Name: キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ 高速繰り返し蛍光光度計を用いたColacium属付着藻類の光生理機能測定法。ゾウプランクトンに付着した状態で光合成活性をリアルタイムに評価し、水生生態系における藻類生産性の理解を深める。

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本研究は、環境省の地方創生費補助金及び環境研究技術開発費(第5-1607号)の滋賀県共同研究費「水環境の健全性確保のための水質・湖底環境に関する研究」の支援を受けたものです。https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。著者らは、英語のレビューのためにEnago(www.enago.jp)に感謝したいと思います。

1. サンプリング
<ol><li>バケツで水面から湖の水を集める。S. mucronata(図1A-C)に付着したColacium sp.を標的にするために、100μmのナイロンメッシュnet52を用いて0.5〜10Lの湖水にフィルターを当てた。 注: S. mucronata は、しばしば、葦(フグダニ)地域など、浅い、富栄養性、泥水で密集する。</li>
	<li>濃縮したサンプルを350 mLの湖水を入れた500 mLのペットボトルに保管します。暗い状態に保ちます。</li>
	<li>実験室では、サンプル水を500mLビーカーに注ぎ、数分間落ち着かせます。</li>
	<li>湖の水を0.2μmの孔径フィルターでろ過します。</li>
	<li>Sをピックアップ します。 ムクロナータ 個体はピペットを用いて、光学顕微鏡下、倍率100倍で観察した。BłędzkiとRybak53に従って種の同定を行う。</li>
	<li>スライドガラスの上に置いた0.2μmのろ過された湖水(FLW)の滴にそれらを移す。 注: S. ムクロナータは 表面に泳いだり、ビーカーの壁に付着したりすることがあります。</li>
	<li>[ S] をオンにします。光学顕微鏡下で のムクロナータ 。</li>
	<li>S を洗う。 ムクロナータ個体は 、他の生物からの汚染を防ぐためにFLW(3滴以上)を使用している(図2)。</li>
	<li>Keep S40μmol光子・m−2・s−1以下の成長チャンバー内のin situ温度でのムクロナータ。</li>
</ol>2. Sの効果 .ベースライン蛍光上のムクロナータ
<ol><li>
S. ムクロナータ 栽培<ol>
<li>光学顕微鏡下でピペットを用いて ムクロナータ菌 個体を100倍の倍率でピックアップし、ステップ1.8と同様にFLWを用いて洗浄する。</li>
		<li>少なくとも1週間は、エアストーンを介して電動エアポンプを使用して水道水を通気する。300 mL の通気水道水を 350 mL のガラス瓶に注ぎます。</li>
		<li> クロレラ(1 mg C·L-1)を供給し、成長チャンバー内で40μmol光子・m−2·s−1の下で20°Cで維持する。</li>
		<li>約14日後、光学顕微鏡下でピペットを使用して5〜30人の個体を100倍の倍率で拾い上げ、300mLの清潔で通気した水道水に接種して培地を新鮮に保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf のセットアップ<ol>
<li>Act2Run ソフトウェアを起動します。</li>
		<li>[オプション]タブをクリックし、[動作モード]でAct2 FLC(白色LED)を選択して、活性LEDの色を設定します。</li>
		<li>メインウィンドウの蛍光-光度曲線の設定のステップ1でDarkの値をクリックし、30と入力して暗黒期間の期間を設定します(図3A)。</li>
		<li>LEDの組み合わせB、C、Dをクリックして、緑とオレンジのLEDをオフにします(図3C)。</li>
		<li>Satの下のFetsとPitchの値をクリックし、それぞれ100と2と入力して、飽和フェーズでのフラッシュレットの数とピッチを設定します(図3D)。</li>
		<li>Relの下のFetsとPitchの値をクリックし、それぞれ40と60と入力して、緩和フェーズでのフラッシュレットの数とピッチを設定します(図3E)。</li>
		<li>「FLC中」(図3F)をクリックしてウォータージャケットポンプを作動させ、測定中のサンプル温度を制御します。</li>
		<li>自動LEDと自動PMTをクリックしてアクティブにします(図3F)。</li>
