牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御
January 29th, 2022
近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。
この手順の全体的な目標は、2D牽引力顕微鏡試験用のマイクロパターンヒドロゲルを製造することです。これは、最初にメタクリル化ガラスカバースリップを作り、その上にポリアクリルアミドヒドロゲルの第1層を形成することによって達成される。第2のステップは、牽引力顕微鏡用蛍光ビーズを含む別のヒドロゲル層を作成することです。
ヒドロゲルは、その上にマイクロパターンカバースリップで挟み込み、ヒドロゲル表面上のマイクロパターンマトリックスタンパク質の転写をもたらす。次に、ポリアクリルアミドヒドロゲルを室温で45分間重合する。上部カバースリップは慎重に取り外されます。
蛍光顕微鏡イメージングは、ビーズの存在とマイクロパターンの細胞外マトリックスタンパク質の正常な移動を示すために使用されます。この方法は、光を使用して、細胞の放出を使用して、効率的かつ正確にいくつかの牽引力を測定するのに役立ちます。同一試料からより多くの実験観察を得ることを可能にする。
だから、手順を実証することはジョエルクリスチャン、私の研究室の大学院生になります。ビーカーに10ミリリットルの二重蒸留水を加えます。その後、18.75ミリリットルの酢酸、3-プロピルメタクリレート18.75ミリリットル、エタノール252.5ミリリットルを溶液に加えます。
溶液が完成したら、結晶化皿に移します。24ミリメートルの丸いカバースリップを取り、精密なワイプでそれらをきれいにし、カスタムメイドのテフロンラックに入れます。その後、溶液に浸し、15分間インキュベートします。
ラックを取り、エタノールですすります。カバースリップを気流下で乾かします。メタクリレートカバースリップは、室温で1ヶ月まで保存することができます。
15ミリメートルの丸いカバースリップを取り、ペトリ皿に置きます。ダイヤモンドペンを使用して、カバースリップの上側に印を付けます。その後、酸素プラズマ処理を介して洗浄に進みます。
カバースリップは0.4ミリバールできれいで、200ワットで2分間きれいです。ポリL-リジン溶液のピペット100マイクロリットルをカバースリップの表面に、室温で30分間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルで8.5のpHで洗います。
余分な液体を取り出しますが、表面を濡らしてください。ピペット100マイクロリットルのmPEG-SVAのミリリットル当たり50ミリグラムのカバースリップの表面に10ミリモルpH 8.5溶液を、室温で1時間インキュベートします。その後、カバースリップを10ミリモルpH 8.5ですすります。
その後、PLPPゲルを2マイクロリットル加え、その後40マイクロリットルのエタノールを表面に加えます。ペトリ皿を軽く傾けて溶液を均質化します。溶液が偏光するまで5分待ちます。
35ミリメートルの底穴ペトリ皿の中にカバースリップを置きます。カバースリップを含むペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。ガラスの表面に焦点を合わせます。
描画済みパターンをロードしてロックします。1ミリメートルあたり30ミリジュールの紫外線量でパターニングを開始します。パターニングステップが完了したら、パターンカバースリップを取り出し、PBSで表面をすすきます。
サンプルを100マイクロリットルのフィブロネクチンあたり25マイクログラム、室温で1時間PBSに溶解したAlexa 488と共役した1ミリリットルフィブリノーゲンあたり25マイクログラムの混合物でインキュベートします。ヒドロゲル基板を準備するには、メタクリレートされたカバースリップをペトリ皿に入れることから始めます。開始するには、15ミリリットルのファルコンチューブに9.55ミリリットルの二重蒸留水を加えて、新鮮な酸化AgA溶液を調製します。
その後、AgAの0.5ミリリットルを追加します。その後、溶液に42ミリグラムのメタピルビン酸ナトリウムを加える。シェーカーに溶液を4時間セットします。
次に、表1に記載のアクリルアミド、ビスアクリルアミド、及び二重蒸留水を混合してストック液を調製する。ストックソリューションは摂氏4度で最長1年間保つことができます。99.3マイクロリットルのストック溶液を0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%と0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、底層に対する作業溶液を調製します。
溶液から10マイクロリットルを取り、ピペットはメタクリレートカバースリップにドロップします。15ミリメートルの丸いカバースリップを液滴に慎重に置き、重合するまで45分待ちます。次に、上部カバースリップをメスで取り外します。
次に、93.3マイクロリットルのストック溶液を1マイクロリットル酸化HEA、5マイクロリットル蛍光ビーズ、0.5マイクロリットルの過硫酸アンモニウム1%および0.2マイクロリットルのTEMEDと混合して、最上層の作業溶液を調製します。溶液から5マイクロリットルを取り、ピペットは底層ヒドロゲルに滴下します。慎重に液滴にマイクロパターンカバースリップを置きます。
重合するまで45分待ちます。カバースリップをメスでそっと取り外します。そして、カスタムドリル6ウェルプレートの底にカバースリップを接着します。
井戸にPBSを追加します。細胞を見るために、6ウェルプレートからPBSを吸引する。線維芽細胞の場合, L-グルタミンを含む高グルコース DMEM を追加し、それを補う 10%FPS と 1%ペニシリンとストレプトマイシン.
