステップ 2.1.9.および 2.2.7.紫外線曝露用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ニューロミクス</td><td>FBS001</td><td>ステップ 8.1.2. 培地組成の一部</td></tr><tr><td>FS20 超音波洗浄機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td><td>サブセクション 5.1. フォトレジスト・リフトオフ用</td></tr><tr><td>キャップ付きガラス製メディアボトル、100mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FB800100</td><td>ステップ 8.2.1. バッファー保存用</td></tr><tr><td>キャップ付きガラス製メディアボトル、500mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FB800500</td><td>ステップ8.1.2.培地保存用</td></tr><tr><td>HEK-293細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>サブセクション8.1細胞培養用</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>ステップ8.2.1エレクトロポレーション緩衝液の一部</td></tr><tr><td>ヘキサメチルジシラザン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>379212-25ML</td><td>ステップ2.2.3接着促進剤</td></tr><tr><td>HF2LIロックインアンプ</td>チュー<td>リッヒ機器</td><td></td><td>サブセクション9.2実験セットアップの一部</td></tr><tr><td>HF2TA電流増幅器</td><td>チューリッヒインスツルメンツ</td><td></td><td>サブセクション9.2実験セットアップの一部</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A459-1</td>クリーニング<td>用のステップ2.1.2、SU-8開発後のウェーハすすぎ用のステップ2.1.14、およびPDMS</td></tr><tr><td>IX81蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>のクリーニング用のステップ6.3.1ステップ11.2.3イメージング用</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G7513-20ML</td><td>ステップ8.1.2.培地組成の一部</td></tr><tr><td>M16878/1BFA 22ゲージワイヤーAWC</td><td></td><td>B22-1</td><td>サブセクション7.5 デバイス製造用</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337-100G</td><td>ステップ8.1.2エレクトロポレーションバッファー組成の一部</td></tr><tr><td>MF319開発者</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>10018042</td><td>ステップ 2.2.9. フォトレジスト現像</td></tr><tr><td>Microposit S1818 フォトレジスト</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>1136925</td><td>ステップ 2.2.4 電極パターニング用ポジフォトレジスト</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド, 75 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>ステップ 2.2.1 電極 ソーダライムガラス基板</td></tr><tr><td>モデル 2350 高電圧増幅器</td><td>TEGAM</td><td>2350</td><td>ステップ 9.2.5. 実験セットアップの一部</td></tr><tr><td>ナショナルインスツルメンツ LabVIEW ナショナル</td><td>インスツルメンツ</td><td></td><td>データ集録</td></tr><tr><td>ニードル、30G x 1 in</td><td>BD Scientific</td><td>305128</td><td>ステップ 10.1.1. システムの一部</td></tr><tr><td>PA90 IC オペアンプ 電源回路</td><td>Digi-key</td><td>598-1330-ND</td><td>カスタム回路の一部</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458-20ML</td><td>ステップ 8.1.2. メディア組成の一部</td></tr><tr><td>プラスミド pMAX-GFP</td><td>ロンザ</td><td>VCA-1003</td><td>ステップ 8.3.4. 細胞内送達用</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ、0.010'' x 0.030"</td><td>VWR</td><td>89404-300</td><td>ステップ 10.1.2. システムプライミング用</td></tr><tr><td>プラチナターゲット</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>サブセクション 4.2. 物理蒸着用</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td>ステップ 8.2.1.エレクトロポレーションバッファー組成の一部</td></tr><tr><td>ポンプ11 PicoPlusマイクロ流体シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>MA1 70-2213</td><td>ステップ10.1.4. PVD75のシステムプライミング用</td></tr><tr><td>物理蒸着システム</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>サブセクション4.1. 物理蒸着用</td></tr><tr><td>PWM32 スピナーシステム</td><td>ヘッドウェイ フォト</td><td></td><td>レジスト</td></tr><tr><td>による基板コーティングのステップ2.1.6および2.2.2PX-250 プラズマ処理システム</td><td>マーチ機器</td><td></td><td>PDMSおよびガラス基板接合用サブセクション7.2</td></tr><tr><td>SDG1025機能/波形発生器</td><td>Siglent</td><td></td><td>ステップ 9.2.2. 実験装置の一部</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>ステップ 8.2.1. エレクトロポレーションバッファー組成の一部</td></tr><tr><td>SU-8 2010 ネガフォトレジスト</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111053</td><td>ステップ 2.1.7. マイクロ流体チャネルパターニング用</td></tr><tr><td>SU-8現像液</td><td>Microchem</td><td>Y010200</td><td>ステップ 2.1.12. フォトレジスト現像用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td>ステップ 8.2.1. エレクトロポレーションバッファー組成の一部</td></tr><tr><td>シルガード 184 エラストマーキット</td><td>ダウ コーニング</td><td>3097358-1004</td><td>ステップ 6.2.1&nbsp; 10 : PDMS ポリマーと硬化剤の混合物 1</td> 個</tr><tr><td>シリンジ、1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>ステップ 8.3.4. システムプライミングの一部</td></tr><tr><td>SZ61 実体顕微鏡システム</td><td>オリンパス</td><td></td><td>サブセクション 7.3. チャンネルと電極のアライメント用</td></tr><tr><td>組織培養処理 T25 フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353108</td><td>ステップ 8.1.2 細胞培養用</td></tr><tr><td>チタンターゲット</td><td>Kurt J. Lesker</td><td></td><td>サブセクション 4.2. 物理蒸着用</td></tr><tr><td>透明マスク</td><td>CAD/ART サービス</td><td></td><td>ステップ 2.1.9. および 2.2.7. フォトリソグラフィー用</td></tr><tr><td>トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>ステップ 6.1.2. ウェーハのシラン化</td></tr><tr><td>用 トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td>ステップ 8.1.3. および 8.3.1. セルハーベスティング用</td></tr></tbody></table>

