Name: グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶ グリホサートがマイクロバイオームに与える影響を定量化するバイオインフォマティクス手法。EPSPSタンパク質解析と16S rRNAシーケンスにより、植物・動物・土壌の微生物叢変化を評価する実験ワークフローを解説します。

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この作品はフィンランドアカデミー(Marjo Helanderへの助成金番号311077)によって資金提供されました。

利益相反:なし。

このプロトコルは、EPSPSタンパク質の分析に基づいてマイクロバイオームに対するGBPの効果を定量する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルには、(i)マイクロバイオームデータからのEPSPSタンパク質の定量化という3つの主要な重要なステップがあります。EPSPSは除草剤の直接の標的酵素であるため、このステップは重要です。したがって、 EPSPS 遺伝子のコピーを有する種は、GBPの使用によって影響を受ける可能性がある。それにもかかわらず、 EPSPS 遺伝子のコピーを欠いている種でさえ、代替の非標的機構を介して除草剤の影響を受ける可能性がある43、44。(ii) EPSPS 遺伝子の解析が研究の設計に含まれていない場合には、16S rRNA(細菌)または ITS (真菌)を分析することによって良好な推定値を得ることができる。この場合、包括的な参照表に頼ることが不可欠である(例えば、ATGCデータベースは、いくつかの近縁種由来のEPSPSタンパク質の配列を提供する)。(iii)EPSPSタンパク質は、EPSPSの活性部位の特定のアミノ酸残基に応じて、グリホサートに対して潜在的に感受性または耐性に分けられる。しかしながら、単一のアミノ酸に影響を及ぼす変異は、この分類45 を変化させる可能性があり、クラス間の遷移は比較的短期間に起こり得る14。
グリホサートに対する生物の潜在的な感受性は、参照ゲノム、アミノ酸マーカーおよび配列アラインメントによって決定することができる。(i)参照ゲノム:EPSPS酵素は、アミノ酸マーカーおよびモチーフの存在(クラスIIIの場合)に基づいて、グリホサートに対して潜在的に感受性(クラスIαまたはβ46,47)または耐性(クラスII 48,49、III50およびIV51)に分類され得る。これらのアミノ酸マーカーおよびモチーフは、コレラ菌(vcEPSPS、クラスI)、コクシエラ・バーネティイ(cbEPSPS、クラスII)、ブレブンジモナス・ベシキュリス(bvEPSPS、クラスIII)、およびストレプトマイセス・ダバウェンシス(sdEPSPS、クラスIV)のEPSPSタンパク質中のアミノ酸残基の位置に基づいている。(ii)アミノ酸マーカー:グリホサートはEPSPS酵素と相互作用し、ホスホエノールピルビン酸(PEP、EPSPS酵素の第2の基質)と競合する52,53。特定の種において、EPSPS配列中の小さなアミノ酸変化は、PEPに対するより高い親和性およびグリホサート12、14、52、54、55に対する耐性を提供する。他の配列において、グリホサートは、非阻害立体構造45においてEPSPS配列と結合する。グリホサートに対する耐性のある多くの12、14、48、49、52、54、55および耐性56、57のEPSP配列が記載されているが、EPSPSの現在の分類システムは、4つの主要なクラス(I−IV)12に分けられる(表5).(iii)配列アラインメント:EPSPS酵素を分類するために、我々は、参照配列(vcEPSPS、cbEPSPS、bvEPSPSおよびsdEPSPS)の各1つに対して、複数の配列アラインメントプログラムデフォルトパラメータ35-を用いて、ペアワイズアラインメントを実施した。これらのアラインメントは、クエリ配列中のアミノ酸マーカーの位置を同定するために必要である。その結果、酵素は、アミノ酸マーカーおよびクラスIIIベースのモチーフマーカーの存在に基づいて、12クラスI、IIおよび/またはIVに記載されるように分類される。
