Name: ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ 組織学的評価、蛍光血管造影、血網膜関門破壊アッセイを用いた糖尿病性網膜症ラットモデルの病態生理学的評価法。これらの技術は創薬研究と網膜構造変化の理解に有用です。

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著者らは、インド医学研究評議会(ICMR;ITR-2020-2882)は、Nirmal J博士への資金援助のため。また、マニシャ・マラニとハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニ中央分析研究所施設にジュニア・リサーチ・フェローシップを提供し、インフラ施設を提供してくれた大学助成金にも感謝します。

このプロトコルは、ハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニにある機関動物倫理委員会が提供するすべての動物ケアガイドラインに従います。
1. 網膜組織学
<ol><li>眼の核生成と固定<ol>
<li>生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、腹腔内経路を介して注射した高用量のペントバルビタール(150mg/kg)を用いて、年齢適合対照(14~15週齢)と共に安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。</li>
		<li>メスの刃を使って眼の鼻側頭部および側頭部に切開を行って眼球を有核化する。次に、鉗子とマイクロハサミを使用してその縁に沿って切断し、眼窩ソケットから目を取り除きます。 注:ラットを犠牲にする前に、固定液を準備しておいてください。 警告: ホルムアルデヒドは、皮膚、目、鼻、気道を刺激します。それはまた、強力な皮膚感作剤であるため、癌を引き起こす可能性があります。手袋を着用し、ボンネットの下で取り扱ってください21。</li>
		<li>シャーレ内のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液10mLで眼を十分に洗浄し、血液を除去した。固定液の浸透を容易にするために、目を囲む余分な脂肪を取り除きます。</li>
		<li>鉗子の助けを借りてすぐに5mLの固定液に目を置き、ガラスバイアルの壁にくっついていないことを確認してください。数秒間優しくかき混ぜ、キャップを適切なラベルと交換してください。眼を固定液中で室温の暗条件下で24〜48時間インキュベートする。</li>
	</ol></li>
	<li>組織のトリミング<ol>
<li>固定後、固定液から眼球を取り出し、10 mLのPBSで洗浄し、これを10 mLのPBSを入れたシャーレに入れ、4°Cで冷却した。</li>
		<li>マイクロ鉗子を使用して、視神経で目を保持し、マイクロハサミの助けを借りて パースプラナ でニックネームを作ります。角膜の縁全体を切断して、眼の前部カップを分離する。鉗子を使ってレンズをそっと摘んで捨て、視神経を切ってください。</li>
		<li>湾曲したマイクロハサミを使用して、後眼杯の縦断面を作り、視ディスクを通過して2つの半分に分割する。カセットのベースに置き、組織に支障をきたすことなく蓋を適切に閉じます。カセットに組織サンプル名と日付をラベル付けします。</li>
	</ol></li>
	<li>組織の脱水、透明化、およびパラフィン含浸<ol>
<li>50%、70%、90%、および100%エタノールの80mL中で徐々に移すことによってトリミングされた組織を脱水する。カセットをある濃度から別の濃度に移すときは、汚染を最小限に抑えるために清潔なティッシュペーパーにカセットテープを貼ってください。 メモ:各転写で組織を30分間(2回)放置します。このステップに費やされる合計時間は約 4 時間です。</li>
		<li>脱水後、カセットを80mLのキシレンに30分間(2回)移し、エタノールをキシレンで置換した。 注:キシレンとのインキュベーション後、組織は半透明になります。 警告: キシレンはベンゼン環を持つ芳香族化合物です。それは目や粘膜を刺激し、またうつ病を引き起こす可能性があります。</li>
		<li>最後に、組織中のキシレンを置換するために60°Cで予め加熱したパラフィンを組織に含浸させる。キシレン含有量を最小限に抑えるためにカセットをティッシュペーパーに数回軽くたたき、200mLのパラフィン(60°Cで液体)に2時間(1時間x2)入れます。 注意: 溶けたパラフィンは小さな脂肪滴を生じるため、吸入は呼吸不快感を引き起こす可能性があるため、避けてください。</li>
	</ol></li>
	<li>パラフィン埋め込み<ol>
<li>パラフィンを溶かし、ステーションが所望の温度に達するために使用する前に、少なくとも1時間前にパラフィン包埋機の電源を入れてください。溶融したパラフィンワックスをスチールモールドで満たし、熱い表面に置き、パラフィン容器から一度に1つのカセットを取り外します。</li>
		<li>鋼金型を高温表面から低温表面(4°C)に移動します。この時点で、金型内のワックスが固化し始めます。それが完全に固まる前に、鉗子の助けを借りて組織をワックスに入れ、後部カップの視神経椎間板部分が型の底に向くように組織を向ける。 メモ:組織が動かないようにし、目的の向きを維持してください。そうでない場合は、パラフィン全体が液化するまで金型を暖かい作業面に戻してから、ステップ1.4.2からやり直します。</li>
		<li>金型内のワックスが固化し始めたら、すぐにカセットベースを金型の上に置きます。カセットの上端より上のパラフィンで金型を慎重に充填し、急速に凝固させるために冷たい表面(-20°C付近)にゆっくりと移します。固まるまで、ステップ1.4.2の他のカセットでこのプロセスを繰り返します。</li>
