グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化
2022年1月10日
グリホサートベースの製品(GBP)は、世界中で最も一般的な広域スペクトル除草剤です。本稿では、GBPがマイクロバイオームに与える影響を定量化するための一般的なガイドラインを、フィールド実験からバイオインフォマティクス解析まで紹介します。
ここでは、マイクロバイオームに対するグリホサートの効果を評価するための実験を実施するための最良のバイオインフォマティクス方法を含むワークフローを提供します。主な利点は、将来のフィールドおよびラボ実験のための堅牢なテスト可能な仮説を提供することです。説明されている方法論は、植物、動物、および微生物を含む様々な系に適用することができる。
方法論の各部分は非常に簡単です。おそらく最も困難な部分は、作業のさまざまな部分を実行できる学際的なチームを統合することです。手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるSuni Matthewです。
まず、実験フィールドを、プロット間に植生のバッファーストリップを使用したコントロールとGBP処理の10回の反復に分割して、実験1を開始します。対照プロットを水道水で処理し、GBPプロットを市販のGBPで処理して、農業慣行において許容される最大グリホサート投与量を模倣する。実験植物から微生物叢をサンプリングする。
畑から植物サンプルの10の複製を収集し、すぐに氷の上に置き、さらなる処理のために実験室に持ち込む。実験2では、12ヶ月間の鳥小屋実験で、GBP汚染または対照飼料を食べたウズラから木材削りくず、糞便、およびこぼれた飼料を含む寝具を収集します。寝具サンプルを、グリホサート濃度測定のために認定ラボに送付し、広げた直後に行います。
各プロットに多年生草とイチゴの植物を植えて、それらの根と葉の微生物叢を研究します。植物サンプルを洗浄および滅菌することによって、内生微生物を同定し、除去する。サンプルが滅菌されたら、メーカーのプロトコールに従って市販の植物DNA抽出キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
ネストされたアプローチを使用して、16S rRNA遺伝子の可変領域V6~V8を増幅し、テキスト原稿に記載されているように、必要な数のサンプルに対してPCRマスターミックスを作成します。PCRの第1ラウンドでは、前方に799、逆に1492のプライマーを使用します。サーモサイクラーで増幅プロファイルを35サイクル設定します。
増幅を検証するには、5マイクロリットルの増幅産物を用いて電気泳動を行い、PCR産物の残り25マイクロリットルをオートクレーブ処理した超純水で1対10の割合で希釈する。順方向のユニバーサルプライマー1062および逆方向の1390を用いて、25サイクルで第2ラウンドの増幅を行う。得られたPCR産物をオートクレーブ処理した超純水で等価比で希釈する。
8サイクルで増幅の第3ラウンドを実行し、バーコードとP1アダプタシーケンスで製品にタグを付けます。バイオアナライザーでPCR産物の品質濃度を検証し、各サンプルのDNA30ナノグラムを構成する量を1.5ミリリットルのチューブにプールして等モルライブラリーを作製した。アガロースゲルカセット上の自動DNAサイズ選択システムを用いたサイズ分画によって、サイズ350〜550塩基対のアンプリコンを選択する。
指定されたサイズのアンプリコンを含む溶出液をカセット内のバイアルに集め、精製された16S rRNA遺伝子ライブラリーを得る。回収した溶離液を1.5ミリリットルのチューブに移し、バイオアナライザーで純度と濃度を検証します。オートクレーブ処理した超純水を用いてDNAライブラリーを終濃度26ピコモルに希釈する。
ITS領域を増幅するために、ITSプライマーによる反応を設定した後、増幅プロファイルをサーモサイクラー上に設定した。次いで、増幅産物5マイクロリットルを1.5%アガロースゲル上で分析し、オートクレーブ処理された超純水を用いて、残りの25マイクロリットルの生成物を1対10の割合で希釈する。バーコードタグ付きフォワードプライマーおよびP1アダプタータグ付きリバースプライマーを使用して、必要なサンプル数のPCRマスターミックスを作成します。
希釈したPCR産物を鋳型として用い、第2ラウンドの増幅を行う。16S rRNA遺伝子のライブラリー調製と同様に、精製ITS領域用のライブラリーを準備する。EPSPSタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析を開始します。
サーバー提供出力からのグリホサートに対するクエリ配列の潜在的な感受性を評価し、出力1はクエリ配列中に存在するアミノ酸マーカーの割合およびモチーフの数を示す。出力2は、マーカー残基に基づくクエリーおよび参照配列のアラインメントを示す。出力 3 は、クエリー・シーケンスと参照シーケンスの完全なペアごとのアラインメントを示しています。
出力4は、コレラ菌、コクシエラ・バーネティイ、ブレブンジモナス・ベシキュリス、およびストレプトマイセス・ダバウェンシスのEPSPS参照配列を示す。出力ページの最後に、BLASTp や保存されたドメインなどの外部ツールへのリンクを見つけて、クエリ EPSPS シーケンスをさらに分析します。パブリック リポジトリから EPSPS シーケンスを特定したら、分類情報を含む EPSPS クラス サーバーのメイン ページと、50,000 を超えるシーケンスの EPSPS クラスからこれらのデータセットにアクセスします。
圃場シーズンの終わりに植物の地上バイオマスを計量し、GBPプロットと対照プロットで植物の成長を比較します。スプレッドシートで、マイクロバイオーム実験用の細菌OTUを事前に計算されたデータセットにマッピングします。確率的スコアに基づいて、グリホサートに対する固有の感受性を計算する。
この方法は、EPSPSタンパク質の感受性の変化を微小進化レベルで定量するために使用された。我々は、分析された原核生物の32の密接に関連したグループのうち12において感受性状態の変化を同定した。したがって、グリホサートベースの製品'連続使用は、植物、動物、および土壌マイクロバイオームにおいて微生物嚥下障害を生じさせる可能性がある。
PCR前およびPCR後の手順の品質を確保して、最適なアンプリコンライブラリーを取得します。また、ソフトウェアを使用する前に、EPSPSタンパク質配列が部分的ではないことを確認してください。野外実験では、グリホサートによるコントロールの汚染を確実に防いでください。
概要
この記事では、グリホサート系製品がマイクロバイオームに与える影響を評価するための包括的な方法論を提示します。実験設計とバイオインフォマティクスアプローチを概説し、微生物群集の変化を定量化します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 環境科学
- 農業実践
背景
- グリホサートは広く使用されている除草剤で、マイクロバイオームに潜在的な影響があります。
- その影響を理解することは生態学的および農業的健康にとって重要です。
- この研究は、実地実験とバイオインフォマティクス分析を統合しています。
- 効果的な研究には学際的な協力が不可欠です。
研究目的
- 植物、動物、土壌のマイクロバイオームに対するグリホサートの効果を定量化すること。
- この分野の将来の研究のための堅固な枠組みを提供すること。
- グリホサートによって引き起こされる潜在的な微生物異常増殖を特定すること。
使用された方法
- 対照区画とグリホサート処理区画による実地実験。
- 植物および被覆材からの微生物群集のサンプリング。
- ゲノムDNAの抽出と微生物遺伝子のPCR増幅。
- EPSPSタンパク質配列のバイオインフォマティクス分析。
主な結果
- グリホサートに対する微生物の感受性の変化を特定しました。
- 処理された環境における微生物異常増殖の可能性を示しました。
- グリホサートの影響を評価するための詳細なワークフローを提供しました。
- 実験手順における品質管理の重要性を強調しました。
結論
- グリホサートの継続的な使用は微生物群集を混乱させる可能性があります。