このプロトコルは、4つの既知のタイプのEPSPSに基づいています:1つのタイプは敏感で、他の3つは耐性です)。しかし、原核生物のEPSPS配列の約10%はまだ分類されていません(古細菌では16%、細菌では8%)12。したがって、さらなる研究は、グリホサート感受性を決定するためにこれらの配列を分析するべきである。EPSPSClass サーバーには、新しい遺伝子マーカーをテストするオプションが用意されています。EPSPS の既知のクラスの識別は、セクション 4.4 に示すように簡単です。および 図5.さらに、ユーザーが独自のクエリタンパク質と参照タンパク質を比較したい場合、サーバーは参照配列と一連のアミノ酸マーカーを手動で含めるオプションを提供します(図11)。このオプションは、EPSPSの新規クラスを同定し、他の除草剤および標的配列を試験するために利用することができる。
EPSPSクラスの解析は、配列解析とアミノ酸マーカーの有無によって決定されます。これは、現場での仮説検定に使用できる予備的な推定値です。アミノ酸マーカーは、実証研究および観察研究に基づいて文献46、47、48、49、50、51で決定されている。しかしながら、EPSPSクラスを決定するための参照タンパク質配列は、限られた数の種においてのみ試験されており、グリホサートに対する耐性を説明できない場合がある。代償性変異、およびEPSPS関連ドメイン(主に真菌)の効果も、グリホサート58に対する感受性に影響を及ぼし得る。このホワイト ペーパーの分析は、4 つの EPSPS クラスに基づいています。ヒト腸内微生物叢中の細菌の調査では、それらの約30%が未分類であることが示され(すなわち、これらの種のEPSPSタンパク質は既知のクラスのいずれにも属さない)、他のEPSPSクラスを同定するためにさらなる研究が必要である。また、細菌および植物におけるEPSPSタンパク質配列はユニドメインであるのに対し、真菌EPSPSタンパク質はいくつかのドメイン59を含むことに留意すべきである。したがって、真菌におけるタンパク質の折り畳みは、グリホサートに対するEPSPS酵素の異なる応答をもたらし得る。さらに、耐性のさらなる非標的機構(例えば、排出ポンプおよびEPSPS遺伝子13の過剰発現)またはグリホサートに対する感受性(例えば、ミトコンドリア輸送鎖12に対するグリホサートの効果)は考慮されない。
GBPは1974年以来除草剤として存在し、1991年以来広く利用されてきたが、これはグリホサートに対する生物の潜在的な感受性を決定する最初のバイオインフォマティクス法である。この方法は、標的配列中の既知のアミノ酸残基の同定に基づく。したがって、我々の方法は、種に対するグリホサートの潜在的な効果のベースライン推定値を提供する。近い将来、新規バイオインフォマティクス法は、未分類配列12、54、55のグリホサートに対する潜在的な感受性を決定するために、EPSPSタンパク質の追加のクラスを含むべきである。加えて、EPSPS酵素の正確な挙動が単一のアミノ酸変化によって変化し得ることを考えると12、14、52、54、55、さらにインシリコ実験では、EPSPSタンパク質の折り畳みにおける小さな変動、ならびに真菌におけるタンパク質構造に対するEPSPS関連ドメインの影響を考慮に入れるべきである58.さらに、グリホサートに対する耐性は、EPSPSタンパク質56、57の過剰発現によって産生され得ることが示されている。したがって、コドン使用頻度60の改善に基づくバイオインフォマティクス分析は、遺伝子発現を最大化または最小化する新規EPSPS配列を同定するために利用され得る。
農家、政治家、政策決定者は、農薬の大量使用に伴うリスクを徹底的に理解することが緊急に必要です。したがって、生物の農薬に対する潜在的な感受性を明らかにするバイオインフォマティクスツールと、異なる環境で実施されたよく複製された、無作為化された、フィールドリアリスティックな実験研究の両方が必要です。グリホサートに対する生物の感受性を調べるために設計された提示されたバイオインフォマティクス方法は、他の農薬に対して調節することができる。同様に、実験生態学の方法は、関連する生態学的問題を研究するために適用することができる。これらの方法を組み合わせることで、野外観察、ゲノムデータ、農薬使用の間の死傷者を実証することができます。提示されたすべての方法は、リスク評価において非常に貴重です。バイオインフォマティクス法は、例えば、農薬に対する微生物の適応をモニタリングし、農薬に対する病原体の耐性の増加、統合害虫管理(IPM)における生物学的防除剤として使用される微生物への悪影響、および細菌における抗生物質耐性など、潜在的な他の関連するリスクを試験するための定量的方法を提供するために使用することができる。