		<li>すべての金型が固まったら、スチール金型をカセットから分離します。難しい場合は、もう少し待ってからもう一度やり直してください(無理に外さないでください)。完全な固化により分離が容易になる。今カセットはミクロトームによる切片化中に保持されるパラフィンブロックの基部となる。 注:このブロックは、さらに使用するために室温で保存することができます。この時点で、プロセスを停止し、後で続行できます (必要な場合)。</li>
	</ol></li>
	<li>セクショニング<ol>
<li>使い捨てミクロトームブレードをブレードホルダーに取り付けます。カセットの周りの余分なパラフィンワックスを取り除き、ブロックの上部と下部の両方がナイフと平行になるようにします。ブロックをカセットホルダーに合わせます。</li>
		<li>ハンドホイールのロックを解除して、ブロックの表面がナイフの端に接触するまで前進させます。組織がブロックの表面に視覚化されるまで、ブロック上の余分なパラフィンワックスをトリミングします。断面の厚さを5μmに設定し、5~6本の断面のリボンを切断する。</li>
		<li>鉗子を使用して、リボンを予め加温した水浴(約50°C)の表面に静かに移し、リボンを広げます。メイヤーのアルブミンでコーティングされたスライドガラスの断面を、その断面の下にスライドを持って集めます。切片を静かに持ち上げ、スライドを水平に37°Cで一晩乾燥させます。 メモ:スライドは、ドライボックスに室温で数ヶ月間保管することができます。このステップでは、プロセスを停止し、後で続行できます。</li>
	</ol></li>
	<li>染色<ol>
<li>パラフィンが溶融するために使用前に60°Cの熱風オーブンで染色されるスライドを1時間加熱し、 表1に記載の手順に従ってください。 注意:ヘマトキシリンとエオジンの汚れは、吸入または摂取すると有毒です。それらは発癌性であることが報告されている。</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>スタンディングタイム</td>
			<td>繰り返し (回数)</td>
		</tr>
<tr>
<td>キシレン</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>100%エタノール</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>90%エタノール</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>70%エタノール</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>50%エタノール</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘマトキシリン</td>
			<td>4分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">水洗い</td>
		</tr>
<tr>
<td>70%エタノール中の1%酸性アルコール</td>
			<td>30秒</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">水洗い</td>
		</tr>
<tr>
<td>スコットの水</td>
			<td>1分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">水洗い</td>
		</tr>
<tr>
<td>50%エタノール</td>
			<td>1分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>95%エタノール</td>
			<td>1分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.25% エオシン</td>
			<td>5 秒</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">水洗い</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>2分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>95%エタノール</td>
			<td>1分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>100%エタノール</td>
			<td>1分</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>キシレン</td>
			<td>5分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">マウント剤とカバースリップ</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.ヘマトキシリンおよびエオジン染色手順
2. 血液脳関門破壊アッセイ
<ol><li>血液と硝子体の採取<ol>
<li>生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、ケタミン(80mg/kg)およびキシラジン(8mg/kg)を用いて年齢適合対照(14~15週間)とともに麻酔する。ペダル離脱反射(つま先ピンチ)により麻酔状態を確認する。直ちに心臓穿刺により1mLの血液をエチレンジアミン四酢酸(EDTA)被覆チューブに集め、血漿を全血から分離する。</li>
		<li>腹腔内経路を通して注射された高用量のペントバルビタール(150mg / kg)を用いてラットを安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。目を核形成し、すぐにドライアイスの上に置きます。</li>
		<li>ドライアイスの上のきれいなペトリ皿に目を置き (推奨)、手順 1.2.2 で説明したように眼の解剖を開始します。</li>
		<li>レンズを取り外し、マイクロ鉗子を使用してガラス質を後部カップから慎重に引き出し、3〜4個のガラスビーズ(2〜4mm)を含む均質化チューブに入れます。 注: ドライアイスの解剖は、凍結条件下ではレンズと硝子体の取り外しが容易であるため、推奨されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの調製<ol>
