Name: レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶレポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量法。この技術は治療薬の評価に有用です。

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私たちの研究所(テキサス生物医学研究所)のメンバーには、COVID-19パンデミックの間、私たちの施設を完全に運営し、安全に保つための努力に感謝したいと思います。また、制度バイオセーフティ委員会(IBC)とスペル(IACUC)が、時間効率の良い方法でプロトコルを見直してくれたことに感謝します。シナイ山のアイカーン医科大学のトーマス・モラン博士が、SARS-CoV交差反応性1C7C7ヌクレオカプシド(N)タンパク質モノクローナル抗体を提供してくれたことに感謝します。マルティネス・ソブリドの研究室におけるSARS-CoV-2の研究は現在、NIAID/NIH助成金RO1AI161363-01、RO1AI161175-01A1、およびR43AI165089-01によって支援されています。国防総省(DoD)はW81XWH2110095およびW81XWH2110103を付与します。精密治療のためのサンアントニオパートナーシップ;テキサス生物医学研究所フォーラム;サンアントニオのテキサス大学健康科学センター。サンアントニオ医療財団;NIAIDが資金提供するインフルエンザ研究・対応センター(CEIRR、契約番号75N93021C00014)であるインフルエンザ病因・伝播研究センター(CRIPT)による。

K18 hACE2トランスジェニックマウスを含むプロトコルは、テキサス生物医学研究所(TBRI)の施設バイオセーフティ委員会(IBC)および施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。すべての実験は、National Research Council40の実験動物の世話と使用のためのガイドの勧告に従います。マウスを操作するときは、適切な個人用保護具(PPE)が必要です。
1. K18 hACE2トランスジェニックマウスの使用
<ol><li>4~6週齢の雌 B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/Jマウス(K18 hACE2トランスジェニックマウス)を購入し、特定の病原体のない条件下でバイオセーフティレベル(BSL)-2動物飼育施設で維持する。<ol>
<li>BSL2施設に到着した後、動物を7日間順応させ、感染やその他の実験手順のためにBSL-3動物施設に移します。</li>
		<li>IACUCプロトコルに従って、ケージあたり4匹のマウスを配置する。動物が死亡していることを確認するために、マウスがrSARS-CoV-2および インビボ イメージングに感染した後、致死量のFatal-Plus(>100mg / kg)で動物を安楽死させる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. バイオセーフティ
注:この原稿では、rSARS-CoV-2は、前述のように、SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株のBACベースの逆遺伝システムを使用して生成されています37。rSARS-CoV-2/NlucまたはrSARS-CoV-2/Venus感染を含むすべての インビボ 処置は、BSL-3条件下で生物学的安全キャビネット内で行わなければならない。
<ol><li>バイオセーフティキャビネットを2%ウェキシサイドと70%エタノール消毒剤で順番に洗浄し、この記事に記載されているすべての実験手順を実行する前と後に清掃します。</li>
	<li>使用前後にすべての解剖材料(はさみ、解剖鉗子など)とホモジナイザーを滅菌してください。</li>
	<li>各使用前後に、製造元の指示に従って、隔離チャンバーを清掃し、MB10錠を使用して消毒してください。</li>
	<li>IBCおよびIACUCガイドラインに従った手順で生成されたすべての生物学的材料を廃棄します。</li>
</ol>3. rSARS-CoV-2の インビボ 特性評価
<ol><li>マウス感染症<ol>
<li>雌の4〜6週齢のK18 hACE2トランスジェニックマウスを標識ケージに入れ、イヤーパンチコードを用いて各ケージ内のマウスを特定し、ケージあたり4匹のマウスを配置する。体重および生存のためにマウスの群を使用し、ウイルス滴定および画像化のために別の群の動物を使用する。</li>
		<li>感染前に、生物発光シグナルを促進するために、胸乳首から鼠径乳首領域までの腹側のマウス胸部を剃る。</li>
		<li>滅菌1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)を用いて、50μL の総容量で滅菌条件下で10個の5プラーク形成単位(PFU)/マウスを含むrSARS-CoV-2接種剤を調製する。 注:ウイルス希釈に使用するrSARS-CoV-2の量を、式で計算します:ウイルス必要=(マウスあたり105PFU /50μL)×最終容量)/ストックウイルス力価。</li>
		<li>ウイルス接種物を氷上で冷やしてください。</li>
		<li>模擬感染マウス(PBS1倍)およびrSARS-CoV-2/WT感染マウスを内部対照として使用してください。偽感染マウスをrSARS-CoV-2感染マウスとは別のケージに入れる。</li>
		<li>麻酔チャンバ内で5%イソフルランガス状鎮静を用いてマウスを麻酔し、3%イソフルランで維持する。</li>
		<li>姿勢反応と右折反射が確認されたら、マウスを背側臥位に置きます。</li>
		<li>人差し指と親指の間にマウスの首をしゃがみ込み、ピンキーの指で尾を手のひらに押し付けて動物を背側の位置に保持します。</li>
