Name: 固定化トロポミオシンキナーゼ受容体Bと相互作用する特殊な植物代謝産物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶ 細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて、固定化トロポミオシンキナーゼ受容体Bと相互作用する植物代謝産物を同定する方法。この技術は複雑な天然抽出物から薬理活性化合物を効率的に発見するのに役立ちます。

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Z.C.A.は、トルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2219-国際ポスドク研究フェローシッププログラムの支援を受けました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立補完統合医療センターによって、賞番号1R41AT011716-01の下で支援されました。この研究は、米国生薬学会のスターターグラント、L.C.へのレジステクノロジーズ助成金によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Lukasz CieslaはIAMのプロバイダーであるRegis Technologiesと協力しています。パソコン。DD2 パーティクル。

特殊な代謝産物の複雑な混合物中に存在する活性化合物の同定は、非常に困難な作業である23。伝統的に、個々の化合物は単離され、その活性は異なるアッセイで試験される。このアプローチは、時間と費用がかかり、しばしば、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物23の単離および同定をもたらす。現在使用されているハイスループットスクリーニングアッセイは、すでに既知の標的を有するコンビナトリアルケミストリーライブラリーのスクリーニングに大きく依存しており、複雑な混合物中に存在する生物学的に活性な化合物を同定および単離するようには設計されていない53。
CMACは、TMPs23、24、54を標的とする化合物の同定を可能にする。この技術ではTMPsを有する細胞膜断片がIAM固定相粒...