<li>ビーズホモジナイザーでガラス質のユーモアを中速で10秒間均質化します。</li>
		<li>血液(1 mL)および硝子体サンプル(10-20 μL)を微量遠心チューブに移し、両方のサンプルを5200 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 注:ホモジナイゼーションが成功した場合、硝子体は遠心分離後に均一な一貫性を有する。ただし、硝子体の不均一な稠度の場合は、均質化時間を長くしてステップ2.2.1から繰り返す。</li>
		<li>両方のサンプルから上清を収集し、血漿サンプルをPBSでそれぞれ1:10および1:20の比率で希釈する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質定量と硝子体-血漿タンパク質比<ol>
<li>硝子体液および血漿サンプル中のタンパク質濃度を定量するには、希釈サンプル5 μLを250 μLのブラッドフォード試薬に加え、よく混合し、40分以内に590 nmでの吸光度を読み取る。 注: サンプルの吸収値が 1.0 を超える場合は、サンプルをさらに希釈し、手順 2.2.3 の手順を繰り返します。</li>
		<li>硝子体タンパク質レベルを同じラットの血漿タンパク質レベルに正規化し、健康なラットと糖尿病のラットのフォールド差を測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 蛍光血管造影
<ol><li>FITCデキストラン70000 染料注入<ol>
<li>生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、年齢一致対照(14~15週)とともに3%イソフルランを用いて麻酔し、ペダル離脱反射(つま先ピンチ)を確認した。温水(37-40°C)を入れたビーカーに尾を浸します。染料を注入する前に、70%エタノールで尾をきれいにしてください。尾の側静脈の位置を確認し、尾の下部の注射位置をマークします。 メモ: 針の挿入に失敗した場合は、現在の位置より上の別の位置(先端を尾の付け根まで)に挿入してみます。しかし、繰り返し刺すとラットのストレス発症につながり、血管収縮を引き起こす可能性があるため、一度注射することをお勧めします。</li>
		<li>50 mg/mL の FITC-デキストラン70000 色素溶液 1 mL を尾静脈から注入し、色素を 5 分間循環させます。腹腔内経路を介して注射された高用量のペントバルビタール(150mg / kg)でラットを安楽死させる。検出可能な心拍は、2〜5分以内に死亡を確認することはありません。ステップ 1.1.1 で説明したように、目を離核させます。 注:必要に応じて、目は4%ホルムアルデヒド溶液で30分以内に固定することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フラットマウントの準備<ol>
<li>フラットマウントを準備するには、スライドとカバースリップと一緒に解剖ツールを準備しておいてください。冷えたPBSで満たされたペトリ皿に目を置き、ステップ1.2.2で述べたように眼の解剖を開始します。</li>
		<li>次に、強膜と網膜の間に尖った鉗子の先端を置きます。カップの縁に沿って静かに動かし、網膜がどの時点でも強膜に付着していないことを確認します。障害物がある場合は、湾曲したマイクロはさみを使用してリムに沿ってその部分をゆっくりと切断します。</li>
		<li>網膜がどの側からも強膜に付着していないことを確認したら、視ディスクの近くで切り取り、網膜が強膜から完全に剥離するように小さな穴を開けます。網膜をPBS溶液にゆっくりと押し込み、ヘラまたは鉗子の助けを借りて清潔な平らなスライドの上に置きます。</li>
		<li>マイクロハサミまたはメス刃を使用して、網膜組織に小さな切り傷をつけ、それを4つの象限に分割する。 図 1 に示すように、中央の光ディスクが残した穴から切り込みが少なくとも 2 mm 離れていることを確認します。</li>
		<li>フラットマウントを乱すことなく、0.2 mLチップを使用して組織の側面から余分なPBSを除去します。</li>
		<li>フェード防止マウント培地(50 μL~100 μL)をフラットマウントの上に置き、カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡ですぐに視覚化します。 メモ: 手順全体を通して、最小限の光を維持してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フラットマウントの可視化<ol>
<li>共焦点顕微鏡の10倍の対物レンズの下でフラットマウントを視覚化します。タイルスキャンを実行して、フラットマウント全体を単一のイメージとしてキャプチャします。タイルの数は、網膜フラットマウントのサイズに依存する。また、Zスタッキングを実行して、異なる病巣の静脈および動脈を視覚化する(Zスタックの好ましいサイズは5μmであり、それに応じてZスタックステップの数は変化する)。</li>
		<li>PMTおよびHyD検出器を%ゲインでそれぞれ700-900および100-150として使用します。FITCデキストラン色素の発光範囲を510~530nmの範囲で選択してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

