Name: 不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学ぶ マウス全型網膜における血管パラメータ定量化法。酸素誘導網膜症モデルと代謝症候群モデルを用いて、無血管領域・新生血管・血管拡張・屈曲性を測定し、網膜症の病態理解と治療評価に貢献する。

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カルロス・マス、マリア・ピラール・クレスポ、CEMINCOのセシリア・サンペドロ(セントロ・デ・ミクロ・イ・ナノスコピア・コルドバ、コニセトUNC、コルドバ、アルゼンチン)に対する共焦点顕微鏡の支援、ソレダッド・ミロとビクトリア・ブランコの専任動物ケア、ローラ・ガティカの神学的支援に感謝します。また、ビクター・ディアス(FCQの制度コミュニケーションのプロ秘書)に、ビデオ制作と版、ポール・ホブソンが原稿の批判的な読書と言語改訂に感謝します。
この記事は、セクレタリア・デ・シエンシア・イ・テクノロジアからの助成金によって資金提供されました。 ナシオナル・デ・コルドバ大学(SECyT-UNC)コソリサー2018-2021、フォンド・パラ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクノロギカ(FONCyT)、プロエクト・デ・インベスティガシオン・エン・シエンシア・イ・テクノロジア(PICT.C)

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<li>Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+retina+in+3D%3A+quantification+of+vascular+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+indirect+contact+coculture+decrease+integrity+of+inner+blood-retina+barrier+model+in+vitro+by+upgrading+MMP-2%2F9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity.</a> Disease Markers. 2021, 7124835(2021).</li>
<li>Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDF-deficient+mice+exhibit+an+enhanced+rate+of+retinal+vascular+expansion+and+are+more+sensitive+to+hyperoxia-mediated+vessel+obliteration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).</li>
<li>Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+D-amino+acid+oxidase+prevents+retinal+neurovascular+pathologies+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats.</a> Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).</li>
</ol>

著者らは、研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。

網膜症の動物モデルは、血管の発達、リモデリング、または病理学的血管新生を研究するための強力なツールです。この分野でのこれらの研究の成功は、生体内および死後マウス26,27からのデータを提供し、多種多様な技術を実行することを可能にする組織への容易なアクセスに依存している。さらに、インビボ研究と臨床分析との間に大きな相関関係が見られ、これらのmodel28に確かなトレーサビリティと信頼性を提供しています。本稿では、レスチン管疾患のマウスモデルにおける血管ネットワークを特徴付ける手順の簡単かつ堅牢な説明を提示する。文献では、読者はここで選択されたものを定量化するための他の可能なパラメータを測定し、並列アプローチを見つけるでしょう。コンパイルされたプロトコルは、再現性があるため他のプロトコルよりも多くの利点があり、分析を実行するためにフリーソフトウェアが必要です(Image J Fiji)。
<p class="jove...

目は2つの動脈静脈系によって栄養を与えられます:脈絡膜血管系、網膜色素上皮および光受容体を灌漑する外部血管ネットワーク。神経節細胞層とretina1の内部核層を灌漑する神経残性血管系。レチナル血管系は、栄養と酸素をレチナル細胞に供給し、廃棄物を収穫して適切な視覚シグナル伝達を確実にする血管の組織的ネットワークです。この血管系には、自律的な内インベーションの欠如、固有の筋機構による血管緊張の調節、複雑な筋血バリアの所持など、いくつかの特徴的な特徴があります2。したがって、血管系の血管系の研究は、開発中の血管形成だけでなく、これらの血管が疾患で受ける変化や病的血管新生も広く研究してきた多くの研究者の焦点となっています3。網膜症で観察される最も一般的な血管変化は、血管拡張、新血管新生、血管の樹状化および網膜主血管の変形の喪失であり、これらはよりジガギー4,5,6となる。記載された変更の1つ以上は、臨床医によって検出される最も初期の徴候である。血管の可視化は、迅速で、非侵襲的で、かつ安価なスクリーニング方法7を提供する。血管樹で観察される変化の広範な研究は、網膜症が不拡散または増殖性であるかどうかを決定し、さらなる治療を行う。不増殖性網膜症は、異常な血管形態、血管密度の低下、無細胞毛細血管、骨膜死、黄斑浮腫などで現れる。さらに、増殖性網膜症はまた、血管透過性の増加、細胞外リモデリング、および網膜剥離を容易に破壊または誘導する虚膜腔に向かう血管房の形成を発症する8。
一度検出されると、網膜症は、その血管変化を介して監視することができます9,10。病理の進行は、疾患の段階を明確に定義する血管の構造変化を通して追跡することができる11。これらのモデルにおける血管変化の定量化は、血管の変化と神経死を相関させ、疾患の異なる段階の患者に対する薬理学的療法を試験することを可能にした。
上記の記述に照らして、網膜症研究において血管変化の認識と定量化が基本であると考える。本研究では、異なる血管パラメータの測定方法を紹介する。そのために、2つの動物モデルを採用します。そのうちの一つは、未熟児網膜症および増殖性糖尿病網膜症13,14のいくつかの側面を模倣する酸素誘発網膜症マウスmodel12である。このモデルでは、血管領域、新血管領域、および主血管の拡張と拷問を測定します。当研究室では、メタボリックシンドローム(MetS)マウスモデルが開発されており、不拡散性網膜症15を誘導します。ここでは、血管密度と分岐を評価する。