現代農業における農薬の大量使用は、明らかに生物多様性の低下の主な原因です1。この論文は、グリホサートベースの製品(GBP)がその効率と手頃な価格のために世界で最も広く使用されている農薬になっているため、グリホサートに焦点を当てています2,3。農業分野で雑草を殺すことに加えて、GBPは造林、都市環境、家庭菜園で一般的に使用されています。さらに、それらは製造業者の指示に従って使用された場合、非標的生物に対して無毒であると宣言されている。しかしながら、近年の研究の増加により、グリホサートおよびその分解産物の残留物が土壌中に保持および輸送され、それによって非標的生物にカスケード効果を有することが明らかになっている4、5、6、7、8。グリホサートの効果は植物だけに限定されず、シキミ酸経路は多くの真菌および原核生物にも存在する。グリホサートは、aroA9としても知られるシキミ酸経路における酵素5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS)を標的とする。この酵素は、3つの必須芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン)の合成におけるシキミ酸経路の中心にあり、ほとんどの原核生物、植物、および真菌に存在する10,11。いくつかの微生物種は、EPSPS配列の変異を含むいくつかのメカニズムによってグリホサートに対する部分的または絶対的な耐性を発達させている。したがって、GBPの使用は、ヒト腸内微生物叢を含む植物および動物の微生物叢に直接影響を及ぼし得ることが示唆されている12、13、14。それにもかかわらず、GBPの使用は、微生物および微生物促進プロセスに依存する事実上すべての生態系機能およびサービスに悪影響を及ぼす可能性がある。結果として生じる脅威は、生化学的土壌プロセス、受粉生物学、および動物および人間の幸福に関係している可能性があります。これは、グリホサートがシキミ酸経路およびグリホサートに対する微生物の感受性を評価する方法にどのように影響するかについてのより包括的な理解を必要とする。
このプロトコルでは、フィールド実験からバイオインフォマティクス分析まで、グリホサートとGBPがマイクロバイオームに及ぼす影響をテストするパイプラインを提示します。我々は、グリホサート12に対する生物の潜在的な感受性を決定するために使用することができる最近発表されたバイオインフォマティクス方法を詳細に説明する。研究者の知る限り、これはGBPの活性成分に対する酵素EPSPSの固有の感受性を評価するための最初でこれまでのところ唯一のバイオインフォマティクスツールです。このバイオインフォマティクス法は、グリホサート標的酵素(EPSPS)12中の既知のアミノ酸マーカーの検出に基づいている。パイプラインは、1)GBPの効果をテストするための2つのフィールド実験の簡単な紹介、2)マイクロバイオーム分析(16S rRNA、ITS、およびEPSPS遺伝子)の簡単な要約、3)公共リポジトリからのEPSPS配列の収集、4)グリホサートに対する生物の潜在的な感受性の決定、および5)普遍的な微生物マーカー(16S rRNAおよびITS)からのEPSPSクラスの評価の5つの主要な作業段階(図1)に分かれています。