組織学 網膜組織学は、網膜細胞および層の形態学的変化を視覚化するために行われる。固定液の選択、固定期間、脱水、パラフィン含浸など、さまざまなステップを最適化する必要があります。固定液の浸透が遅くなるため、組織サイズは3mmを超えてはならない。一般的に使用される4%パラホルムアルデヒドは、房水および硝子体液と比較して溶液の浸透圧が比較的高いため、健康な眼においても網膜剥離をもたらし、偽陽性の結果をもたらす23。溶液の高い浸透圧は、体積収縮をもたらし、組織の収縮をもたらす。このプロトコルで使用される固定液は、1%ホルムアルデヒドと1.25%グルタルアルデヒドであり、これは比較的低い浸透圧を有し、組織の歪みを減少させ、網膜色素上皮層からの網膜剥離を最小限に抑え、また構造をその天然状態で保存する。固定液の別の選択肢は、酢酸およびエタノールとホルムアルデヒドである。固定液の酸性状態は組織の迅速な固定を助け、エタノールは固定液の浸透を改善する。しかし、エタノールと酢酸の比率を最適化することは、過剰濃度がそれぞれ組織の収縮または腫脹につながる可能性があるため、不可...

糖尿病性網膜症(DR)は、真性糖尿病の最も複雑な二次合併症の1つです。また、世界中の生産年齢人口における予防可能な失明の主な原因でもあります。3,240万人の盲人を対象とした最近のメタアナリシスでは、83万人(2.6%)がDR1のために失明した。糖尿病に起因する視力喪失の割合は、2015年に1.06%(0.15-2.38)で世界第7位にランクされました2,3。
糖尿病性網膜症は、後眼組織の血管異常によって診断される。臨床的には、網膜における血管新生に基づいて、非増殖性DR(NPDR)および増殖性DR(PDR)の2つの段階に分けられる。高血糖は、網膜の神経変性4,5、炎症6,7、および微小血管系8に関与するいくつかの経路に関与するため、DRの強力な調節因子と考えられています。高血糖のために誘発される複数の代謝合併症には、終末糖化産物(AGE)、ポリオール経路、ヘキソサミン経路、およびプロテインキナーゼ-C経路の蓄積が含まれる。これらの経路は、糖尿病性網膜症の異なる段階に基づく細胞増殖(内皮細胞)、遊走(周皮細胞)、およびアポトーシス(神経網膜細胞、周皮細胞、および内皮細胞)の原因である。これらの代謝変化は、網膜剥離、網膜細胞の喪失、血液網膜関門(BRB)の破壊、動脈瘤、血管新生などの生理学的変化につながる可能性があります9。
ストレプトゾトシン(STZ)誘発性1型糖尿病は、糖尿病の病因およびその合併症を評価するためのラットにおいて十分に確立され、広く受け入れられている慣行である。STZの糖尿病誘発作用は、膵島β細胞の選択的破壊によるものである10。その結果、動物はインスリン欠乏症、高血糖、多飲症、多尿症を受け、これらはすべてヒト1型糖尿病の特徴です11。重度の糖尿病誘発の場合、STZは成人期に静脈内または腹腔内に40〜65mg / kg体重で投与される。約72時間後、これらの動物は250mg / dLを超える血糖値を示す10,12。
神経変性、炎症、および血管新生による網膜の生理学的変化を理解するためには、実験動物モデルにおいて異なる技術を最適化するべきである。網膜細胞および網膜血管の構造的および機能的変化は、組織学、BRBブレークダウンアッセイ、および蛍光血管造影法などの様々な技術によって研究することができる。
組織学は、顕微鏡レベルでの細胞、組織、および器官の解剖学の研究を含む。それは細胞/組織の構造と機能の間の相関関係を確立します。組織構造の微視的な変化を視覚化および同定するためにいくつかのステップが実行され、それによって健康な対応物と罹患した対応物を比較する13。したがって、組織学の各ステップを細心の注意を払って標準化することが不可欠です。網膜組織学に関与する様々なステップは、標本の固定、標本のトリミング、脱水、透明化、パラフィンによる含浸、パラフィン包埋、切片化、および染色(ヘマトキシリンおよびエオジン染色)13,14である。
健康な網膜では、網膜を横切る分子の輸送は、内側の内皮細胞と周皮細胞、外側の網膜色素上皮細胞で構成されるBRBによって制御されます。しかし、内部BRB内皮細胞および周皮細胞は、罹患状態の間に変性を開始し、BRBも損なわれる15。このBRB分解により、多くの低分子量分子が硝子体組織および網膜組織に漏れ出す16。病気が進行するにつれて、他の多くのタンパク質分子(低分子量および高分子量)も恒常性障害のために硝子体および網膜組織に漏れます17。それは様々な他の合併症、そして最終的には黄斑浮腫および失明をもたらす。したがって、硝子体内のタンパク質レベルを定量化し、健常状態と糖尿病状態を比較して、損なわれたBRBを測定する。
蛍光血管造影は、蛍光色素を用いて網膜や脈絡膜の血液循環を研究するために使用される技術である。これは、静脈内経路または心臓注射 を介して フルオレセイン色素を注入することによって、網膜および脈絡膜の血管系を視覚化するために使用される18。色素が注入されると、最初に網膜動脈に到達し、続いて網膜静脈に到達する。この染料の循環は、通常、染料19の注入から5〜10分以内に完了する。糖尿病性網膜症や脈絡膜血管新生を含む様々な後部眼疾患を診断することは重要な技術です20。これは、正常および罹患状態における大小の血管系変化を検出するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>組織学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>塩酸ケタミン</td><td>トロイカア医薬品</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>インド免疫学限定</td><td></td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>ゾラファーマ</td><td></td><td>安楽死剤</td></tr><tr><td>固定液(1%ホルムアルデヒド、1.25%グルタルアルデヒド</td><td>HiMedia、Avra</td><td>MB059、ASG2529</td>社内<td>で調製</td></tr>された<tr><td>エタノール</td><td>ヘイマン</td><td>F204325</td><td>脱水</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>HiMediaMB-180</td><td></td><td>エタノールまたはパラフィンのクリア</td></tr>リングパラ<tr><td>フィンワックス</td><td>HiMedia</td><td>GRM10702</td><td>組織の埋め込みに使用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>HiMedia</td><td>TC503</td><td>アルブミンコーティングスライドを調製します。