<table><tbody><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>メルク</td><td>A4503</td><td>品質</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>メルク</td><td>C3306</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>バイオパック</td><td>9632.08</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡FV1200</td>電動<td>プレート付き</td>オ<td>リンパス</td><td>FV1200</td></tr>は<tr><td></td><td>ポールマリエンフェルドGmnHをカバーしています&共。</td><td>111520</td><td></td></tr>解<tr><td>剖顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>SMZ645</td><td></td></tr>二<tr><td>ナトリウム-水素-リン酸二水和物</td>メル<td>ク</td><td></td>119753 <td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;L&nbsp;チューブ</td><td>メルク</td><td>Z316121</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>メルク</td><td>WHA5201090</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター シェーカー ジャイロミニ</td><td>LabNet インターナショナル</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>イソレクチン GS-IB4 グリフォニア シンプリシフォリアから、アレクサ フロー 488 コンジュゲート</td><td>インビトロゲン</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール) (Mowiol 4-88)</td><td>メルク</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>pHmeter</td><td>SANXIN</td><td>PHS-3D-03</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム水酸化物</td><td>メルク</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>メルク</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>メルク</td><td>X100-1GA</td><td></td></tr><tr><td>船舶分析 フィジー ソフトウェア</td><td>マイ エルファーナワニー</td><td></td><td>https://imagej.net/Vessel_Analysis</td></tr></tbody></table>

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

網膜症は、眼の神経感覚組織に影響を与える疾患の不均一なグループである。それらは神経変性、神経膠症および血管機能および構造の進行性の変化によって特徴付けられる。網膜症の発症は視覚の微妙な障害によって特徴付けられるが、血管叢の修飾は臨床医によって検出される最初の徴候である。新血管新生の不在または存在は、網膜症が不拡散(NPDR)または増殖(PDR)のいずれかに分類されるかどうかを決定する。この意味で、いくつかの動物モデルは、内皮変化、神経死および他の事象が、その他の事象に関与する根本的なメカニズムを決定するために、各段階の特定の血管特徴を模倣しようとした。本稿では、出生後(P)17日の成人および早期出産マウスにおけるレチナル血管パラメータの測定に必要な手順の完全な説明を行う。後の顕微鏡可視化のための全体の台紙のイソレチンGSA-IB4とのレチナル血管染色を行うためのプロトコルを詳述する。イメージJフィジーソフトウェアで画像処理のための重要なステップも提供されているので、読者は血管密度、直径およびトース性、血管分岐、ならびに血管および新血管領域を測定することができる。これらのツールは、不拡散性および増殖性網膜症の両方における血管変化を評価し、定量化するのに非常に有用である。

プロトコルセクションに記載されているように、単一の蛍光染色アッセイから、血管形態を取得し、目的の複数のパラメータを定量的に評価することができる。特定の変化の探索は、研究された網膜症の種類によって異なります。この記事では、血管領域と新血管領域、トース性、および拡張を増殖性網膜症のマウスモデルで評価し、血管分岐および密度をMetSマウスモデルで分析し、不拡散性網膜症を誘発した。
最初の実験例では、酸素誘導網膜症(OIR)マウスモデルを採用し、これは未熟網膜症と糖尿病網膜症の増殖段階のいくつかの特徴に似ている。このモデルでは、出生後の日(P)7からP1218までの高酸素室で、老人の母親と一緒にごみが維持されます。P12で、抗血管新生(治療と名付けられた状態)としての薬剤の有効性を判定するために、細胞内注射を行った。マウスは、最大の新船形成の時点であるP17で屠殺した19。車両を注射したマウスを制御として採用した。両方のサンプルを固定し、イソレクチンGSA-IB4を一緒に染色した。共焦点取得後、...