<table><tbody><tr><td>2100 バイオアナライザー 機器</td><td>Agilent</td><td>G2939B</td><td>PCR 産物の濃度と品質を確認するため</td></tr><tr><td>dNTP ミックス (各 10 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td>PCR 反応用</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA ポリメラーゼキット</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>PCR バッファーと PCR 増幅用 DNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Invisorb スピンプラント ミニキット</td><td>INVITEK 分子</td><td>1037100300</td><td>植物組織からのゲノムDNA抽出</td></tr><tr><td>イオンチップ Minifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4479672</td><td>微生物PCR産物のターゲットシーケンシング用</td></tr><tr><td>Ion PGMシステム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4462921</td><td>微生物PCR産物のターゲットシーケンシング用</td></tr><tr><td>Ion PGM Torrent Server</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4483643</td><td>微生物PCR産物のターゲットシーケンシング用</td></tr><tr><td>Pippinprep</td><td>SageScience</td><td>PIP0001</td><td>PCRアンプリコンのサイズ分画用</td></tr><tr><td>圧力タンク</td><td>Berthoud</td><td>102140</td><td>スプレーイングリホサートベースのフィールド製品用</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>カスタムメイド</td><td>PCR増幅用</td></tr><tr><td>ロータリー耕うん機</td><td>グリロ</td><td>984511</td><td>実験プロットで土壌を耕すため</td></tr><tr><td>S1000 ThermalCycler</td><td>BIO-RAD</td><td>1852196</td><td>PCR増幅用</td></tr></tbody></table>

グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

グリホサートベースの製品(GBP)は、世界中で最も一般的な広域スペクトル除草剤です。グリホサートの標的は、シキミ酸経路における酵素5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS)であり、これは植物において事実上普遍的である。酵素の阻害は、3つの必須アミノ酸の産生を停止します: フェニルアラニン, チロシン, トリプトファン.EPSPSは、古細菌や細菌などの真菌や原核生物にも存在します。したがって、GBPの使用は、土壌、植物、草食動物、および二次消費者のマイクロバイオーム組成に影響を与える可能性がある。この記事では、フィールド実験からバイオインフォマティクス分析までのマイクロバイオームに対するGBPの効果を評価するための一般的なガイドラインを提示し、いくつかの検証可能な仮説を提供することを目的としています。非標的生物でGBPを試験するために、2つの野外実験が提示される。まず、10の複製対照およびGBP処理プロットからの植物関連微生物をサンプリングし、無作作法をシミュレートし、分析する。第2の実験では、グリホサート残渣または未処理の対照肥料を含む家禽糞尿のいずれかによって受精された実験区画からサンプルが得られた。EPSPSタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析は、グリホサートに対する微生物の潜在的な感受性を決定するために利用される。マイクロバイオームに対するGBPの効果を推定する最初のステップは、標的酵素(EPSPS)に対するGBPの潜在的な感受性を決定することです。微生物配列は、公共のリポジトリから、またはPCR増幅によって得ることができる。しかし、フィールド研究の大部分では、マイクロバイオーム組成は、16S rRNAや内部転写スペーサー(ITS)などの普遍的なDNAマーカーに基づいて決定されています。このような場合、グリホサートに対する感受性は、近縁種を用いたEPSPS配列の確率的分析によってのみ推定することができる。EPSPS酵素に基づくグリホサートに対する生物の潜在的な感受性の定量化は、標的および非標的耐性機構を研究するためのさらなる実験のための堅牢なアプローチを提供する。