		<li>[ 同期] をクリックして、FRRf-Act2を接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf測定<ol>
<li>ベースライン蛍光に対する動物プランクトン個体の効果を調べるために、成虫Sを調製 する。 ムクロナータ (体格400-650μm)は、付着した生物を伴わずにステップ2.1.1-2.1.4の培養物から得た。</li>
		<li>腸内容物からの蛍光を避けるために、 FLW中の個体を20°Cで少なくとも90分間飢えさせる。</li>
		<li>1.5mLのFLWをキュベットに注ぐ。0、1、5、および10個の S. mucronata 個体を光学顕微鏡下でピペットを用いて100倍の倍率で拾い上げる。</li>
		<li>転送 S. ムクロナータ個体 をキュベットに注入し、FLWを加えてサンプルを2mLまで持って来る。</li>
		<li>FRRf測定の前に、低光(1-10μmol光子・m−2・s−1)で20°Cで15分間順応する。</li>
		<li>Act2 Run をクリックして測定を開始します。測定をサンプルあたり>3回繰り返す。</li>
		<li>結果プロットから Fo 値を読み取ります(図4)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Chl -蛍光 に対する基質生物の影響
<ol><li>
コラシウム sp.栽培<ol>
<li>FLW及びAF-6培養用培地54 を準備する(表2)。</li>
		<li>ステップ1.1および1.2のようにS. mucronataに付着したColacium sp.を採取し、成長チャンバー内でin situ温度に保つ。</li>
		<li>脱皮した甲羅(図1D)でColacium sp.を光学顕微鏡下でピペットを用いて100倍の倍率で拾います。ステップ1.8のようにFLWで洗ってください。</li>
		<li>コラシウム・エスピーおよびAF-6培地をクリーンベンチ上の10mLガラス管に無菌的に接種する。</li>
		<li>培養物を、成長チャンバー内で200μmol光子・m−2・s−1 以下のin situ温度で維持する。細胞の沈降を防ぐために、少なくとも1日に1回はガラス管を手で優しく振ってください。 注:凝集したコロニーの減衰効果をできるだけ低く抑えるために、FRRf測定の前に顕微鏡でコロニーを確認してください。細胞凝集は、高密度コロニーを引き起こし、藻類の光生理機能に影響を与える可能性がある55。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FRRf測定<ol>
<li> コラシウム属からのChl-a蛍光に対する動物プランクトン個体の効果を調べるために、成体Sを調製する。 ムクロナータ(体格400-650μm)は付着した生物を含まない。</li>
		<li>腸内容物からの蛍光を避けるために、 FLW中の個体を少なくとも90分間飢えさせる。</li>
		<li>キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)を設置。</li>
		<li>前培養コ ラシウム ・エスピーの1.5mLサブサンプルをキュベットに注ぐ。0、5、10、および 15 S を転送 します。これらのキュベットに ムクロナータ 個体を加え、2μmの濾過培地を加えて、サンプルを2mLまで持たせる。</li>
		<li>FRRf測定を行う前に、低光(1-10μmol光子・m−2・s−1)下で20°Cで15分間順応する。 メモ:測定中はサンプルをインキュベーション温度に維持してください</li>
		<li>Act2 Run をクリックして測定を開始します。測定をサンプルあたり>3回繰り返す。</li>
		<li>結果プロットからFO値とFm値を読み取ります(図4)。 メモ: PSII パラメータを正しく推定するために、LED 電源が最適な範囲内にあるかどうかを示す RσPSII 値(表 1)を確認してください。自動LEDがアクティブになると、Act2runシステムはLED電源を制御して最適なRσPSII範囲(0.042-0.064)を達成します。実験的なRσPSIIカットオフ値は、以前の研究で0.03および0.08で定義されました48。</li>
		<li>ベースライン蛍光22を補正するには、0.2μmの孔径フィルターを使用して培養液をろ過し、蛍光を測定します。Colacium sp の FO および Fm からベースラインサンプルの FO を減算するか、[オプション] タブの [設定] で [ ブランク補正] の値を変更します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. コラシウム 属の光生理学(添付段階)