透過処理検出機能付き連続フローマイクロエレクトロポレーションシステムの構築と運用

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

CAR-T細胞療法などの現在の治療革新は、ウイルスを介した遺伝子送達に大きく依存しています。この技術は効率的ですが、製造コストが高いため、遺伝子導入に代替方法を使用することに関心が寄せられています。エレクトロポレーションは、遺伝子やその他の外因性物質の細胞内送達のための電気物理学的非ウイルス的アプローチです。電界を印加すると、細胞膜は一時的に細胞内への分子送達を可能にする。典型的には、エレクトロポレーションは、多数の細胞を処理するためにマクロスケールで実行される。ただし、このアプローチでは広範な経験的プロトコル開発が必要であり、初代細胞タイプやトランスフェクションが困難な細胞タイプを扱う場合はコストがかかります。長いプロトコル開発は、細胞を透過するのに十分な電界強度を達成するための大きな電圧の要件と相まって、マイクロスケールのエレクトロポレーションデバイスの開発につながりました。これらのマイクロエレクトロポレーションデバイスは、一般的な微細加工技術を使用して製造されており、高いスループット能力を維持する可能性のある、より優れた実験制御を可能にします。この研究は、連続フロー下で単一細胞レベルで細胞膜透過処理のレベルを検出できるマイクロ流体エレクトロポレーション技術を構築しています。しかし、この技術は毎秒4セルの処理に制限されていたため、システムのスループットを向上させるための新しいアプローチが提案され、ここで提示されます。この新しい手法は、細胞集団ベースのフィードバック制御と呼ばれ、さまざまなエレクトロポレーションパルス条件に対する細胞透過応答を考慮し、テスト対象の細胞タイプに最適なエレクトロポレーションパルス条件を決定します。次に、この「最適な」パルスが輸送中の細胞懸濁液に適用されるハイスループットモードが使用されます。デバイスの作製、マイクロ流体実験のセットアップと実行、および結果の分析の手順が詳細に示されています。最後に、このマイクロエレクトロポレーション技術は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドをHEK293細胞に送達することによって実証されます。

図4は、単一パルス振幅に対する単一細胞レベルの膜透過処理検出の背後にある動作原理を示しています。エレクトロポレーション実験の開始後、細胞検出アルゴリズムは、ポイントごとのスロープベースの検出方法を介して、細胞検出に最適な閾値を決定します。次に、システムは、セルの進入を示す測定された電流の有意な負の変化について(1)を継続的に監視します。これは、細胞が電極セットを通過するときにインピーダンスが瞬時に増加し、測定電流が急激に減少し、一貫した細胞検出が可能になり(2)、最終的にコンピューター制御パルスアプリケーションへの切り替えがトリガーされるなど、生物学的細胞膜の絶縁性によるものです(4)。絶縁セルは、電極間の電解質の体積を置換し、セルのサイズに比例した電流の低下をもたらします。この電流の変化はΔIC(3)と表されます。ΔIC計算の直後に、予め決定された、電気パルスが輸送中の細胞に投与される(4)。この瞬間的なエネルギーの流入により、システムに短時間のセンシングアーティファクトが導入されます(灰色のボッ...