		<li>50 μLのウイルス接種剤を含むピペットチップを鼻孔に入れ、溶液をゆっくりと排出する。ウイルス接種物が吸入され、接種物滴が消えるのを観察して逆流がないことを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nlucに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの生物発光モニタリング(図1 および 図2) メモ: この実験は、回路図に従っており、 図 1 に示すウイルスを使用します。イソフルラン麻酔付着は、 インビボ イメージングシステム(IVIS)に必要である。必要な機器とシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。<ol>
<li>イメージングソフトウェアを起動してパラメータを設定し、画像モードをクリックして 生物発光にし、フィルターを開き、露出時間を自動に設定します。</li>
		<li>IVISマシンを初期化したら、バイオセーフティキャビネット内にマウスを隔離チャンバに入れます。マウスに5%濃度のイソフルランを誘導する。姿勢反応および右反射の喪失が確認されたら、3%イソフルランで維持する。</li>
		<li>マウスを麻酔したら、隔離チャンバーからマウスを取り出し、1x PBS(最終容量100μL/マウス)で1:10に希釈したルシフェラーゼ基質を25G針で後眼窩的に投与する。</li>
		<li>ルシフェラーゼ基質投与後、マウスを胸を上向きにし、鼻腔をマニホールドコーンの内側にして隔離チャンバに戻し、イメージング手順中に動物を麻酔し続けます。</li>
		<li>絶縁チャンバをIVISマシンに移し、IVISイメージャのドアを閉じた後、ソフトウェアプログラムで [集録 ]を選択して初期化します(図2A)。</li>
		<li>取得した生物発光画像を解析するには、ソフトウェアの ROI (関心領域)ツールを使用して正確な信号を指定し、磁束を測定します(図2B)。</li>
		<li>[測定]をクリックし、システムが光子の生物発光の評価を開始して、さまざまなパラメータによって提供される出力測定値に匹敵する絶対光子発光を提供するようにします。</li>
		<li>感染後1日、2日、4日、6日後のマウスを画像化します。</li>
		<li>イメージング後、マウスをケージに戻す。</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Venusに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスにおける蛍光解析(図3 および 図4) 注:この実験は、図3に示す回路 図およびrSARS-CoV-2に従う。必要な機器とシステムの詳細については、 材料表 を参照してください。<ol>
<li>イメージングソフトウェアを起動してパラメータを設定し、励起(500nm)と発光フィルタ(530nm)を設定し、画像モードを 蛍光 にクリックし、露光時間を自動に設定します。</li>
		<li>致死量のFatal-Plus(>100mg/kg)を用いてマウスを腹腔内に安楽死させる。安楽死後、切開部位を70%エタノールで消毒する。</li>
		<li>ピンセットを使用して、皮膚を引っ張り、胸骨から腹部まで切開し、はさみで側面から切開部を切開する。肺の血液量を最小限に抑え、イメージング中に高いバックグラウンド信号を避けるために肝静脈を切断します。</li>
		<li>はさみを使用して、胸骨を切断し、胸郭を開きます。次に、気管の端をハサミで切り取り、ピンセットで肺を取り除きます。</li>
		<li>切除した肺を2mLの1x PBSを含む6ウェルプレートに入れ、すすぎ洗いして余分な血液を除去した。70%エタノールを使用してサンプル間の手術器具を消毒および洗浄することにより、サンプル間の汚染の可能性を最小限に抑えます。</li>
		<li>IVISマシンを初期化した後、肺を黒いトレイに入れ、組織を互いに分離する。</li>
		<li>トレイをバイオセーフティキャビネット内の隔離チャンバ内に置き、隔離チャンバをIVISに移します。ドアを閉じ、 Acquire をクリックしてイメージングシステムを開始します(図4A)。</li>
		<li>蛍光を分析するには、ROIツールを利用し、個々の肺の周囲に ROI を描画します。各ROIを手動で測定し、与えられた平均放射効率値を使用し、模擬感染マウスの測定値から差し引いた(図4B)。</li>
		<li>イメージングが完了したら、組織を氷の上に置き、同日分析を行うか、ドライアイス凍結用のクライオチューブに入れて、後で処理するために -80 °C で保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nluc(図2A-C)およびrSARS-CoV-2/Venusに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの肺明視野イメージングおよび病理スコアリング(図4A-C)<ol>
<li>rSARS-CoV-2/Nluc、rSARS-CoV-2/WT、および模擬感染に感染したマウスの生物発光を画像化した後、マウスをケージに戻す。安楽死およびマウス肺の エクスビボ 明視野画像化を進める(図2A)。</li>
		<li>感染マウスの肺の エクスビボ 蛍光を画像化した後、肺の明視野画像を撮影する(図4A)。</li>
		<li>ImageJを用いて肺表面の肉眼病変を分析する(図2C および 4C)。</li>
		<li>ImageJで解析する肺画像を開きます。</li>
		<li>ピクセルとcmの比率を計算し、 ストレート ツールを使用して、画像の実際の長さを測定します。</li>
		<li>選択したら、[ >測定の分析] をクリックして、長さのピクセルの長さを計算します。</li>
		<li>[ 分析]>[スケールの設定] をクリックし、前のステップから計算した数値を入力します。</li>
		<li>フリーハンド選択ツールを使用して、肺表面全体を選択します。「分析>測定」をクリックして、総肺面積を測定します。</li>