<ol><li>光学顕微鏡下でピペットを用いてコラシウム属でS. mucronata個体を単離する。</li>
	<li>S を洗う。 ムクロナータは FLWを用いて、ステップ1.8と同様である。</li>
	<li>転送 S. ムクロナータ を100mLのFLWに。飢餓の場合は、暗条件下で その場で 90分間保管してください。</li>
	<li>1.5mLのFLWをキュベットに注ぐ。</li>
	<li>転送〜10秒。キュベットにコラシウムsp.を持つムクロナータ個体。測定には、2 mLあたり100個以上のコラシウム細胞が必要です。FLWを加えてサンプルを2mLまで持って行きます。</li>
	<li>低照度(1-10 μmol光子・m-2·s-1)下でin situ温度で15分間順応させ、ステップ3.2.6-3.2.8のようにChl-a蛍光を測定する。</li>
	<li>付着細胞数を列挙するために、FRRf測定をとった後にグルタルアルデヒド(2%最終体積)でサンプルを固定する。Sのいくつかの焦点深度と位置で写真を撮 ります。光学顕微鏡下で のムクロナータ 。</li>
</ol>5. コラシウム 属(プランクトン期)の光生理学
<ol><li>サンプリングした コラシウム 属をAF-6培地中で、ステップ3.1.1~3.1.5のように in situ 温度で培養する。</li>
	<li>固定期には、培養 コラシウム 属2mLを採取し、キュベットに注ぐ。</li>
	<li>低照度(1-10 μmol光子・m-2·s-1)下でin situ温度で15分間順応させ、ステップ3.2.6-3.2.8のようにChl-a蛍光を測定する。</li>
</ol>6. コラシウム 属の光生理学に及ぼすCaおよびMn添加の影響
<ol><li>付属ステージへの影響<ol>
<li>光学顕微鏡下でピペットを用いてコラシウム属でS. mucronata個体を単離する。ステップ 1.8 のように、FLW を使用して洗ってください。</li>
		<li>6人の個人をそれぞれ30mLのFLWを含む12個のガラスビーカーに移す。各ビーカーに>100個の Colacium sp.セルが含まれていることを確認します。</li>
		<li>200μmol·L−1 CaCl2·H2O(Ca処理)、40μmol·L−1MnCl4(Mn処理)、または超純水(コントロール)を各ビーカーに。サンプルを成長チャンバー内のin situ温度で200μmolの光子・m−2・s−1の下でインキュベートする。</li>
		<li>3時間および21時間で、すべての個体および脱皮した皮を2mLの培地を含むキュベットに移す。</li>
		<li>光の増加に対する迅速な反応を調べるには、8つの活性光線ステップの期間の [Up ]をクリックし、「20」(図3A)と入力して各ステップの持続時間を20秒に設定します。段階的な活性光線を0、11、25、44、68、101、144、および200μmol光子・m−2・s−1に設定するには、 High E および Step Up をクリックし、値をそれぞれ200および34に変更します(図3B)。</li>
		<li>15分間の暗所馴化後、ステップ3.2.6-3.2.8と同様に各サンプルのChl-a 蛍光を測定する。 メモ: RσPSII および RσPSII の値が最適な範囲 (0.03 ~ 0.08)48 内にあることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プランクトン期への影響<ol>
<li>サンプリングした コラシウム 属をAF-6培地中で、ステップ3.1.1~3.1.5のように in situ 温度で培養する。</li>
		<li>培養したコラシウム・エスピーをFLWに移し、200μmol未満の光子・m−2・s−1のin situ温度で3日間順応させる。</li>
		<li>馴化サンプル1 mLを、10 mLのFLWを含む3つのガラスバイアルに移す。</li>
		<li>200μmol·L−1 CaCl2·H2O(Ca処理)、40μmol·L−1 MnCl3(Mn処理)、または超純水(コントロール)をバイアルに。サンプルを200μmolの光子・m−2・s−1の下で、成長チャンバー内のin situ温度でインキュベートする。</li>
		<li>3時間および21時間で、ステップ3.2.6〜3.2.8のように各サンプルのChl-a蛍光を測定する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者は宣言する開示を持っていません。