このプロトコルでは、ラボオンチップのマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスを構築するために必要な微細加工技術について説明します。実験セットアップは、制御された単一細胞レベルのトランスフェクションを連続フローで実行し、集団ベースの制御により、より高いスループットに拡張することができます。細胞膜透過の程度をリアルタイムで電気的に監視する機能を示す分析が提供されます。

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

この方法により、研究者は、従来の経験的実験アプローチの必要性を最小限に抑えながら、目的の細胞タイプに最適なエレクトロポレーションパルス条件を決定することができます。この方法は、マイクロエレクトロポレーション技術を利用して、エレクトロポレーションプロセス全体を通して細胞膜透過の程度を電気的に監視することができるスケーラブルなマイクロ流体作動デバイスを製造する。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生であるキシャンクマールブシャです。まず、スピンコーターの真空システムを使用して、シリコンウェーハをウェーハスピンコーターのチャックに固定します。次に、スピナーをプログラムします。次に、シリコンウェーハの中央に4ミリリットルのSU-8 2010フォトレジストを塗布し、プログラムを実行します。システムが停止したら、掃除機をオフにします。次に、2Dマイクロ流体チャネル設計のフォトマスクをマスクホルダーに固定し、SU-8コーティングを上向きにしてシリコンウェーハをウェーハチャックに挿入します。露出設定を150ミリジュール/平方センチメートルに設定し、機械を稼働させます。UV露光後、シリコンウェーハをSU-8現像液に浸し、3〜4分間穏やかに攪拌します。次に、溶液からウェーハを取り出し、イソプロパノールで表面をすすぎます。次に、シリコンウェーハを摂氏150度のオーブンに30分間入れてハードベイクします。次に、スタイラス形状測定を使用してチャネル側壁の正確な高さと傾斜を測定する前に、室温まで冷却します。次に、スライドガラスの表面に1ミリリットルのフォトレジストを塗布し、プログラムをもう一度実行します。システムが停止したら、掃除機をオフにしてスライドガラスを取り外します。2D電極設計のフォトマスクをマスクホルダーに固定した後、S-1818コーティングを上向きにしてガラスウェーハを挿入し、ウェーハチャックに位置合わせします。露出設定を215ミリジュール/平方センチメートルに設定し、機械を稼働させます。露光後、スライドガラスをMF-319現像液に2分間沈め、穏やかに撹拌した。次に、ガラスウェーハを取り外し、その表面を脱イオン水ですすいでください。最後に、スライドガラスを摂氏150度のオーブンに入れてハードベイクし、目的の基板の表面が上を向いていることを確認します。30分後、スライドをオーブンから取り出し、光から保護します。スライドガラスをエッチングするには、10対1緩衝フッ化水素酸溶液に1分間、ポリテトラフルオロエチレン容器に沈めます。次に、スライドガラスを脱イオン水で3回移して洗浄します。次に、物理蒸着システムを用いて、チタンを毎分100オングストロームの速度で8分間スパッタし、白金を毎分200オングストロームで10分間スパッタした。次に、フォトレジストを持ち上げるために、金属コーティングされたスライドガラスをアセトン浴に10分間沈め、浴を超音波処理して攪拌を導入する。必要に応じて、アセトンを浸したワイプを使用して残留物を取り除きます。次に、ポリジメチルシロキサンのレプリカ成形では、電子天秤の上に置かれた使い捨て容器に10対1の重量比で硬化剤を備えたPDMSエラストマーベースを作成します。次に、PDMS溶液をシリコンウェーハ上に注ぎ、混合物を真空下に置いて気泡を除去します。65°Cで最低4時間硬化させた後、カミソリの刃先で成形したPDMSを切り取り、シリコンウェーハから剥がします。次に、鋭利な生検パンチを使用して、デバイスの入口と出口からPDMSを取り外します。次に、プラズマ発生器をPDMSボンディング用にプログラムします。次に、PDMSと電極ガラススライドをフィーチャーを上に向けてシステムに配置し、プログラムを実行します。