		<li>「 >選択を編集」>「反転」 をクリックして肺領域の残りの部分を選択し、Delete キーまたは Backspace キーを押して背景を削除します。</li>
		<li>選択した領域を削除し、[ 画像]をクリックして[色のしきい値>調整]>します。</li>
		<li>病的病変領域を選択するには、存在する鬱血および出血のレベルに応じて、 明るさ を最小(1〜50)および最大(50〜200)に調整する。</li>
		<li>病理学的病変が選択されたら、閾値カラーパネルの下部にある 選択 をクリックし、次に病理学的領域を測定するために 分析>測定 をクリックする。</li>
		<li>病理学的領域の%=(病理学的領域/総肺表面の測定)×100の式で肉眼的病変の割合を計算する。</li>
	</ol></li>
	<li>ウイルス滴定(図2Dおよび図4D)<ol>
<li>イメージング時に、マウスの安楽死を完了し、肺、脳、および鼻粘膜を採取する。</li>
		<li>肺、脳、および鼻粘膜を別々の滅菌組織ホモジナイザーに入れ、1mLの冷たい1x PBSを加える。</li>
		<li>21,500 x g で10分間遠心分離してサンプルを均質化し、細胞破片をペレット化します。上清を集めて新しい滅菌チューブに移し、ペレットを捨てます。</li>
		<li>ウイルス滴定が同日行われる場合は、上清を4°Cで保存する。 あるいは、ホモジナイズしたサンプルの上清を、後で評価されるまで-80°Cで凍結する。</li>
		<li>組織ホモジネートから得られた上清を利用して10倍の段階希釈を行い、上清の各希釈液1mLでVero E6細胞のコンフルエント単層に感染させる(6ウェルプレート形式、1.2×106 細胞/ウェル、3連)。</li>
		<li>加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで1時間ウイルスを吸着させます。</li>
		<li>ウイルス吸着後、1mLの1x PBSで細胞を洗浄し、加湿した5%CO2インキュベーター内で1%寒天を含む2mL の感染後培地中で37°Cで72時間インキュベートする。</li>
		<li>インキュベーション後、プレートを10%中性緩衝ホルマリン中で4°Cで24時間不活性化し、プレート全体が水没していることを確認する。</li>
		<li>BSL3からプレートを取り出し、1mLの1x PBSで細胞を3回洗浄し、1mLの0.5%Triton X-100で室温(RT)で10分間透過処理します。</li>
		<li>1 mL の 2.5% ウシ血清アルブミン (BSA) を 1x PBS で 37°C で 1 時間ブロックし、続いて 1 mL の SARS-CoV ヌクレオカプシド (N) タンパク質交差反応性モノクローナル抗体 (1C7C7) を 1 mL の SARS-CoV ヌクレオカプシド (N) タンパク質交差反応性モノクローナル抗体 (1C7C7) で 1 mL インキュベートし、2.5% BSA で希釈して 37°C で 1 時間培養します。</li>
		<li>1 mL の 1x PBS で細胞を 3 回洗浄し、ABC キットと DAB ペルオキシダーゼ基質キットを使用して、メーカーの指示に従ってプラークを発生させます。</li>
		<li>ウイルス力価をPFU/mLとして計算します。 注: PFU/mL = 希釈係数 x プラーク数 x (1 mL/接種剤量) の式で計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>rSARS-CoV-2/Nlucに感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの組織におけるNluc活性(図2E)<ol>
<li>メーカーの指示に従ってルシフェラーゼアッセイを使用して、mock、rSARS-CoV-2/WT、およびrSARS-CoV-2/Nluc感染K18 hACE2トランスジェニックマウスからの臓器ホモジネート中のNlucの存在を定量化します。</li>
	</ol></li>
	<li>罹患率および死亡率の評価(図2F、Gおよび図4E、F)<ol>
<li>セクション3.1に記載されているように、4〜6週齢の雌K18 hACE2トランスジェニックマウスに、rSARS-CoV-2/WT、rSARS-CoV-2/Venus、rSARS-CoV-2/Nluc、または偽感染の105PFU を鼻腔内感染させる。</li>
		<li>同時に12日間にわたってマウスをモニターおよび計量し、食物摂取による体重変動を最小限に抑えます。人道的なエンドポイントに到達してから初期体重の25%を失ったマウスを安楽死させ、これらのマウスがウイルス感染に屈したことに注意する。</li>
		<li>12日後、ウイルス感染を生き延びたマウスを安楽死させ、体重変化および生存率の%を計算する。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).</li>
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<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li>
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<li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li>
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<li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12(2020).</li>
<li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168(2020).</li>
<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

