原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

この方法により、研究者は複数の患者細胞株の細胞収縮を同時に研究することができます。それは私たちがより速してより効率的に病気を研究することを可能にします。この技術により、細胞の収縮をリアルタイムで定量化することができます。

1時間以内に、数十個の細胞の収縮値を得ることができます。我々は、大動脈瘤を有する患者の群において筋肉細胞収縮が減少することを初めて実証した。これは、新しいバイオマーカーまたは医学的治療の標的となり得る。

まず、2組の手術用鉗子とメスを70%エタノールに浸し、その後乾かして滅菌します。次いで、組織解剖が行われるペトリ皿に2ミリリットルのSMC培地をピペットする。次に2.5ミリリットルのSMC培地を2つのT−25フラスコにピペットする。

少量の媒体が表面全体を覆うようにフラスコを旋回させる。生検を目視検査し、内膜側と外膜側のぬるぬるした結合組織の存在により3つの大動脈層を特定し、層を区別する。SMCを媒体から単離するには、最初に内膜プラークを有する組織を上にして他の2つの層を除去し、次に鉗子で組織から引き離すことによって固体プラークを除去し、ピンク色の均一な内側層が見えるまで第2の鉗子で組織を押し下げる。

次に、組織を反転させ、外来層を引き抜いて同じ手順を繰り返し、この層がメディアから容易に剥離しないので、必要な回数だけ多くの試行ですべての可視部分を除去するようにしてください。メディア層が分離されたら、メディアを鉗子で押し下げ、メスを使用して組織を一方向に切断して、損傷を最小限に抑えるためにきれいな一方向カットを行うことで、組織を立方体に切断します。鉗子を使用して、これらの組織片の10〜20個をT−25フラックの上四分の一に置く。

前述のように2対の外科用鉗子およびメスを滅菌した後、組織解剖が行われるペトリ皿に2ミリリットルの線維芽細胞培地をピペットする。次に、2.5ミリリットルの線維芽細胞培地を2つのT−25フラスコにピペットし、少量の培地が全面を覆うようにフラスコを旋回させた。表皮を認識可能な皮膚表面、時には目に見える毛で識別するための生検を視覚的に検査し、反対側に黄色くてぬるぬるした皮下脂肪を探します。

表皮と皮下脂肪の間の層は真皮であり、生存可能な線維芽細胞の供給源である。真皮から線維芽細胞を単離するには、真皮側に組織を配置して他の2つの層を除去し、3つの層すべてを見えるようにする。その後、鉗子で組織を押さえ、組織を傷つけることなく表皮全体を1つのきれいな線で切り取ります。

今度は組織をひっくり返し、皮下脂肪との境界に平行な真皮内を切断することによって同じ手順を繰り返す。真皮が単離されたら、組織を立方体に切断し、組織を鉗子で押し下げ、メスを使用して組織を一方向に切断する。次いで、鉗子を用いてこれらの組織片の10〜20個をT−25フラスコの上四分の一に置く。

自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、ゼラーティングされたECISプレートに200マイクロリットルのSMC培地に1ウェルあたり30,000細胞の播種密度でSMCを3連で播種します。SMCの入ったプレートを細胞培養インキュベーター内のECISの96ウェルホルダーに入れます。ECIS Applied BioPhysics ソフトウェアをダブルクリックしてプログラムを開き、[セットアップ] ボタンを押します。

すべての電極が、左下のパネルの「ウェル構成」というラベルの付いたホルダーに接触しているかどうかを確認します。電極が正しく接続されていない場合は、測定を開始する前にホルダー内のプレートを調整してください。次に、同じパネルで「配列タイプ」(Array type) をクリックしてプレートタイプを選択します。

次に、2マイクロリットルおよび150マイクロリットルの容量に設定した2つのピペットを準備する。刺激を開始する前に、ソフトウェアでマークを押してコメントを入れてください。細胞を刺激するには、蓋を外してインキュベーター内の滅菌面に置きます。

次に、2マイクロリットルのイオノマイシン作動溶液をできるだけ早く各ウェルにピすることによってSMC収縮を誘導する。すべての細胞が刺激されたら、2番目のピペットを使用してウェル内の培地を混合します。実験間測定の再現性を決定するために、すべての包含された対照細胞株および患者細胞株の2つの独立した測定値をBland-Altmanプロットとしてプロットし、この方法が1つの外れ値細胞株を除いて信頼区間外の変動性を示さなかったことを実証した。

同じ実験で播種し、同時に刺激した2つのウェルは、実質的に同じ契約応答曲線を示した。示された応答がイオノマイシン刺激による収縮ではなく浸透圧ストレスであるかどうかを検証するために、刺激後に培地を交換し、細胞の挙動を記録し、刺激された細胞が再び電極上に広がり始めたことを示した。健康な非拡張大動脈由来のSMCにおける収縮応答は、腹部大動脈瘤患者からの52%の中央値応答と比較して、61%の中央値応答を示した。

対照群の平均収縮応答を用いて、正常値よりも低い収縮値を有する4人の患者を同定した。ウェスタンブロット分析およびその後の定量化により、細胞がSMCマーカーを発現することを確認した。SMCの増殖能を決定するために、Ki67についてqPCRを実施した。

Ki67発現は全ての細胞で検出可能であったが、収縮性出力と相関しなかった。収縮のために細胞を刺激するときは、同時にりにも多くの井戸をピしないようにし、できるだけ速くピしようとしました。この手順には、いくつかの練習が必要な場合があります。

この方法を用いて、我々は患者の収縮に基づいて患者を分割し、正常な収縮を低下させるために、これらの患者および喫煙などの臨床的特徴との関連を調査することができた。