グリセロールと卵アルブミンを1:1の比率で混合してスライドにコーティング</td></tr>します <tr><td>塩酸</td><td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td><td>65955</td><td>1 % 酸性アルコールの調製用</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>HiMedia</td><td>AS119</td><td>エオシンの調製用</td></tr><tr><td>スコッツ水</td><td>ライカ</td><td>3802900</td><td>ブルーイング試薬</td></tr><tr><td>パパニコロウ溶液 1b ヘマトキシリン溶液</td><td>シグマ</td><td>1.09254.0500</td><td>核の染色</td></tr><tr><td>エオシン</td><td>HiMedia</td><td>GRM115</td><td>細胞質の染色、0.25% 溶液を調製しました自社</td></tr>製<tr><td>DPX封入剤</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td>網膜切片の可視化と保護</td></tr><tr><td><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製品</td><td>ホウロシル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>角膜鉗子</td><td>スティーブンス・インスツルメンツ</td><td>S5-1200</td><td>解剖</td></tr><tr><td>コリブリ鉗子</td><td>スティーブンス・インスツルメンツ</td><td>S5-1135</td><td>解剖</td></tr><tr><td>湾曲マイクロハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1311</td><td>解剖</td></tr><tr><td>バンナスハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1387</td><td>解剖</td></tr><tr><td>虹彩はさみ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1015</td><td>解剖</td></tr><tr><td>カセット</td><td>HiMedia</td><td>PW1292</td><td>組織学処理中に組織を保持するために</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>GT ソニック</td><td>GT Sonic-D9</td><td>温度維持</td></tr><tr><td>パラフィン埋め込みステーション</td><td>Myr</td><td>EC 350</td><td>パラフィンブロックの調製</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>鄭州南北計器機器有限公司</td><td>YD-335A</td><td>セクショニング</td></tr><tr><td>ブレード</td><td>ライカ</td><td>ライカ818</td>セ<td>クショニング</td></tr><tr><td>スライド</td><td>HiMedia</td><td>BG005</td><td>パラフィン組織切片保持</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>HiMedia</td><td>BG014C</td><td>封入剤添加後、組織を覆う</td></tr><tr><td><ストロング>血液網膜バリア ブレークダウン</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>B506</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td>該当なし</td> 該当<td>なし</td><td>解剖</td></tr><tr><td>ブラッドフォード試薬</td><td>シグマ</td><td>B6916</td><td>タンパク質定量</td></tr><tr><td><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>角膜鉗子</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S5-1200</td><td>解剖</td></tr><tr><td>Colibri鉗子</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S5-1135</td><td>解剖</td></tr><tr><td>湾曲したマイクロハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1311</td><td>解剖</td></tr><tr><td>バンナスハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1387</td><td>解剖</td></tr><tr><td>虹彩はさみ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1015</td><td>解剖</td></tr><tr><td>ガラス製品</td><td>ボロシル</td><td>適用</td><td></td>されない</tr><tr><td>EDTAコーティングチューブ</td><td>JK診断</td><td>適用されない</td><td>全血から血漿を分離</td></tr><tr><td>均質化チューブ</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU:115076200-CF</td><td>硝子体の</td></tr><tr><td>均質化 