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

網膜症では、血管の変化は臨床医によって検出される最初の徴候である。彼らは病気の進行に従い、これらの変化に応じて治療を選択します。いくつかの動物モデルは、病理の異なる段階を研究するために開発されています。この研究では、異なる血管変化を測定する方法を示すつもりです。そのために、2つの動物モデルを採用します。その一つが酸素誘発網膜症マウスモデルで、未熟児網膜症と増殖性糖尿病性網膜症の一部の側面を再現しています。ここでは、血管領域、新血管領域、および動脈の拡張とトルトオースを測定します。当研究室では、不拡散性網膜症を誘発するメタボリックシンドロームマウスモデルを開発しました。血管密度及び分岐は本研究において評価した。マウスが犠牲を払う時、はさみで核を出す。作りたてのパラホルムアルデヒドで、生核眼を室温で1時間固定します。解剖顕微鏡の下で、手足に沿って切断してはさみで角膜を取り除き、全体のレティナを解剖します。眼の前部を捨て、次にRPE-チョロイドからレチナを分離する。200マイクロリットルチューブにレティナを置きます。その後、5%のウシ血清アルブミントリトンを含む100マイクロリットルの結核で、シェイカーで穏やかな攪拌で4度で6時間の間にレチナをブロックし、透過させる。次に、チューブを反転してレチナをカップに入れ、ピペットでブロッキング溶液を取り除きます。イソレクチンを含む100マイクロリットル溶液を加える。サンプルを光から保護するために、チューブをアルミホイルで包みます。レチナを一晩4度でレクチン溶液でインキュベートし、シェーカーで穏やかな攪拌を行います。100マイクロリットルのTBSトリトンでレチナを20分間、シェーカーで穏やかな攪拌で洗います。この手順を 3 回繰り返します。スライドにレティナを配置し、PBSを追加します。顕微鏡を解剖する下で、眼間の縁から視神経に向かって4つの等間隔の切り傷を行う。花びらを広げるには、鉗子や小さなフィルターペーパーを使用します。感光体側が下向きであることを確認します。残りの PBS をフィルター ペーパーでスライドから取り出します。次に、取り付け中央値とカバースリップを追加します。室温で1時間乾燥させます。光から保護された4度でスライドを保存します。共焦点顕微鏡で、スライドをプレートの下に置きます。家臣の優れた神経叢に焦点を当て、画像取得を開始する領域を選択します。ソフトウェアで一般的なレーザーパラメータを設定します。X、Y、Z 軸の座標を設定します。スキャンを初期化します。スキャンプロセスが完了したら、画像を開き、優先する拡張子で保存します。ImageJ FIJI ソフトウェアで、メニュー バーに移動し、[ファイル]、[開く] の順にクリックします。処理するイメージを選択します。[バイオフォーマットインポートオプション]ウィンドウで、[OME-XMLメタデータを表示]を選択し、[OMEメタデータ]ウィンドウ OK.In クリックして、ピクセルサイズ情報を検索します。このデータをコピーします。画像キャリブレーションの場合は、メニューバーに移動し、[イメージのプロパティ]を選択します。情報をコピーして[OK]をクリックします。イメージに優先する lut を割り当てます。1 つのイメージ内のすべてのスタックを視覚化するには、メニュー バーに移動し、イメージ、スタック、Z プロジェクトを選択します。表示された投影ウィンドウで、船舶が視覚化されているすべてのスタックを選択します。[投影タイプ] で 、[平均強度] を選択し、[OK] をクリックします。メニューバー、画像、調整、明るさ/コントラストに移動します。[適用] をクリックして変更を保存します。選択したパラメータをコピーして、明るさとコントラストを設定します。これらはすべての画像で同一である必要があります。メニューバーで、[杖] ツールを選択します。形成された血管を欠いている残りの領域を選択します。キーボードの T キーを押して、ROI マネージャの選択領域を記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして、血管領域情報を取得します。これらの手順を繰り返して、レティナの総面積を測定します。メニューバーで、[杖] ツールを選択します。画像を拡大して、ネオ船をより良く視覚化します。ワンドツールでネオ容器を1つずつ選択します。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして、エリア データを取得します。メニューバーで、直線ツールを選択します。画像を拡大表示して、船舶の壁をよりよく視覚化します。最初の分岐の前に、主船に3本の横線を行います。キーボードの T キーを押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。メニューバーで、マウスの右ボタンを持つ直線ツールアイコンをクリックし、[線分]を選択します。血管の内側に線を引き、血管の形状に従って、最初の血管の影響まで視神経から。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。メニューバーで、直線ツールを選択します。視神経から最初の血管の影響まで線を引きます。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャの [計測] をクリックして、距離データを取得します。メニューバーの楕円ツールを使用して、すべての実験条件に均等に適用される領域を定義します。選択した領域は視神経の周りに描かれた同心円でなければなりません。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。手動で、選択領域内の主な船舶から生じる一次分岐の数をカウントします。イメージを 8 ビット モードに変換します。メニューバーのプラグインに移動し、血管分析、血管密度を選択します。容器密度を測定するメニューバーの[正方形]ツールで面積を定義します。[OK] をクリックします。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。最初の実験例では、酸素誘導網膜症マウスモデルを採用した。細胞内注射は、12日目に行い、抗血管新生薬としての薬剤の有効性を判定した。車両を注射したマウスを制御として採用した。血管領域は、血管の血管が欠けているゾーンとして定義されます。取得した画像から、血管のない領域の合計として血管領域を定量化し、その全面積を細分化することができる。機械的損傷を有する領域はまた、船舶の不在を示す。損傷した領域を特定するには、Hoechst染色でニューロン層の完全性を分析します。新血管は、優れた血管叢の既存の血管に由来する小口径血管である。我々は、新船の房が占める領域を、レティナの総面積が占めるレティナの新血管領域を定量化することによって計算した。新船の形状と大きさは可変であるため、時折、破片やアーティファクトに似ています。新船を区別するために、房が成熟した容器から成長することを確認する。拡張の分析のために、最初の枝の前に3つの高さで主容器の直径を測定しました。研究者は、結果間の変動性を減らすために、血管径を測定するための所定の距離を定義する必要があります。理想的には、視神経からの最も遠い点は約300マイクロメートルでなければなりません。我々は、分析を行うことを提案し、後で、条件ごとに少なくとも6匹の動物の平均を行う。トートオシティに関しては、視神経と第1分岐点の間の直線距離に関して、その形状に続く主船の走行距離を測定する。画像で見ることができるように、主な血管のしなに異質性があります。代表的な結果を得るには、1つの条件につき6匹以下のマウスを定量化しなければならない。最新のパラメータは、血管分岐および密度、不増殖性網膜症を呈するメタボリックシンドロームモデルで分析した。血管分岐の測定では、同心円を描いて定量化領域を定義し、中央の主な容器から生じる一次枝を1つずつ数えた。取得した画像から、血管密度を、各マイクロ写真の異なる場所に配置したROIの面積で割った血管で占める面積として定量した。機械的損傷のある領域を定量化することは避けてください。穿刺のある領域が 3 つ以上ある場合は、その残りは破棄する必要があります。要約すると、この記事では、臨床現場で考慮される最も関連性の高いパラメータのいくつかを定量化するための古典的で確立された再現性の高い技術を示しました。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