プログラムが完了したら、デバイスを取り外し、ステレオスコープを使用して、チャネル機能を電極にすばやく位置合わせします。PDMSの中心から側面に向かってしっかりと圧力をかけ、ボンディング界面の不要な気泡を取り除きます。HEK293細胞を回収して遠心分離し、ペレットをミリリットルあたり約500万細胞のエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。次に、GFPをコードする血漿DNAをミリリットル当たり20マイクログラムの最終濃度まで加え、穏やかに混合する。次に、実験のために血漿-DNA細胞懸濁液を1立方センチメートルの注射器に移します。スライドホルダーを介してマイクロデバイスを顕微鏡のステージに置きます。次に、充電された結合デバイスであるCCDカメラの電源を入れ、マイクロ流体チャネルに焦点を合わせます。次に、シングルセルエレクトロポレーションの場合、シリンジポンプの流量を毎分0.1〜0.3マイクロリットルに設定して、電極セットを通るシングルセルの流れを確保します。次に、初期および最小の電気エネルギーエレクトロポレーションパルスのパルスパラメータを設定します。パルスアプリケーションごとに所定の数の細胞検出に従います。テストされた各条件の最後に、マイクロデバイスのコンセントから細胞を吸引し、コンセントに回収培地を補充します。次のエレクトロポレーションパルス条件まで反復し、すべてのエレクトロポレーションパルス条件がテストされるまで繰り返します。次に、高スループットポピュレーションベースのフィードバックのためのエレクトロポレーションパルスパラメータを決定します。ポピュレーションベースのフィードバック制御エレクトロポレーションでは、シリンジポンプの流量を毎分1〜3マイクロリットルに設定し、パルス振幅を最適な条件に設定します。次に、トリガーモードをオフにして、セルの通過時間に一致するようにパルス幅を設定します。所望の数の細胞がエレクトロポレーションされたら、シリンジポンプとファンクションジェネレーターの両方をオフにします。次に、細胞を出口リザーバーから、予め温めた回収培地で満たされた適切なサイズの細胞培養フラスコまたはプレートに移し、培養フラスコまたはプレートをインキュベーターに移します。データ解析では、データを解析ソフトウェアにロードし、各パルス条件の電流対時間のプロットを生成します。次に、細胞膜透過の程度を決定し、テストされたすべてのパルス条件で細胞膜透過マップを生成し、最適なパルス条件を検証します。インキュベーション後、FITCと遠赤色フィルターを使用して落射蛍光画像をキャプチャし、手動またはアルゴリズムを介して画像セットを分析します。ここでは、単一パルス振幅の単一細胞レベルの透過処理検出の背後にある動作原理を強調しています。各エレクトロポレーションパルスパラメータの後に、次に高いエネルギーのエレクトロポレーションパルスがテストされます。HEK293細胞の細胞膜透過マップは、印加された電気エネルギーと細胞膜透過の程度との間に明確な相関を示した。この実験では、1.8キロボルト/センチメートルの電界強度と670マイクロ秒のパルスが最適であると決定されました。これらの値では、70%のエレクトロトランスフェクション効率が達成されました。0.4キロボルト/センチメートルの電界強度と3ミリ秒のパルス持続時間とは対照的に、24時間での電気トランスフェクション効率は5%未満でしたマイクロファブリケーションプロセスの特定の説明時によく使用されるレシピという用語は、機能するデバイスを正常に製造するために各ステップに従うか最適化することの重要性を挿入します。このエレクトロポレーション技術は、CAR T細胞の生成とテスト、CRISPR-Cas9遺伝子編集技術の最適化とテストなど、追加の生物医学研究プロジェクトに利用できます。このマイクロエレクトロポレーション技術により、さまざまな細胞タイプの応答を電気的に調べて電気パルス条件を適用し、その情報を臨床的に関連する分子貨物の送達に関連付けることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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