均質化キャップ</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU:115063002-CF</td><td>ガラスビーズの均質化</td></tr><tr><td></td><td>MPバイオメディカル</td><td>SKU:116914801</td><td>ガラス質の均質化</td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>ベルタン・インスツルメンツ</td><td>P000673-MLYS0-A</td> ガラス質96ウェルプレート<td>の均質化</td></tr><tr><td>- 透明</td><td>グルニエ</td><td>GN655101</td><td>タンパク質定量</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>SpectrMax M4</td><td>吸光度測定</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>REMI</td><td>CPR240 Plus</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td><ストロング>蛍光血管造影</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>FITC-デキストラン 70 kD (FITC、デキストラン、ジブチリンジラウレート、DMSO</td><td>FITC、デキストラン、ジブチリンジラウレート Sigma;HiMediaからのDMSO</td><td>FITC-F3651、デキストラン-31390、ジブチリンジラウレート-29123、DMSO-TC185</td><td>社内で調製</td></tr>された<tr><td>フルオロシッド</td><td>シグマ</td><td>F6182</td><td>退色防止封入剤</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>角膜鉗子</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S5-1200</td><td>解剖</td></tr><tr><td>コリブリ鉗子</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S5-1135</td><td>解剖</td></tr><tr><td>湾曲マイクロハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1311</td><td>解剖</td></tr><tr><td>バンナスハサミ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1387</td><td>解剖</td></tr><tr><td>虹彩はさみ</td><td>スティーブンスインスツルメンツ</td><td>S7-1015</td><td>解剖</td></tr><tr><td>ガラス製品</td><td>ボロシル</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>HiMedia</td><td>BG005</td><td>フラットマウント製剤</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>HiMedia</td><td>BG014C</td><td>封入剤添加後の組織カバー用</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMi8</td><td>フラットマウントの可視化</td></tr></tbody></table>

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

糖尿病性網膜症のような後部眼疾患は、網膜の生理機能を変化させる。糖尿病性網膜症は、網膜剥離、血液網膜関門(BRB)の破壊、および網膜血管新生を特徴とする。in vivoラットモデルは、網膜の構造と機能の変化を調べるための貴重な実験ツールです。我々は、網膜細胞、網膜血管系、および損なわれたBRBの形態学的変化を同定するために、ラットモデルにおいて3つの異なる実験技術を提案する。網膜組織学は、様々な網膜細胞の形態を研究するために使用される。また、定量的測定は、異なる網膜層の網膜細胞数および厚さ測定によって行われる。BRBブレークダウンアッセイは、BRBの分解による血漿から硝子体組織への眼外タンパク質の漏れを決定するために使用される。蛍光血管造影は、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化することにより、血管新生および血管の漏出を研究するために使用される。

網膜組織学 糖尿病性網膜では、網膜細胞は変性を受ける。さらに、浮腫22のために網膜層の厚さが増加する。ヘマトキシリンおよびエオジン染色後に得られた画像は、ImageJを用いて 図2 に示すように、細胞数および異なる層の厚さの測定に使用することができる。
血液網膜関門破壊アッセイ 糖尿病ラットにおいてBRBが損なわれると、漏出が顕著になり、血漿から網膜および硝子体への生体分子の蓄積につながる。糖尿病ラットでは、血漿から硝子体へのタンパク質漏出は、健康なラットと比較して約3倍高い(図3)。タンパク質は、ローリー法、ビシンコニン酸(BCA)法、ブラッドフォード法(本稿のセクション2.3で言及)などの任意のキット法を使用して推定することができる。処理の遅れが網膜との強い硝子体接着につながり、分離が困難になる可能性があるため、眼を新たに解剖すること...

糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

これらの技術の全体的な目的は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病性網膜症ラットモデルにおける網膜病態生理を評価することである。糖尿病性網膜症は失明の主な原因の1つです。継続的な検索は、糖尿病性網膜症を治療するためのより良い有効性とより長い作用を有する薬理学的薬剤を発見するために進行中である。前臨床動物モデルにおける薬理学的薬剤の発見プロセスは、重要な役割を果たしている。これらの動物モデルは、眼の後部組織の構造的および機能的変化を理解するのに役立つ。したがって、後部セグメントの問題でこれらの変化を研究するための3つの異なるテクニックを紹介します。網膜細胞の層状変化を研究する組織学、血漿から硝子体内に漏れたタンパク質を定量して妥協したBRBを研究するBRBブレークダウンアッセイ、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化する蛍光血管造影法を実証しています。高用量のペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍なしでその死を確認する。メスの刃を使って眼の鼻側頭部および側頭部に切開を行って眼球を有核化する。次に、その縁に沿って切断して、眼窩ソケットから目を取り除きます。目を取り囲む余分な脂肪を取り除き、5mLの固定液に入れます。眼を固定液中で24〜48時間インキュベートする。固定後、固定液から眼球を取り出し、10mL PBSを充填したシャーレに移す。マイクロ鉗子を使用して、視神経で目を保持し、マイクロハサミの助けを借りてパースプラナでニックネームを作ります。角膜の縁全体を切断して、前部カップと後部カップを分離します。レンズを外し、視神経を切断します。後部カップを2つの半分に切り、視神経を通過する。各半分を別々のカセットに移します。エタノール濃度を50%から100%エタノールに徐々に増加させることによって組織を脱水する。そして最後に、キシレンでエタノールをきれいにする。60°Cで予熱したパラフィンを組織に含浸させ、組織内のキシレンを置換する。そのベースとして組織とカセットを保持するためにスチールモールドを使用してパラフィンブロックを準備します。ブロックを準備している間、目の視ディスク部分はスチール金型の底に面する必要があります。カセットをパラフィンで満たし、冷たい表面に移します。ブレードとカセットをミクロトームのそれぞれのホルダーに取り付けます。ミクロトームを使用して、余分なパラフィンワックスをトリミングし、厚さ5マイクロメートルの5〜6枚のリボンを切断する。リボンを予め温めた水浴の表面に移してリボンを広げます。アルブミンでコーティングしたスライドガラス上の切片を集める。スライドを摂氏 37 度で一晩乾燥させます。ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行うには、スライドを摂氏60度で1時間予熱し、パラフィンを溶融させる。原稿に記載されている染色手順に従ってください。組織の水分補給から始めて、ヘマトキシリンで染色し、続いてエオジンで染色する。次に、組織を脱水し、切片にマウント媒体を追加します。カバースリップを断面に置き、光学顕微鏡で可視化します。血液網膜関門破壊アッセイを行うには、ケタミンとキシラジンを用いてラットを麻酔し、つま先をつまんで麻酔状態を確認する。心臓の位置を確認し、24ゲージの針で1mLのシリンジを挿入し、心臓穿刺によって血液を引きます。十分な血液が採取されたら、EDTAコーティングされたチューブに移す。溶血を防ぐために優しく混ぜる。眼を核形成し、直ちにドライアイスに移す。凍結条件下で、角膜および水晶体の除去によって眼の解剖を開始する。網膜からの汚染なしに鉗子を使用して眼の後部から硝子体を引っ張る。3〜4個のビーズで均質化チューブに移します。ビーズホモジナイザーを用いて中速で10秒間サンプルを均質化する。