このプロトコルは、自然環境における付着段階におけるColacium sp.の光生理学がAF-6培地中のプランクトン段階に匹敵することを初めて実証した。さらに、飢餓状態のS. mcronataの腸内内容物は、密度が≤5 inds·mL-1の場合、ベースラインおよびChl-a蛍光に影響を及ぼさなかった(図5および図6)。これらの結果は、このプロトコールが、低基質生物存在下で補正することなく付着段階の間にColacium sp.の光生理機能を測定できることを示唆している。しかし、ステップ3.2.1-3.2.8の結果は、最も高いS. mucronata存在量がFv/FmおよびNPQNSVに有意に影響したが、FOおよびσ PSIIには影響し...

クロロフィル可変蛍光は、藻類光系II(PSII)光生理機能を測定するための有用なツールである。藻類は、過剰な光や栄養素欠乏などのさまざまな環境ストレスに反応し、PSII光生理機能を変化させます。高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、PSII光生理学1,2を測定し、一次生産性1,3,4を推定するための一般的な方法であり、植物プランクトンPSII光生理学、ならびに広い空間的および時間的スケールにわたる一次生産性のモニタリングを可能にします5,6,7。FRRfは、PSII(σ PSII)吸収断面積、反応中心([RCII])濃度、最大光化学効率(Fv/Fm)、有効光化学効率(Fq′/Fm')、および非光化学クエンチ(NPQNSV)を同時に測定することができます(表1)。一般に、Fv/FmおよびFq′/Fm'はPSII活性8として定義され、 NPQNSVは相対放熱エネルギー9として定義される。
重要なことに、FRRfの単一ターンオーバー(ST)フラッシュは、一次キノン電子受容体QAを完全に減少させるが、プラストキノンプールは減少させない。逆に、パルス振幅変調(PAM)蛍光光度計からの複数回のターンオーバー(MT)フラッシュは、両方を低減することができます。ST法は、Fv/Fm、Fq′/Fm'、NPQNSV、およびσ PSII10の回復動態を同時に測定することにより、NPQNSVの可能性のある起源を特定する際にMT法よりも明確な利点を有する。現在までに、潜水艇型、キュベット型、フロースルー型など、いくつかのタイプのFRRf機器が市販されている。水中型FRRfは海洋や湖沼でのin situ測定を可能にし、キュベット型FRRfは少量のサンプル測定に適しています。フロースルー型は、表層水中の植物プランクトンの光生理機能を連続的に測定するために一般的に使用されています。
キュベット型を含むPAM蛍光光度計が幅広い被験者に対して開発されていることを考えると11、PAM蛍光光度計は藻類の光生理学研究においてFRRfsよりも依然として一般的です12。例えば、これらのツール間で試料室構造やキュベット容量はわずかに異なるにすぎないが、キュベット型PAMは植物プランクトン13,14,15,底生微細藻類16,17,18,氷藻19,およびエピゾイック藻類20に適用されているが、キュベット型FRRfは主に植物プランクトンに適用されている21,22,23。 限られた数の氷藻類コミュニティ24,25。その有効性を考えると、キュベット型FRRfは底生藻類およびエピゾイック藻類に等しく適用可能である。したがって、その適用を拡大することは、PSII光生理学、特にあまり知られていないエピゾイ藻類光生理学に対するかなりの洞察を提供するであろう。
エピゾイ藻類はほとんど注目されておらず、PSII光生理学を調べる研究はほとんどなく20,26、おそらく水生食物網における彼らの小さな役割が原因である27,28。しかし、エピゾイック藻類を含むエピバイオントは、繁殖率や生存率の増加など、動物プランクトン群集のダイナミクスにプラスの影響を与える可能性があり29,30、沈没率29,31の増加や視覚的捕食者に対する脆弱性29,31などのプロセスに悪影響を及ぼす可能性があります32,33,34,35,36。.したがって、動物プランクトン群集におけるエピバイオントの動態を制御する環境的および生物学的要因を探索することは極めて重要である。
エピゾイック藻類の中で、コラシウム・エーレンベルク1834(Euglenophyta)は、一般的な淡水、藻類群32、37、38、39(図1A−D)、非運動性プランクトン(図1E、F)、および運動性プランクトン段階を含む様々なライフステージを有する40、41.非運動性プランクトン期の間、細胞は粘液で覆われた単細胞プランクトン、凝集コロニー、または1層シートコロニーとして生きる42。付着段階では、Colacium sp.は、細胞の前端から排泄された粘液37,39,41を使用して基質生物(担子類)、特に微小甲殻類41,43に付着する。彼らのライフサイクルはまた、脱皮した外骨格または死んだバシビオットから切り離し、鞭毛と一緒に泳いで別の基質生物を見つけることを含む39。プランクトン期と付着期の両方が有糸分裂によって集団サイズを増加させる可能性があります40。それらの付着段階は、光44や微量元素41,45,46などの資源を集めるための進化的形質、または分散戦略27であると仮定されているが、これらの側面37,41,44に関する実験的証拠はほとんどなく、主要な付着メカニズムはほとんど知られていない。例えば、ロソウスキーとクグレンスは、コラシウムが基質カイアシ類41からマンガン(Mn)を得ると予想し、外骨格47に集中する。
ここでは、プランクトン藻類のPSII光生理機能の測定方法およびキュベット型FRRfを用いたColacium sp.細胞による付着藻類(動物プランクトンへの付着)の標的化の関連適用方法について説明する。444nm、512nm、633nmを中心としたフラッシュ励起エネルギーを提供する3つの発光ダイオード(LED)を搭載したAct2システムを使用しています48。ここで、444nm(青色)はクロフィルa(Chl-a)の吸収ピークに対応し、512nm(緑色)および633nm(オレンジ色)はフィコエリスリンおよびフィコシアニンの吸収ピークにそれぞれ対応する。蛍光シグナル検出ピークは682nmで、半値帯域幅は30nmです。 Colacium sp.のプランクトン期を自然環境下で見つけることは困難であるため、実験のためにそれらの付着期を採取した。多数の基質生物の中で、Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae;図1A,B,G)は、泳ぐ速度が遅く、体の大きさが大きく(400〜650μm)、ユニークな挙動(水面に逆さまにぶら下がっている)のために、扱いが最も簡単なものの1つです。したがって、このプロトコルは、コラシウム - バシビオン系のケーススタディとして、S. mucronataに付着したColacium sp.を使用する。腸内容物に由来する蛍光を避けるために、S. mucronataは飢餓状態であった。以前の研究では、腸内内容物(摂取された藻類)からの蛍光シグナルが40分後に5倍の減少を示すことが報告されていたので49、90分の飢餓は、栄養素欠乏などのColacium sp.への実験的ストレスの影響を最小限に抑えながら、腸内含有量の蛍光がFRRf測定に影響を与える可能性を最小限に抑えるのに十分であると予想しました。さらに、このプロトコルを適用して、Colacium sp.の結合メカニズムを明らかにし、カルシウム(Ca)とマンガン(Mn)の2つの金属がプランクトンと付着段階の両方の光生理機能にどのように影響するかを決定しました。カルシウムは光合成経路50において複数の方法で重要な役割を果たしており、PSII51の酸素発生錯体を構築するためには両方の金属が必要です。カルシウムとマンガンは甲殻類の動物プランクトン47の甲羅に高濃度であるため、このライフステージが付着段階でS. mucronataからこれらの元素を取得すれば、Colacium sp. 光生理学はプランクトン段階のCaとMnの濃縮により顕著に反応する可能性があると仮定します。