著者らは、この研究が、記載された研究に関連する商業的、財政的および非財政的、または個人的な利益相反がない場合に行われたことを宣言する。

このプロトコールは、これらのrSARS-CoV-2発現レポーター遺伝子を使用して 、インビボでのウイルス感染を監視することの実現可能性を実証する。両方のレポーター発現組換えウイルスは、 インビボでSARS-CoV-2感染を研究するための優れたツールを提供する。記載された エクス ビボ(rSARS-CoV-2/Venus)および インビボ (rSARS-CoV-2/Nluc)イメージングシステムは、SARS-CoV-2感染のダイナミクス、ウイルス病因を理解し、ウイルス感染後の異なる時間に感染した細胞/臓器を同定するための優れた選択肢です。 エクス ビボ(rSARS-CoV-2/Venus)および インビボ (rSARS-CoV-2/Nluc)研究を実施するためには、正確で再現性のある感染症とrSARS-CoV-2/Nlucの適切な接種が顕著です。
rSARS-CoV-2/Nlucを用いてin vivo感染を研究する場合、IVIS下でのNlucの可視化を容易にす...

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、コロナウイルス科1のベータコロナウイルス系統に属するエンベロープ、ポジティブセンス、一本鎖RNAウイルスです。このウイルスファミリーは、アルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタコロナウイルス1に分けられます。アルファコロナウイルスとベータコロナウイルスは主に哺乳類に感染しますが、ガンマコロナウイルスとデルタコロナウイルスはほぼ独占的に鳥類に感染します2。現在までに、7つのコロナウイルス(CoV)が種の障壁を越え、ヒトコロナウイルス(HCoV)として出現しました:2つのα-CoV(HCoV-229EおよびHCoV-NL63)と5つのβ-CoV(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、中東呼吸器症候群コロナウイルス[MERS-CoV]、およびSARS-CoV-2)3、4、5、6。SARS-CoV、MERS-CoV、およびSARS-CoV-2は高病原性であり、重度の下気道感染症を引き起こす7。SARS-CoV-2の出現に先立ち、CoVsによって引き起こされる2つの流行性アウトブレイクがありました:2002年から2003年にかけて、中国の広東省プロビデンスにおけるSARS-CoV、症例致死率(CFR)は約9.7%でした。2012年から現在までの中東のMERS-CoVは、CFRが約34%です7,8。SARS-CoV-2の全体的なCFRは3.4%〜49%で、基礎となる条件がより高いCFR 8,9に寄与しています。2019年12月に中国の武漢で発見されて以来、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上のヒト感染と490万人以上の死亡の原因となっています7,10,11,12。特に、2020年後半以降、新しいSARS-CoV-2変異型(VoC)および関心のある変異型(VoI)は、感染および抗原性9,13、ならびにCOVID-19パンデミックの全体的な方向性を含むウイルス特性に影響を与えました。SARS-CoV-2感染症の治療のために、現在1つの米国(米国)しかありません。食品医薬品局(FDA)の治療用抗ウイルス薬(レムデシビル)および1種の緊急使用許可(EUA)薬(バリシチニブ、レムデシビルと組み合わせて投与される)14。また、6つの承認されたEUAモノクローナル抗体がある:REGEN-COV(カシリビマブおよびイムデビマブ、一緒に投与)、ソトロビマブ、トシリズマブ、およびバムラニビマブおよびエテセビマブを一緒に投与する15、16、17、18、19。現在、FDAが承認した予防ワクチンはファイザー・バイオNTechの1つしかなく、他の2つの予防ワクチン(モデルナとヤンセン)はEUAの承認を受けています20,21,22,23,24。しかし、制御不能な感染率とVoCとVoIの出現により、SARS-CoV-2は依然として人間の健康に脅威をもたらします。したがって、SARS-CoV-2感染と現在進行中のCOVID-19パンデミックを制御するための効率的な予防薬および治療法を特定するための新しいアプローチが緊急に必要とされています。