血液および硝子体液サンプルを微量遠心チューブに移し、さらに処理します。両方のサンプルを5で遠心分離し、摂氏4度で10分間200g。マルチチャンネルピペットを使用して、250マイクロリットルのブラッドフォード試薬をウェルに加えます。PBSを用いて硝子体試料を10倍、血漿試料を20倍に希釈する。5マイクロリットルの希釈サンプルをブラッドフォード試薬に加え、よく混合する。サンプルを20〜30分間インキュベートし、次いで96ウェルプレートリーダーを用いて590ナノメートルでの吸光度を測定する。試料の強度は、タンパク質の濃度に正比例する。蛍光血管造影を行うには、3%イソフルランを用いてラットを麻酔し、つま先パンチにより麻酔状態を確認する。染料を注入する前に尾を温水に浸してください。1mLあたり50mgのFITC−デキストラン溶液1mLを側尾静脈に注入する。染料を5〜10分間循環させます。ペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍によってその死を確認する。眼を核形成し、フラットマウントの準備に進みます。網膜フラットマウントを準備するには、繊維を含まないキムワイプの上に目を置き、目の前部を切断します。ガラス質のユーモアとともに、レンズを目の後部からゆっくりと引き抜きます。後部をPBSで満たされたペトリ皿に移し、視神経を切断する。次に、尖った鉗子の先端を強膜と網膜の間に置きます。カップの縁に沿って静かに動かして、網膜がどの時点でも強膜に付着していないことを確認してください。網膜が強膜から完全に剥離するように、視神経椎間板の近くで切断する。どの側も強膜に網膜が付着していないことを確認したら、PBS溶液にゆっくりと押し込みます。鉗子の助けを借りて、それに損傷を与えることなく、きれいなスライドガラスに網膜を移します。マイクロはさみまたはメス刃を使用して、図に示すように網膜に4つの切り込みを入れ、4つの象限に分割します。網膜周囲から余分なPBSを除去し、網膜フラットマウントに退色防止マウント媒体を追加します。カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡下でフラットマウントを視覚化します。蛍光血管造影の全プロセスは、FITC−デキストラン色素からの蛍光の消光を避けるために、最小の光の下で行われることにここで注意することが重要です。糖尿病ラットでは、網膜細胞は変性を受け、さらなる合併症を引き起こす。これらの構造変化は、組織学技術によって視覚化され、網膜の細胞数および厚さを決定することができる。糖尿病ラットの場合、浮腫のために網膜層の厚さが増加する。したがって、この技術は、糖尿病性網膜症を治療するための様々な潜在的な薬理学的薬剤をスクリーニングするのに役立つ。糖尿病による網膜の代謝変化は、周皮細胞の喪失および血液網膜関門の破壊を引き起こす。網膜および硝子体へのタンパク質および他の生体分子の漏出があるので、総タンパク質のレベルは糖尿病ラットの硝子体において増加する。血液網膜関門の破壊を防ぐことは、糖尿病性網膜症の進行を著しく妨げる可能性がある。糖尿病性網膜症では、血管内皮増殖因子の発現が増加し、それが新しい血管の形成につながる。これらの血管は正常な網膜構造を乱すので、その神経支配は糖尿病性網膜症を治療するための主な関心事である。蛍光血管造影技術は、ここで強調したように、新しい血管および血管の漏出を視覚化するために利用される。しかしながら、血管新生は、糖尿病誘発の6〜12ヶ月後にのみ顕著である。この技術は、血管新生および血管漏出の神経支配に対する薬物治療の効果を定量化するのに役立ちます。糖尿病性網膜症の将来の治療には、より効率的な薬理学的薬剤が必要であるが、将来の治療は、疾患の病因をよりよく理解することによってのみ達成することができる。これらの技術を習得することは、研究者が糖尿病性網膜症の病因についてよりよく理解するのに役立ち、より良い薬理学的介入の発見につながる可能性があります。

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