摂氏37度と5%CO2で一晩細胞をインキュベートします。微視段階のCO2と暖房をオンにします。その後、顕微鏡をオンにし、ステージ上のウェルプレートを配置します。
照明パターンを設定し、対象のセルをマークします。ヒドロゲルの表面に再び焦点を合わせます。明視野チャネルのセルの画像を取得します。
変形状態のビーズの画像を撮るためには、チャンネルに切り替えます。その後、レーザーチャンネルに切り替え、3分間パターンに従ってセルを照らします。これは、1ミリメートルあたり6,000ミリジュールの用量に相当します。
その後、チャネルを切り替えて、未変形状態のビーズの画像を取得します。牽引力を計算するには、横ドリフトを補正した蛍光ビーズ画像を開きます。牽引力の完全な分析は、添付のスクリプトで詳述されています。
ヒドロゲル表面のマイクロパターン領域に対する細胞の選択的接着性を検証するために、サンプルを、事前標識されたマトリックスタンパク質を用いた蛍光顕微鏡法と、明視野顕微鏡で細胞を可視化して画像化した。ポリアクリルアミドヒドロゲルの機械的特性は、異なる量のアクリルアミドとビスアクリルアミドを混合することによって変化した。ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡によるナノインデンテーション実験で評価した。
トラクションフォース測定は、ポリアクリルアミドヒドロゲルのミクロンサイズの領域を選択的に照射するために、空間的、時間的に制御された、紫外線レーザービーム照明を適用した後に行った。トラクションフォースは、一般化されたクロス検証によって選択された正規化パラメータを使用して、正規化されたFTTCを使用して再構築されました。光とマイクロパターン細胞の使用放出と組み合わせた引力顕微鏡に基づくモデルモジュラーアプローチは汎用性が高く、他の顕微鏡およびイメージング設定でさらに利用され、その解像度と感度を向上させる可能性があります。
概要
この研究は、近紫外線リソグラフィとトラクション力顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力測定を行います。この方法により、単一の細胞の光誘導リリースが可能となり、同じサンプルから多数の測定が容易になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生物物理学
背景
- トラクション力顕微鏡は、細胞力学の研究に不可欠です。
- マイクロパターン化されたヒドロゲルは、細胞接着のための制御された環境を提供します。
- 近紫外線リソグラフィにより、細胞外マトリックスタンパク質の精密なパターニングが可能になります。
- 細胞力の効率的な測定は、細胞挙動の理解を深めることができます。
研究の目的
- トラクション力顕微鏡用のマイクロパターン化されたヒドロゲルの製造。
- 細胞力測定の精度と効率を向上させる。
- 大学院生をデモンストレーターとして用いて、細胞のトラクション力を測定する手順を実証する。
使用された方法
- メタクリレート化ガラスカバースリップの準備。
- 蛍光ビーズを含むポリアクリルアミドヒドロゲル層の形成。
- 蛍光顕微鏡を使用してパターン転写の成功を確認。
- マイクロパターニングに近紫外線リソグラフィを適用。
主な結果
- マイクロパターン化されたヒドロゲルの成功的な製造。
- 細胞のトラクション力を効率的に測定する能力の実証。
- 単一のサンプルから多数の測定値の取得。
- イメージングを通じてビードの存在とパターン転写の確認。
結論
- 組み合わせた方法により、細胞力学の研究が向上します。
- 光誘導細胞リリースにより、繰り返し測定が可能になります。
- このアプローチは、さらなる研究のためにさまざまな細胞タイプに適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardizing cell adhesion patterns enables reproducible traction force measurements, addressing variability in cell shape and force output that limits throughput in mechanobiology assays. This approach supports predictive confidence in target validation by providing quantitative, deformation-based readouts of cellular mechanotransduction pathways. The method enhances assay reliability for early discovery workflows where mechanical phenotype correlates with drug response or target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by controlling adhesion geometry to isolate force-dependent signaling pathways.
- Operational Value: Reduces biological noise from heterogeneous cell spreading, improving assay consistency across replicates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in mechanosensing, such as YAP/TAZ or integrin-linked kinases.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable traction force matrices for comparing compound effects on cellular contractility.
- Operational Value: Allows sequential force measurements from the same sample via localized UV release, increasing data density per well.
- Assay Readiness: Produces reusable hydrogel substrates with defined adhesive islands compatible with high-resolution imaging and bead-based displacement tracking.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro mechanical phenotypes to disease-relevant models where altered traction forces indicate pathological states.
- Preclinical Utility: Enables dose-response profiling of compounds targeting cytoskeletal regulators or focal adhesion components.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies mechanotoxic liabilities early by detecting aberrant force generation in patterned cellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for pathways where mechanical signaling modulates target validity or compound efficacy.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling controlled application and release of mechanical cues to dissect force-dependent signaling nodes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative displacement readouts of embedded beads as a proxy for cellular traction forces across conditions.
- Analytics: Employs regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) to reconstruct traction fields, providing standardized force maps for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanical output to phenotypic outcomes only when supported by disease models showing traction force alterations in fibrosis, cancer, or stem cell differentiation.
- Enterprise Reuse: Positions the hydrogel patterning workflow as a modular, adaptable platform for mechanophenotyping across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing confounding variables in cellular force measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized adhesion patterns and sequential sampling via light-induced release.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of mechanobiological liabilities that may lead to late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical phenotype concordance with disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photolithography, hydrogel chemistry, and fluorescence microscopy for pattern fabrication and bead tracking.
- Depends on UV illumination systems with spatial control and polyacrylamide synthesis capabilities for tunable elasticity.
- Necessitates standardization of protein coating protocols and UV dosing to ensure consistent adhesion patterns across batches.
- Involves adaptation considerations when extending to 3D models or primary cells with distinct adhesion kinetics.
- Practical limitations include UV-induced hydrogel degradation over repeated cycles and bead photobleaching during prolonged imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of Methacrylated Coverslips
2:39
Micropatterning of Extracellular Matrix Proteins on Glass Coverslips
5:31
Fabrication of Patterned Polyacrylamide Hydrogels
9:15
Local Release of Cell Traction Forces by UV-A Laser Illumination
10:26
Image Processing, Particle Image Velocity and Calculation of Traction Forces
10:55
Results
11:56
Conclusion