SARS-CoV-2を研究するには、感染細胞および/または感染の検証済み動物モデルにおけるウイルスの存在を特定するための面倒な技術および二次的アプローチが必要である。逆遺伝学の使用は、組換えウイルスの生成がウイルス感染の生物学における重要な質問に答えることを可能にした。例えば、リバースジェネティクス技術は、ウイルス感染、病因、および疾患のメカニズムを明らかにし、理解する手段を提供してきた。同様に、リバースジェネティクスのアプローチは、ウイルスの病因におけるそれらの寄与を理解するために、ウイルスタンパク質を欠く組換えウイルスを設計する道を開いた。さらに、ウイルス感染の治療のための予防的および/または治療的アプローチの同定を含む、in vitroおよびin vivo用途のためのレポーター遺伝子を発現する組換えウイルスを生成するために、リバースジェネティクス技術が使用されてきた。蛍光タンパク質および生物発光タンパク質は、その感度、安定性、および新技術の改善に基づく容易な検出のために、最も一般的に使用されるレポーター遺伝子である25,26。インビトロでは、蛍光タンパク質は感染細胞におけるウイルスの局在化のためのより良い選択肢として役立つことが示されているが、ルシフェラーゼは定量化研究にとってより便利である27、28、29。インビボでは、ルシフェラーゼは、全動物イメージングのための蛍光タンパク質よりも好ましいが、蛍光タンパク質は、感染細胞の同定またはエキソビボイメージング30、31、32のために好ましい。レポーター発現組換えウイルスの使用は、とりわけ、フラビウイルス、エンテロウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、アレナウイルス、およびインフルエンザウイルスを含む多くのファミリーにおけるウイルスの研究のための強力なツールとして役立ってきた28、33、34、35、36。
SARS-CoV-2を研究し、 生体内でのリアルタイムSARS-CoV-2感染を特徴付けるための二次的アプローチの必要性を克服するために、我々は、 大腸菌 において単一のコピーとして維持される前述の細菌人工染色体(BAC)ベースの逆遺伝学を使用して、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製能を有する組換え(r)SARS-CoV-2を生成した。 細菌におけるその増殖中のウイルス配列の毒性を最小限に抑えるために37、38。特に、rSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性を示した。rSARS-CoV-2/Venusからの高レベルの金星発現により、 in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて、感染したK18 hACE2トランスジェニックマウスの肺におけるウイルス感染を検出することができました39。金星発現のレベルは、肺で検出されたウイルス力価とよく相関し、SARS-CoV-2感染の有効な代理として金星発現を使用することの実現可能性を実証した。rSARS-CoV-2/Nlucを用いて、我々はウイルス感染のダイナミクスをリアルタイムで追跡し、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおける同じIVISアプローチを用いて 、インビボでの SARS-CoV-2感染を縦断的に評価することができた。