このプロトコルの目的は、除草剤グリホサートに対する生物の潜在的な感受性を定量化する、野外実験からバイオインフォマティクス分析まで、一般的なパイプラインを提供することです。実験2では、ウズラ飼料中の平均グリホサート濃度は164mg/kgであり、排泄物サンプル(尿と糞便を合わせた)の平均グリホサート濃度は199mg/kgであった。GBP汚染飼料を与えられたウズラから採取された寝具は、平均して158mg / kgを有し、0.17mg / kgのグリホサートを測定する対照寝具を有していた(表3)。野外実験では、植物種は土壌中のグリホサート残基に対して異なる反応を示した(セクション1)。オート麦およびカブの菜種のバイオマスは、GBP処理土壌と比較して対照土壌において大きかった。しかし、ファバ豆とジャガイモは、栽培シーズンの終わりにGBP処理の恩恵を受けるように見えた15。家禽糞尿中のグリホサートは、草(Festuca pratensis)およびイチゴ(Fragaria x vescana)の植物成長を減少させた(セクション1)。野外実験による微生物叢分析はまだ完全には分析されておらず、ここでは紹介していません(セクション2)。このプロトコルの結果は、直接(セクション3および4に示すように)または間接的に(セクション5に示すように)読み取られた場合、データセット内のグリホサートに対する潜在的に感受性および耐性のある生物の割合の尺度を提供する(図9)。この方法の使用を、公共リポジトリ12から得られたコアヒト腸内微生物叢の微生物種からのEPSPSタンパク質配列の集合体を用いて試験した。この研究では、最も豊富な101種の細菌種から890株をEPSPSClass法で分析し、感受性および耐性細菌の割合を定量化しました。その結果、コアヒト腸内微生物叢の種の54%がグリホサートに潜在的に感受性であることが示された12。この傾向は、原核生物の世界のほとんどでも観察されています。さらに、真核生物(主に植物および真菌)では、潜在的に敏感な種の割合はさらに高い12。さらに、この方法を利用して、EPSPSタンパク質の感受性の変化を微進化レベルで定量化しました(図10)14。我々は、分析した原核生物の32の密接に関連したグループのうち12において感受性状態の変化を同定した(表4)14。したがって、GBPsの連続使用は、植物、動物、および土壌のマイクロバイオームにおいて微生物の叶攣異常(すなわち、感受性および耐性細菌種の不均衡)を生じ得る。さらに、グリホサート耐性細菌の増加が多剤耐性マイクロバイオームを促進する可能性があるという仮説が立てられている14、41、42。したがって、このプロトコルは、EPSPS分類法がグリホサートに対するマイクロバイオームの固有の感受性の直接的な推定を提供するため、これらすべてのシナリオの解釈に光を当てる。グリホサートに対するEPSPSタンパク質の固有の感受性は系統学的に保存されているため14、既存のデータセットから未知のマイクロバイオームに結果を外挿することが可能である(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg"> 図1:一般 パイプライン 野外実験からバイオインフォマティクス解析まで、GBPに対する感度を解析するための汎用パイプラインです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg"> 図2:作物植物関連微生物に対するGBP残留物の影響を試験するための野外実験1。 実験場は、10個の対照プロットと10個のGBP処理プロット(23 m x 1.5 m)を交互に並べ、プロット間に1.5 mのバッファストリップで構成されています。2014年から年に2回、GBPプロットは市販のGBP(グリホサート濃度450g L-1、1プロットあたり5Lの水道水中の施用量6.4L ha-1)で処理され、対照プロットはグリホサートを含まない同じ量の水道水で処理されました。処理は、GBPが処理区画の外に広がるのを防ぐために、スプリンクラー先端のプラスチックフードを使用して手動圧力タンクで適用されました。GBP施用後2週間の安全期間の後、オート麦(Avena sativa)、ファバ豆(Vicia faba)、カブレイプ(Brassica rapa subsp. oleifera)を播種し、ジャガイモ(Solanum tuberosum)をプロットに植えました。