<table><tbody><tr><td>Acrodiscシリンジフィルター</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td><td></td><td>0.2 &mu;m 細孔径</td></tr><tr><td>Act2Run</td><td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Wako</td><td>023-08711</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>和光</td><td>031-25031</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>CaCO3</sub</td><td>>和光</td><td>036-00382</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>和光</td><td>036-05522</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>CoCl2&middot;6H2O</td><td>和光</td><td>036-03682</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>濃度クロレラ</td><td>レテック 東京都 日本</td><td></td><td>20 mg C&middot;mL&minus;1 ;4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>FastOcean Act2</td><td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fe-citrate</td><td>Wako</td><td>093-00952</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>FeCl3&middot;6H2O</td><td>和光</td><td>091-00872</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>HCLP-880PF</td><td>日本医化学機器 &nbsp;株式会社大阪府</td><td></td><td>LED電球付</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>和光</td><td>160-04292</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>和光</td><td>167-04241</td><td>AF-6中型</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>和光</td><td>137-00402</td><td>AF-6 中</td></tr>型 <tr><td>MnCl3&middot;4H2O</td><td>和光</td><td>139-00722</td><td>AF-6中</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>和光</td><td>343-01861</td><td>AF-6中</td></tr><tr><td>Na2MoO4</sub</td><td>>和光</td><td>196-02472</td><td>AF-6中</td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>ワ</td><td>コー191-02542</td><td>AF-6中</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>ワコー</td><td>015-03231</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>型プランクトンカウンター</td><td>松波ガラス、大阪、日本</td><td>S6300</td><td></td></tr><tr><td>パイレックス試験管</td><td>CTG Ltd.、ウェストモールジー、英国</td><td></td><td>リム付き、16 x 100 mm</td></tr><tr><td>ビデオB<サブ>1</サブ</td><td>>ワコー</td><td>203-00851</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>ビタミン B<サブ>12</サブ></td><td>ワコー</td><td>226-00343</td><td>AF-6 ミディアム</td></tr><tr><td>B6</td><td>和光</td><td>165-05401</td><td>AF-6 中</td></tr><tr><td>ZnSO4&middot;7H2O</td><td>和光</td><td>264-00402</td><td>AF-6 中</td></tr></tbody></table>

キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII(PSII)光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法です。FRRfは、様々な真核生物藻類およびシアノバクテリアについて、PSII吸収断面(σ PSII)、最大光化学効率(Fv/Fm)、有効光化学効率(Fq′/Fm')、および非光化学消光(NPQNSV)を測定することができるが、これまでのFRRf研究のほとんどすべてが植物プランクトンに焦点を当てている。ここで、プロトコルは、エピゾイック藻類コラシウムspのPSII光生理機能を測定する方法を記載する。エーレンベルク1834(Euglenophyta)は、その付着段階(動物プランクトンに付着)において、キュベット型FRRfを使用した。まず、基質動物プランクトン(Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae)がベースライン蛍光およびσ PSII,Fv/Fm,Fq'/Fm',NPQNSVのプランクトンコラシウムsp.に及ぼす影響を推定した。この方法論を検証するために、我々はS. mucronataに付着したColacium sp.の光生理学的測定値を記録し、これらの結果をそのプランクトン段階と比較した。代表的な結果は、プロトコルがコラシウム属の光生理学に対するカルシウム(Ca)およびマンガン(Mn)の効果を決定し、結合段階とプランクトン段階との間のMn濃縮の様々な効果を同定する方法を示した。最後に、他の周生藻類に対するこのプロトコルの適応性について議論する。

5個体(inds.)mL−1までのS. mucronataによるベースライン蛍光(図5)またはChl-a蛍光(図6)の有意な影響はなかった。しかし、Fv/FmおよびNPQNSVは、S. mucronataが7.5 inds·mL−1のときに有意に影響を受けた。そこで、付着段階におけるコラシウム属の光生理機能を測定するために、コラシウム属の十分な存在量(&gt;50細胞・mL−1)とキュベット中のS.ムクロナータ(≤5inds・mL−1)の少ない数に到達するために、コラシウム属の負担の大きいムクロナータ菌を選択した。 
...