- この方法論は様々な生態学的研究に適応できます。
- 将来の研究は長期的な生態学的影響に焦点を当てるべきです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying the impact of glyphosate-based products on microbiomes addresses a critical challenge in agricultural and environmental biotechnology, where unintended effects on non-target microbial communities can influence plant health and ecosystem stability. This workflow enables robust hypothesis testing and predictive assessment of microbial sensitivity, supporting risk-adjusted decisions in agrochemical R&D portfolios. Integrating bioinformatics with field data enhances translational continuity from discovery to environmental risk evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial pathway susceptibility to glyphosate via EPSPS sequence analysis.
- Supports biological de-risking by identifying non-target organisms potentially affected by herbicide exposure.
- Facilitates predictive confidence in environmental safety assessments for new agrochemical candidates.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbiome samples for downstream sequencing and bioinformatics workflows.
- Standardizes PCR-based amplification and library preparation for reproducible microbial profiling.
- Generates quantitative outputs on microbial community composition and glyphosate sensitivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field and laboratory data to assess translational relevance of microbiome shifts in real-world settings.
- Supports continuity from molecular target analysis to ecosystem-level impact studies.
- Informs risk-adjusted advancement of agrochemical products with environmental stewardship considerations.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology bridges early discovery, screening, and translational research by integrating field sampling, molecular profiling, and bioinformatics analysis of EPSPS sensitivity.
- Discovery Biology: Provides a framework for hypothesis-driven testing of glyphosate effects on microbial pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbiome data for comparative analysis across treatments.
- Analytics: Outputs probabilistic sensitivity scores and sequence alignments to inform risk assessment.
- Translational Research: Connects molecular findings to field-level ecological outcomes for regulatory and stewardship decisions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable workflow adaptable to diverse plant, animal, and environmental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in non-target impact assessments and target validation.
- Operational Value: Standardizes multidisciplinary workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage ecological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of agrochemical candidates with environmental considerations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, bioinformatics, and field ecology.
- Needs access to sequencing platforms, PCR instrumentation, and computational resources.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for different microbiome sources and environmental matrices.
- Relies on high-quality sequence data and contamination control for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Two Field Experiments to Test the Effect of Glyphosate Based Products (GBPs)
1:58
Microbiome Analyses: 16S rRNA and ITS Gene Amplification, and Library Preparation
4:59
Algorithm to Determine the Potential Sensitivity of Organisms to Glyphosate
5:56
Assessing the EPSPS Class from Universal Microbial Markers
6:40
Results: Quantification of Microbial Species Sensitivity after GBPs Usage
7:10
Conclusion