生体内顕微鏡検査は、動物で網膜血管の直径、血流速度、および総網膜血流を視覚化および測定するために使用できます。...

マウスの網膜血流の生体内ビデオ顕微鏡測定

げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。...

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生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

多くのビジョンを脅かす眼疾患は、網膜血管の機能不全に関連付けられます。したがって、網膜血管応答の測定は、根本的な病態生理学的メカニズムを調査することが重要です。この記事では、マウスの網膜細動脈の分離と血管作動性物質の血管径に及ぼす影響を評価するために準備のための詳しいプロトコルについて説明します。...

マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

酸素誘導網膜症(OIR)は、未熟児網膜症や糖尿病網膜症の増殖などの虚血性網膜症をモデル化し、新血管疾患の抗血管新生薬の評価における概念実証研究のモデルとして使用することができます。OIRは、定量化できるレチナにおける堅牢で再現性の新生血管化を誘導する。...

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このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。...

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

ここでは、ローズベンガルとレーザー誘導網膜イメージング顕微鏡システムを使用した網膜静脈閉塞のための最適化されたプロトコルと、遺伝子組み換え株での再現性を最大化するための推奨事項について説明します。...

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

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マウス蛍光血管造影画像からの網膜血管径の測定

蛍光トマトレクチンの眼窩後注射後、血小板由来成長因子受容体βによる免疫蛍光染色により、網膜血管系の周皮細胞を調べました。標識された網膜をさらに組織透明化法で処理し、共焦点顕微鏡下で網膜血管系を取り巻く周皮細胞の3次元ビューを視覚化するために全体をマウントしました。...

免疫染色によるマウス網膜血管周皮細胞の3D可視化 

学ぶ マウス全型網膜における血管パラメータ定量化法。酸素誘導網膜症モデルと代謝症候群モデルを用いて、無血管領域・新生血管・血管拡張・屈曲性を測定し、網膜症の病態理解と治療評価に貢献する。

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

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