植物混合物は、薬理学的に活性な化合物1に富んでおり、新薬ヒットおよびリード2、3、4、5の同定のための良好な供給源として役立つ。天然物からの新薬の発見は実り多いアプローチであり、現在承認されている多くの薬は、自然界で最初に同定された化合物に由来しています。天然化合物の化学的多様性は、化学的に合成された分子の人工ライブラリに匹敵することは困難です。多くの天然化合物は、ヒトタンパク質標的と相互作用し、調節し、進化的に最適化された薬物様分子と考えることができる6。これらの天然化合物は、神経学的障害6において使用する薬物鉛同定に特に適している。アルツハイマー病(AD)の管理のために現在FDAが承認している2つの薬は、天然アルカロイド、すなわちガランタミンとリバスチグミン(フィゾスチグミンの誘導体)に由来しています6。L-DOPA, 現在、パーキンソン病のための最も一般的に処方薬, 最初にソラマメから同定されました (Vicia faba L.)ペルゴリドおよびリスリド、ドーパミン作動性受容体アゴニストは、寄生菌クラビセプス・プルプレア由来の天然麦角アルカロイドの誘導体である8.レセルピンは、インドのヘビの根(Rauvolfia serpentina(L.ベンス、元クルツ)から単離されたアルカロイドであり、最初の抗精神病薬9の1つであった。近年、調節不全の免疫応答および全身性炎症は、大うつ病性障害または神経変性疾患などの多数の神経学的疾患の発症に関連している10。植物ベースの食事療法と他のライフスタイル介入は、高齢者の認知能力および機能的能力を改善することが見出されている11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21.トリテルペンおよびポリフェノールに属するある種の求電子性分子は、インビトロおよびインビボモデルの両方において炎症応答を調節することが見出されている12。例えば、α,β−不飽和カルボニル(例えば、クルクミン、シンナムアルデヒド)、またはイソチオシアネート基(例えば、スルフォラファン)を含む天然化合物は、マウスインターロイキン−3依存性プロB細胞株における炎症誘発性サイトカインの下流合成を阻害するToll様受容体−4(TLR4)二量体化を妨害する12、22.疫学的証拠は、複雑な食品マトリックス中に存在する食事性植物化学物質も、新薬リードの実行可能な供給源を構成する可能性があることを強く指摘している6。
植物ベースの食品を含む植物抽出物中に存在する生物学的に活性な分子の同定における主要な障害の1つは、調査されたサンプルの複雑さである。伝統的に、個々の化合物は単離され、精製され、続いて生物学的活性について試験される。このアプローチは、通常、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物の同定につながる。定義された分子標的を伴わない表現型創薬アプローチは、複雑な混合物のバイオガイド分画に依存する23。このアプローチでは、抽出物は、より複雑でないサブフラクションに分画され、その後、表現型アッセイで試験される。活性化合物の単離および精製は、アッセイにおいて検証された生物学的活性によって導かれる。特定の薬物標的の同一性の知識は、複雑な混合物中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定を有意にスピードアップし得る。これらのアプローチは、通常、分子標的、例えば酵素の固定化に基づいており、固体表面上の、磁気ビーズ23などが挙げられる。固定化された標的は、その後、スクリーニング実験において使用され、標的と相互作用する化合物の単離をもたらす。このアプローチは、細胞質ゾルタンパク質を標的とする化合物の同定に広く使用されてきたが、膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化学物質の同定にはあまり一般的に適用されていない23。TMPsの固定化におけるさらなる課題は、タンパク質の活性が、細胞膜リン脂質およびコレステロール23,24などの二重層中の他の分子との相互作用に依存するという事実に由来する。膜貫通標的を固定化しようとする場合、タンパク質と天然のリン脂質二重層環境との間のこれらの微妙な相互作用を保存することが重要です。
細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)では、精製されていないタンパク質と細胞膜断片が、人工膜(IAM)固定相粒子23に固定化される。IAM固定相は、ホスファチジルコリン類似体をシリカ上に共有結合することによって調製される。最近、遊離アミン基およびシラノール基が末端キャップされているIAM固定相の新規クラスが開発されている(IAM.パソコン。DD2粒子)。CMACカラム調製中、細胞膜断片は吸着によってIAM粒子の表面に固定化されます。
CMACカラムは、イオンチャネル(例えば、ニコチン性受容体)、GPCR(例えば、オピオイド受容体)、タンパク質トランスポーター(例えば、p-糖タンパク質)などを含む、異なるクラスのTMPを固定化するために今日まで使用されてきた24。固定化タンパク質標的は、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば、解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(kon およびkoff)の決定、ならびに複合体マトリックス中に存在する潜在的な新薬リードの同定の過程において使用されてきた24.ここでは、多数の神経系疾患の創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を用いたCMACカラムの調製法を紹介します。
これまでの研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)/TrkB経路の活性化が、ADや大うつ病性障害などの特定の神経学的疾患の改善と関連していることが示されました25,26,27,28。ADのBDNFレベルおよびその受容体TrkB発現の減少、および同様の低下がAD29の動物モデルにおいて海馬機能を損なうことが報告された。BDNFのレベルの低下は、AD患者30、31、32の血清および脳において報告された。タウ過剰発現または過剰リン酸化は、初代ニューロンおよびAD動物モデルにおけるBDNF発現をダウンレギュレートすることが見出された33、34、35。さらに、BDNFは、インビトロおよびインビボでβアミロイド誘導神経毒性に対して保護効果を有することが報告された36。ラット脳へのBDNFの直接投与は、認知障害のある動物における学習および記憶を増加させることが示された37。BDNF/TrkBは、AD28,38を含む神経学的および精神医学的障害を改善するための有効な標的として浮上した。ADにおける治療法の開発のためにBDNF/TrkBシグナル伝達経路を標的にすることは、この疾患の理解を潜在的に強化するであろう39。残念なことに、BDNF自体は、その貧弱な薬物動態学的特性および有害な副作用のために治療として使用することができない40。TrkB/BDNF経路の小分子活性化剤が、潜在的なTrkBリガンドとして探索されている41、42、43。試験された低分子アゴニストのうち、7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)はBDNF/TrkB経路41,44,45,46を活性化することが示されている。7,8-DHFの誘導体(R13;4-オキソ-2-フェニル-4H-クロメン-7,8-ジイルビス(メチルカルバメート))は、AD47の可能性のある薬物として現在検討されている。最近、いくつかの抗うつ薬がTrkBに直接結合し、BDNFシグナル伝達を促進することによって作用することが示され、様々な神経学的障害を治療するための有効な標的としてTrkBを追求することの重要性をさらに強調する48。
このプロトコルは、機能的なTrkBカラムおよびTrkB-NULLネガティブコントロールカラムをアセンブルするプロセスを記述している。カラムは、既知の天然物小分子リガンドである7,8-DHFを使用して特徴付けられます。さらに、TrkBと相互作用する化合物の同定のために、植物抽出物を例に挙げて複雑なマトリックスをスクリーニングするプロセスについて説明する。