研究された作物の植物、葉および根からの微生物叢サンプルは、2014年の実験の開始以来数回収集された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg"> 図3:野外実験2は、2つの多年生作物およびそれらに関連する微生物叢に対する肥料肥料中のGBP残留物の結果を試験した。 対照またはGBP汚染飼料を与えられた日本のウズラとの12ヶ月の鳥小屋実験から収集された寝具は、野外実験で肥料肥料として使用された。実験場は、6 x 6のチェス盤グリッドに配置された18のコントロールと18のGBPプロット(1 m x 1 m)で構成されていました。寝具は、2018年8月と2019年5月の2回(25L /プロット)実験場に広げられました。対照プロットは、対照飼料を与えられたウズラから採取された寝具で受精し、GBP汚染飼料を与えられたウズラからの寝具でGBPプロットを施肥した。対照寝具中のグリホサート残基は0.17mg / kgのグリホサートであり、GBP寝具では、その量は158mg / kgのグリホサートであった。2つの内生共生(E+)、2つの内生植物を含まない(E-) フェストゥカプラテンシス、および2つの フラガリア×ベスカナ が、最初の寝具の普及から約1ヶ月後の2018年9月にプロットごとに植えられました。植物のパフォーマンスと適応度の測定、ならびに根葉に関連する微生物叢のサンプリングは、2つの連続した成長期(2019年および2020年)に実施されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg"> 図4:16S rRNA遺伝子/ITS領域を用いた微生物分類群の解析と、EPSPS遺伝子を用いたグリホサートに対するマイクロバイオームの感受性 (A)微生物分類群を同定するための16S rRNAまたはITS配列の解析(B)グリホサートに対する微生物の感受性(GS-グリホサート感受性/GR-グリホサート耐性)を同定するためのEPSPS配列<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">の解析この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg"> 図5:EPSPSタンパク質配列のクラスを同定するアルゴリズム。 入力は、FASTA形式のEPSPSタンパク質配列である。このアルゴリズムは、グリホサートに対する潜在的な感受性を決定する参照タンパク質配列中の既知のアミノ酸マーカーとの比較を行う。このアルゴリズムは、自由にアクセスできるウェブサーバEPSPSClass29で実装された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg"> 図 6: EPSPSClass Web サーバーの基本的な入出力 (A)入力:FASTA形式のEPSPSタンパク質配列。(b)出力1−同一性:クエリ配列(クラスI〜IV)およびモチーフ(クラスIII)中に存在するアミノ酸マーカーの割合。(C)出力2 - 同一性:クエリーおよび参照配列のアラインメント。(D)出力3 - クエリと参照シーケンスのペアワイズアラインメント。(e)参照EPSPS配列: コレラ菌 (vcEPSPS、クラスI)、 コクシエラ・バーネティイ (cbEPSPS、クラスII)、 ブレブンジモナス・ベシキュリス (bvEPSPS、クラスIII)、 ストレプトマイセス・ダバウェンシス (sdEPSPS、クラスIV)。(F) 追加のブラスト検索と保存されたドメインの識別を実行する <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">ためのリンク この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg"> 図 7: EPSPS シーケンスの事前計算データセットへのアクセス。 図の指示に従って、事前に計算された EPSPS シーケンスのデータセットにアクセスします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg"> 図8:EPSPS配列を含まないマイクロバイオームプロジェクトにおける潜在的な感度を推定する方法の例。 この例では、原核生物種からの配列を含むAlignable Tight Genomic Clusters30のデータベースからの値を使用しています。