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法である。ここでは、キュベット型FRRfを用いて基質動物プランクトン上のエピゾイ藻類、 コラシウム 属のPSII光生理機能を測定するためのプロトコールについて説明する。

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

このプロトコルは、自然界と同様に、付着した藻類がまだプランクトンに付着している間に、付着した藻類の光合成活性を測定する。この技術の主な利点は、サンプルの気を散らすことなく、光生理学の測定をリアルタイムで行うことができることです。ベースライン蛍光に対する動物プランクトン個体の影響を調べるために、付着した生物を含まない培養物から成体のスカポレベリス・ムクロナータを調製する。次に、腸内含量からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を摂氏20度で少なくとも90分間飢えさせる。1.5ミリリットルのFWLをキュベットに注ぐ。希望の数の s を拾います。ムクロナータ個体は、光学顕微鏡下でピペットを用いて倍率100倍で、キュベット内に移した。FLWを追加してサンプル量を最大2ミリリットルにし、高速繰り返し率蛍光光度計測定の前に15分間、摂氏20度の低照度下で順応できるようにします。次に、「実行する行為」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。結果のプロットからF0値を読み取ります。光学顕微鏡下でピペットを用いて脱皮甲羅でコラシウム種を100倍の倍率で拾い上げ、FLWで洗浄する。クリーンベンチ上の10ミリリットルのガラス管にAF-6培地中のコラシウム種を無菌的に接種する。増殖チャンバー内で培養物をNC2温度に維持し、細胞沈降を防ぐために少なくとも1日1回は手でガラス管を優しく振る。コラシウム種からの蛍光であるクロロフィルに対する動物プランクトン個体の影響を調べるには、生物を付着させない成虫のs. mucronataを使用する。腸内容物からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を少なくとも90分間飢えさせる。キュベット式高速繰り返し速度蛍光光度計を設置。次に、前培養コラシウム種の1.5ミリリットルのサブサンプルをキュベットに注ぎます。次いで、所望の数のs. mucronata個体をこれらのキュベットに移し、濾過された媒体でサンプル量を最大2ミリリットルにする。20°Cの低照度下で15分間個体を順応させてから、高速繰り返し速度蛍光光度計測定を行います。「act to run」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。結果のプロットからF0値とFM値を読み取ります。ベースライン蛍光を補正するには、0.2マイクロメートルの注ぎ口サイズのフィルターを使用して培養液をろ過し、蛍光を測定します。コラシウム種の F0 および FM からベースラインサンプルの F0 を減算するか、[オプション] タブの設定で空白の補正値を変更します。光学顕微鏡下でピペットを使用して、コラシウム種を持つ s. mucronata 個体を分離します。その後、FLWを用いてムクロナータを洗浄する。を転送します。ムクロナータを100ミリリットルのFLWに入れ、NC

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生物学

彼らはkHzのレートで安価にピコリットル、自己区分血管を生成することができるので、液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、ハイスループットの実験のための有望な候補である。...

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。...

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

このビデオでは、タンパク質のホモオリゴマー化を研究するための蛍光揺らぎ分光法(FFS)の手法を実演しています。サンプル中の蛍光標識タンパク質は、FFSを用いたタンパク質オリゴマー化を研究する際に、薬剤を用いて二量体化されます。共焦点顕微鏡を用いて、タンパク質が小さな観察領域に出入りする際に、蛍光分子の明るさの変動を解析し、タンパク質のオリゴマー状態を決定します。...

タンパク質ホモオリゴマー化を研究するための蛍光変動分光法

出典:Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.J. Vis. Exp.

マウス網膜錐体光受容体におけるカルシウム動態モニタリングのための2光子顕微鏡法

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。...

ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。...

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

本プロトコルは、スペクトル分析に基づく紅藻におけるフィコビリタンパク質変化の段階的な自己蛍光イメージングおよび評価を記載する。これは、希少な材料しか利用できず、実験室条件下で細胞がゆっくりと成長するか、まったく成長しない場合に、極端な生息地への細胞の適応を評価するためのラベルフリーで非破壊的な方法です。...

紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング

学ぶ 高速繰り返し蛍光光度計を用いたColacium属付着藻類の光生理機能測定法。ゾウプランクトンに付着した状態で光合成活性をリアルタイムに評価し、水生生態系における藻類生産性の理解を深める。

キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計によるコラシウム属の付着ステージの光生理機能の測定

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キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

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