<table><tbody><tr><td>7-8ジヒドロキシフラボン水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td><td>&ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 (ATP) 二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>VWR ケミカルズ BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>BDNF 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 &mu;L</td><td>一次抗体; 2 mg/mL 濃度</td></tr><tr><td>ベンザミジン塩酸塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>脳由来神経栄養因子 (BDNF) ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 &mu;g</td><td>組換え体、大腸菌で発現、凍結乾燥粉末、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>VWR 分析</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>コール酸ナトリウム塩</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>デュースホモジナイザー</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL、285 mm (全長)、32 x 140 mm (O.D. x H)</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>VWR 分析</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 mL</td><td>無菌ろ過済み、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>G418 二硫酸塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 mL</td><td>50 mg/mL H2O、0.1 &mu;mろ過済み、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>固定化人工膜(IAM.パソコン。DD2)</td><td>レジステクノロジーズ(株)</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>VWR 分析</td><td>BDH9244-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Nikon</td><td></td><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清 (10%)</td> <td>Life Technologies</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>K812-500 mL</td><td>1x</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>VWR Life Science Ambreso</td><td>M221-1 mL</td><td>プロテオミクスグレード、50 mM AEBSF、30 & micro;M アプロトニン、1 mM ベスタチン、1 mM E-64 および 1 mM ロイペプチン</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td>、<td>L-グルタミンおよび重炭酸ナトリウム、液体、滅菌ろ過済み、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>二次抗体ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y 神経芽細胞腫細胞株、Trk-B</td><td>ケラファスト</td><td>ECP007</td><td></td></tr> <tr><td>を発現SH-SY5Y Trk-NULL細胞株</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>スネーク皮膚透析チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>BDH VWR 分析</td><td>BDH9286-2.5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tricorn 5/20 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 mL</td><td>0.25%、滅菌ろ過済み、細胞培養に適した、2.5 gのブタトリプシンおよび0.2&nbsp;g EDTAの</td></tr></tbody></table>

固定化トロポミオシンキナーゼ受容体bと相互作用する特殊な植物代謝産物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラム

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

植物、真菌、細菌、海洋無脊椎動物によって合成された化学物質は、新薬のヒットとリードの豊富な供給源となっています。医療現場で一般的に使用されるスタチン、ペニシリン、パクリタキセル、ラパマイシン、またはアルテミシニンなどの医薬品は、最初に同定され、天然物から単離されています。しかし、天然源からの生物学的に活性な特殊代謝産物の同定および単離は、困難で時間のかかるプロセスである。伝統的に、個々の代謝産物は、バイオマスの抽出に続いて、複雑な混合物から単離および精製される。続いて、単離された分子を機能アッセイにおいて試験し、それらの生物学的活性を検証する。ここでは、複雑な混合物から直接生物学的に活性な化合物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの使用を紹介します。CMACカラムは、天然のリン脂質二重層環境に埋め込まれた固定化機能性膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化合物の同定を可能にします。これは標的を絞ったアプローチであり、新たに同定された小分子薬物候補で活性を調節しようとするTMPを知る必要がある。このプロトコルでは、多数の神経系疾患に対する創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を有するCMACカラムを調製するアプローチを提示する。この記事では、TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株を使用して、固定化されたTrkB受容体を有するCMACカラムを組み立てるための詳細なプロトコルを提供する。我々はさらに、カラムの機能性を調査するためのアプローチと、TrkB受容体と相互作用する特殊な植物代謝産物の同定におけるその使用を提示する。

プロトコールに従って、2つのCMACクロマトグラフィーカラムを組み立てました:1つは過剰発現TrkBを有する固定化SH-SY5Y神経芽腫細胞膜断片、もう1つはSH-SY5Y TrkB-NULL細胞膜断片を有する。正しく組み立てられたCMACカラムを図 1 に、細胞膜断片の固定化に関与するステップを 図2に示します。
IAM上のTrkB受容体の固定化以来。パソコン。DD2クロマトグラフィー固定相はこれまで試みられていなかったが、受容体の固定化の成功は、マーカーリガンド:7,8-DHFを用いた抗体染色および正面アフィニティークロマトグラフィーによって確認された。抗体染色実験の概略図を 図2に示す。TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株から得られた細胞膜断片およびTrkB受容体を有さない親細胞株からの細胞膜断片(TrkB-NULL))をIAMに固定化した。パソコン。最適化されたプロトコルを使用したDD2...