マイクロバイオームプロジェクトからの仮説的な種は、 黄色ブドウ球菌、 コリネバクテリウム・ジフテリア、 カンピロバクター・ジェジュニ、 クラミジア・プシッタキ 、 スルホロバス・アイランディクスである。グリホサートに対する感受性スコアは、Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequencesとして計算される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg"> 図9:このプロトコルと仮説的な進化シナリオの結果の解釈のスキーム。 (A)マイクロバイオームでは、潜在的な感受性(緑)と耐性(赤)の細菌の割合は約50:50です。黒い点は分類されていない微生物種を示す。したがって、グリホサートに対するそれらの感受性は不明である。いくつかのマイクロバイオームでは、感受性細菌の割合は、ヒト腸内マイクロバイオーム12のようにわずかに高い。(B)時間の経過とともに、グリホサートの使用は、微生物の嚥下障害(すなわち、感受性および耐性細菌の割合の不均衡)をもたらし、異なる仮説的なシナリオにつながる可能性がある。(C)仮説的なケース1(選択なし):グリホサートの使用はマイクロバイオームに影響を与えない。したがって、感受性および耐性細菌の割合は一定のままである。(D)仮説的なケース2:グリホサートの使用は、グリホサートに感受性の細菌を集団から除去する。我々は、このシナリオが用量依存性であるかもしれないと推測する。(E)仮説的なケース3:グリホサートの使用による選択圧力は、細菌の感受性状態を変化させる EPSPS 遺伝子の変異を増強する。したがって、微生物集団全体がグリホサートに対して耐性になる。さらに、このシナリオでは、多剤耐性菌が増加する可能性があります。(F)仮説的なケース4:グリホサートの使用は、特定の細菌種の組成を変化させ、耐性細菌に対する不均衡を生じさせるが、一部の細菌種は、おそらく流出ポンプなどの追加の耐性機構または EPSPS 遺伝子の過剰発現のために、変化しないままである13。このシナリオはまた、グリホサート耐性細菌の増加、ならびに追加の抗生物質に対する細菌耐性の増加をもたらし得る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg"> 図10:種樹全体のグリホサートに対する予測感度の分布。 円グラフは、グリホサートに対して推定的に敏感(緑)または耐性(赤)であり、未分類(黒)の種の割合を示します。この図は、Rainioら14の許可を得て翻案されたものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg"> 図 11: ユーザー自身の参照シーケンスをテストするための EPSPSClass Web サーバーの入出力。(A) 入力 1: クエリ シーケンス。(B)入力2:基準系列。(c)入力3:参照配列中のアミノ酸マーカー。(d)出力:同一性:クエリ配列(クラスI〜IVおよびユーザ自身の参照配列)中のアミノ酸マーカーの割合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:マイクロバイオーム解析における16S rRNA遺伝子およびITS領域のPCR増幅のためのプライマーのリスト <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>
表2:異なるデータベース内の酵素5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS)のコード <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>
表3:平均グリホサート濃度 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>
表4:グリホサートに敏感/耐性の種の割合の要約表。 この表は、Rainioら14の許可を得て翻案したものである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表5:参照配列中のアミノ酸マーカーの位置 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a>