プロトコールは、機能的な膜貫通型トロポミオシンキナーゼ受容体Bタンパク質を含む固定化細胞膜断片を用いた細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの調製を記載しています。これらの受容体と相互作用し、複雑な天然混合物中に存在する特殊な植物代謝産物の同定におけるCMACカラムの使用についても説明します。

固定化トロポミオシンキナーゼ受容体Bと相互作用する特殊な植物代謝産物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラム

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

この縦書きは、機能的な膜貫通型受容体を持つ細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムを組み立てる際の重要なステップを示しています。これらのカラムは、複雑な抽出物中に存在し、固定化された膜貫通型受容体と相互作用する小分子の同定に使用できます。細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムは、複雑な混合物中に存在する生物学的に活性な化合物の同定を高速化します。細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムの使用は、植物、真菌、または細菌抽出物などの複雑な天然マトリックス中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定に関心のある人にとって特に興味深いものとなり得る。開始するには、120ミリリットルのベンズアミジンを5ミリリットルの超高純度脱イオン水に溶解して200ミリモルのベンズアミジンストック溶液を調製する。ヒュームフード内の10ミリリットルのエタノールに0.017グラムのPMSFを溶解することによって、10ミリモルのPMSFストック溶液を調製する。市販のプロテアーゼ阻害剤混合物を1ミリリットルの超純イオン交換水に溶解して100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを調製する。よく混ぜ合わせ、200〜300マイクロリットルのカクテルをアリコートします。1ミリリットルのイオン化超純水に55.114ミリグラムのATP二ナトリウム塩水和物を溶解して100ミリモルのATP原液を調製する。十分に混合し、混合物の100マイクロリットルをアリコートする。3.03グラムのトリス-HCL、2.9グラムの塩化ナトリウム、0.22グラムの塩化カルシウム無水、0.2グラムの塩化マグネシウム六水和物、および0.19グラムの塩化カリウムを500ミリリットルの超高純度脱イオン水に溶解して緩衝液を調製する。17.3ミリリットルのトリス緩衝液を0.3ミリリットルのベンズアミジン原液、0.2ミリリットルのPMSFストック溶液、0.2ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル、20マイクロリットルのATPストック溶液、2ミリリットルのグリセロール、および0.029グラムのEDTAと混合することによってホモジナイズ緩衝液を調製する。塩酸溶液を用いてpHを7.4に調整する。4°Cで回収した細胞を400 x gで5分間スピンダウンし、上清を除去し、残りの細胞ペレットを10ミリリットルの1X pH 7.4氷冷PBSで洗浄する。上清を捨て、20ミリリットルのホモジナイズバッファーを加える。円錐形のチューブを氷の上に置きます。細胞懸濁液を40ミリリットルのDounceホモジナイザー組織グラインダーに移し、40回の上下の乳棒ストロークを使用して氷上で懸濁液を手動で均質化する。ホモジナイズした細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、ペレットを捨て、上清を新しい円錐管に移す。細胞膜ペレットを保存し、上清を捨てる。8.7ミリリットルの緩衝液を0.1ミリリットルのPMSFストック溶液、0.15ミリリットルのベンズアミジンストック溶液、0.1ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテル、10マイクロリットルのATPストック溶液、1ミリリットルのグリセロール、および0.2グラムのコール酸ナトリウムと混合することによって可溶化緩衝液を調製する。可溶化緩衝液を細胞膜断片と共に円錐管に移す。ペレットを再懸濁する。得られた混合物を摂氏4度で150RPMで18時間回転させる。18時間後、可溶化混合物を摂氏4度で47、900 x gで30分間遠心分離する。100 ミリグラムの IAM を追加します。パソコン。DD2粒子を上清にし、得られた懸濁液混合物を摂氏4度で150RPMで1時間回転させた。24グラムのトリス塩酸、23.4グラムの塩化ナトリウム、0.06グラムの塩化カルシウム、5.85グラムのEDTA、および0.07グラムのPMSFを加えて、4リットルの超高純度脱イオン水に透析バッファーを調製する。PMSFをまず少量のエタノールに溶解し、次いで緩衝液と共にビーカーにゆっくりと加える。透析チューブのセルロース膜を10センチカットして透析チューブを作製し、IAMを含む懸濁液を移した。パソコン。DD2粒子および細胞膜断片を透析チューブに入れる。透析チューブの両端を透析チューブクリップで閉じます。透析チューブを透析バッファーに入れます。24時間後、新しく調製した透析バッファーに透析チューブを入れ、さらに24時間透析を続けた。IAMを洗浄するために使用される10ミリモルのpH 7.4酢酸アンモニウム緩衝液を調製する。パソコン。DD2粒子およびカラム内特性評価実験は、0.778グラムの酢酸アンモニウムを1リットルの超高純度脱イオン水に溶解した。透析の48時間後、透析緩衝液から透析チューブを取り出し、透析チューブの内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに移す。上清を捨て、残りのペレットを10ミリリットルの酢酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄する。3回目の洗浄後、残りのペレットを1ミリリットルの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。それを十分に混合し、得られたスラリーを使用して5 x 20ガラスカラムを充填し、CMACクロマトグラフィーカラムを得た。カラムを充填するには、酢酸アンモニウムバッファーで浸した下部フィルターをフィルターホルダーに入れます。フィルターホルダーをガラスカラムに嵌め込み、カラムキャップをねじ込んでホルダーの位置を固定します。カラムをフィンガークランプに垂直に置き、ラボスタンドに固定します。カラムの下にビーカーを置き、ピペットチップをガラスカラム壁に保持するシングルチャンネルピペッターで少量のスラリーをガラスカラムにゆっくりと移します。パッキングプロセスをスピードアップするには、各ステップの間にマイクロピペットで固定ベッドの上からバッファーを除去します。上部フィルターを配置し、固定相の上にバッファーが残らないようにアダプター・ユニットをねじ込みます。アダプター・ロックでアダプター装置の位置を固定します。カラムを高速液体クロマトグラフィーポンプに接続し、酢酸アンモニウム緩衝液でカラムを一晩洗浄し、流速を毎分0.2ミリリットルに設定した。長期間保存するには、酢酸アンモニウムバッファー中の0.05%アジ化ナトリウム溶液でカラムを稼働させ、アジ化ナトリウムを使用するときはラボコート、安全メガネ、手袋を着用し、摂氏 4 度で保管してください。パソコン。DD2粒子は、固定化された神経芽細胞腫TrkB細胞膜断片と共に、BDNFの存在下で、蛍光粒子を生じた。TrkBヌル細胞膜内包IAM粒子において蛍光は観察されなかったか、またはTrkB細胞膜内包IAM粒子のようにBDNFが用いられなかった場合。機能的CMACカラムに固定化されたTrkB受容体に対する1ミリモル、750ナノモル、500ナノモル、および300ナノモルのDHF濃度の増加の典型的な正面親和性クロマトグラムが示され、これは保持時間の濃度依存的な変化を示した。非機能的なCMACカラムは、マーカーリガンドの保持における濃度依存性変化の欠如を示した。CMACネガティブコントロールカラムは、非特異的相互作用を排除するために標的タンパク質を発現させない細胞膜断片を固定化することによって調製した。0.2%水性ゴツコラ抽出物の添加は、7,8−DHF保持の有意な減少をもたらし、アゴニスト結合部位に対する競合するリガンドの存在を示す。CMAC陰性TrkBヌルカラム上の7,8-DHF保持の減少の欠如は、このカラム上の機能的なTrkB受容体の欠如をさらに確認した。欠落ピーククロマトグラフィーアプローチは、TrkBヌルカラムで早期に溶出しながら、TrkBカラムに強く保持された化合物を同定し、特異的相互作用を示す。高速細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムの受容体源を知ることは非常に重要です。均質化および可溶化バッファーを適切に設計するために、必ず文献を確認してください。このプロトコールで調製した細胞膜アフィニティークロマトグラフィーカラムは、新規の潜在的な薬物ヒットを同定し、固定化受容体とその天然リガンドとの間の相互作用の性質を特徴付けるために使用された。

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生物化学

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