グリホサートベースの製品(GBP)は、世界中で最も一般的な広域スペクトル除草剤です。本稿では、GBPがマイクロバイオームに与える影響を定量化するための一般的なガイドラインを、フィールド実験からバイオインフォマティクス解析まで紹介します。

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

ここでは、マイクロバイオームに対するグリホサートの効果を評価するための実験を実施するための最良のバイオインフォマティクス方法を含むワークフローを提供します。主な利点は、将来のフィールドおよびラボ実験のための堅牢なテスト可能な仮説を提供することです。説明されている方法論は、植物、動物、および微生物を含む様々な系に適用することができる。方法論の各部分は非常に簡単です。おそらく最も困難な部分は、作業のさまざまな部分を実行できる学際的なチームを統合することです。手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるSuni Matthewです。まず、実験フィールドを、プロット間に植生のバッファーストリップを使用したコントロールとGBP処理の10回の反復に分割して、実験1を開始します。対照プロットを水道水で処理し、GBPプロットを市販のGBPで処理して、農業慣行において許容される最大グリホサート投与量を模倣する。実験植物から微生物叢をサンプリングする。畑から植物サンプルの10の複製を収集し、すぐに氷の上に置き、さらなる処理のために実験室に持ち込む。実験2では、12ヶ月間の鳥小屋実験で、GBP汚染または対照飼料を食べたウズラから木材削りくず、糞便、およびこぼれた飼料を含む寝具を収集します。寝具サンプルを、グリホサート濃度測定のために認定ラボに送付し、広げた直後に行います。各プロットに多年生草とイチゴの植物を植えて、それらの根と葉の微生物叢を研究します。植物サンプルを洗浄および滅菌することによって、内生微生物を同定し、除去する。サンプルが滅菌されたら、メーカーのプロトコールに従って市販の植物DNA抽出キットを使用してゲノムDNAを抽出します。ネストされたアプローチを使用して、16S rRNA遺伝子の可変領域V6~V8を増幅し、テキスト原稿に記載されているように、必要な数のサンプルに対してPCRマスターミックスを作成します。PCRの第1ラウンドでは、前方に799、逆に1492のプライマーを使用します。サーモサイクラーで増幅プロファイルを35サイクル設定します。増幅を検証するには、5マイクロリットルの増幅産物を用いて電気泳動を行い、PCR産物の残り25マイクロリットルをオートクレーブ処理した超純水で1対10の割合で希釈する。順方向のユニバーサルプライマー1062および逆方向の1390を用いて、25サイクルで第2ラウンドの増幅を行う。得られたPCR産物をオートクレーブ処理した超純水で等価比で希釈する。8サイクルで増幅の第3ラウンドを実行し、バーコードとP1アダプタシーケンスで製品にタグを付けます。バイオアナライザーでPCR産物の品質濃度を検証し、各サンプルのDNA30ナノグラムを構成する量を1.5ミリリットルのチューブにプールして等モルライブラリーを作製した。アガロースゲルカセット上の自動DNAサイズ選択システムを用いたサイズ分画によって、サイズ350〜550塩基対のアンプリコンを選択する。指定されたサイズのアンプリコンを含む溶出液をカセット内のバイアルに集め、精製された16S rRNA遺伝子ライブラリーを得る。回収した溶離液を1.5ミリリットルのチューブに移し、バイオアナライザーで純度と濃度を検証します。オートクレーブ処理した超純水を用いてDNAライブラリーを終濃度26ピコモルに希釈する。ITS領域を増幅するために、ITSプライマーによる反応を設定した後、増幅プロファイルをサーモサイクラー上に設定した。次いで、増幅産物5マイクロリットルを1.5%アガロースゲル上で分析し、オートクレーブ処理された超純水を用いて、残りの25マイクロリットルの生成物を1対10の割合で希釈する。バーコードタグ付きフォワードプライマーおよびP1アダプタータグ付きリバースプライマーを使用して、必要なサンプル数のPCRマスターミックスを作成します。希釈したPCR産物を鋳型として用い、第2ラウンドの増幅を行う。16S rRNA遺伝子のライブラリー調製と同様に、精製ITS領域用のライブラリーを準備する。EPSPSタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析を開始します。サーバー提供出力からのグリホサートに対するクエリ配列の潜在的な感受性を評価し、出力1はクエリ配列中に存在するアミノ酸マーカーの割合およびモチーフの数を示す。出力2は、マーカー残基に基づくクエリーおよび参照配列のアラインメントを示す。出力 3 は、クエリー・シーケンスと参照シーケンスの完全なペアごとのアラインメントを示しています。出力4は、コレラ菌、コクシエラ・バーネティイ、ブレブンジモナス・ベシキュリス、およびストレプトマイセス・ダバウェンシスのEPSPS参照配列を示す。出力ページの最後に、BLASTp や保存されたドメインなどの外部ツールへのリンクを見つけて、クエリ EPSPS シーケンスをさらに分析します。パブリック リポジトリから EPSPS シーケンスを特定したら、分類情報を含む EPSPS クラス サーバーのメイン ページと、50,000 を超えるシーケンスの EPSPS クラスからこれらのデータセットにアクセスします。圃場シーズンの終わりに植物の地上バイオマスを計量し、GBPプロットと対照プロットで植物の成長を比較します。スプレッドシートで、マイクロバイオーム実験用の細菌OTUを事前に計算されたデータセットにマッピングします。確率的スコアに基づいて、グリホサートに対する固有の感受性を計算する。この方法は、EPSPSタンパク質の感受性の変化を微小進化レベルで定量するために使用された。我々は、分析された原核生物の32の密接に関連したグループのうち12において感受性状態の変化を同定した。したがって、グリホサートベースの製品'連続使用は、植物、動物、および土壌マイクロバイオームにおいて微生物嚥下障害を生じさせる可能性がある。PCR前およびPCR後の手順の品質を確保して、最適なアンプリコンライブラリーを取得します。また、ソフトウェアを使用する前に、EPSPSタンパク質配列が部分的ではないことを確認してください。野外実験では、グリホサートによるコントロールの汚染を確実に防いでください。

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潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

学ぶ グリホサートがマイクロバイオームに与える影響を定量化するバイオインフォマティクス手法。EPSPSタンパク質解析と16S rRNAシーケンスにより、植物・動物・土壌の微生物叢変化を評価する実験ワークフローを解説します。

グリホサートベースの製品がマイクロバイオームに及ぼす潜在的な影響の定量化

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