<table><tbody><tr><td>0.5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>室温での保存 (RT)</td></tr><tr><td>1% DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン溶液、中性緩衝シ</td><td>グマ-アルドリッチ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>オキソイド</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>5% 重曹</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル 細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル 細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>アフリカン グリーン モンキー 腎臓上皮細胞 (Vero E6)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments イメージング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オーライメージングソフトウェア 3.2.0</td><td>スペクトル機器 イメージング</td><td></td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA), 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>4 °C で保存;C</td></tr><tr><td>細胞培養グレードの水</td><td>コーニング</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'修正されたイーグル」s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>4 °で保管;C</td></tr><tr><td>麻酔ガスマシン</td><td>Veterinary Anesthesia Systems, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>生後4週から6週齢の雌K18-hACE2トランスジェニックマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Version 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>1001936040</td><td>RTでの保存</td></tr><tr><td>MARS データ解析ソフトウェア</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 tablets</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>RTでの保存</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>この試薬は、Nluc活性の測定に使用されます。-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>-20 °Cで保存;C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution ホモジナイザー</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>軟部組織均質化 CK14 &ndash; 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP キット、ペルオキシダーゼ</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>PK-4002</td><td>ABCキットおよびDABペルオキシダーゼ基質キット</td></tr></tbody></table>

レポーター発現組換えsars-cov-2を用いたk18 hace2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

コロナウイルス病2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされました。現在までに、SARS-CoV-2は世界中で2億4,200万人以上の感染と490万人以上の死亡の原因となっています。他のウイルスと同様に、SARS-CoV-2の研究には、感染細胞および/または動物モデルにおけるウイルスの存在を検出するための実験方法の使用が必要である。この制限を克服するために、我々は、生物発光(ナノルシフェラーゼ、Nluc)または蛍光(金星)タンパク質を発現する複製有能な組換え(r)SARS-CoV-2を作製した。これらのレポーター発現rSARS-CoV-2は、NlucおよびVenusレポーター遺伝子の発現に基づいて 、インビトロ および インビボでの ウイルス感染の追跡を可能にする。ここでの研究は、前述のK18ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)トランスジェニックマウス感染モデルにおけるSARS-CoV-2感染を検出および追跡するためのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusの使用を 、in vivo イメージングシステム(IVIS)を用いて説明する。このrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは 、生体内でrSARS-CoV-2/WT様の病原性およびウイルス複製を示す。重要なことに、NlucとVenusの発現により、感染したマウスのインビボ およびエクスビボでのウイルス感染を直接追跡することができます。これらのrSARS-CoV-2/NlucおよびrSARS-CoV-2/Venusは、 生体内でSARS-CoV-2の生物学を研究し、ウイルス感染および関連するCOVID-19疾患を理解し、SARS-CoV-2感染と戦うための効果的な予防的および/または治療的治療法を特定するための優れた選択肢です。

K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Nluc感染(図1 および図2) 図1Aは、インビボでの感染を評価するために使用されるrSARS-CoV-2/WT(上)およびrSARS-CoV-2/Nluc(下)の概略図を示す。図1Bは、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるrSARS-CoV-2/Nluc感染動態を評価するために適用された概略フローチャートを示す。生後4~6週齢の雌性K18 hACE2トランスジェニックマウス(N = 4)は、1x PBSに偽感染したか、または105PFUのrSARS-COV-2/WTまたはrSARS-CoV-2/Nlucに鼻腔内に感染させた。感染後1日目、2日目、4日目および6日目に、マウスを隔離チャンバを用いて鎮静し、次いでNluc基質を後眼窩的に注射した。単離チャンバを直...

このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼおよび蛍光発現組換え(r)SARS-CoV-2およびインビボイメージングシステム(IVIS)を用いたウイルス感染のダイナミクスを記述している。

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

我々のプロトコールは、SARS-CoV-2感染のK18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるin vivoおよびex vivoライブイメージングウイルス検出およびウイルス追跡のための蛍光または発光発現組換えSARS-CoV-2の使用を記載した。この技術の主な利点は、K18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるSARS-CoV-2のin vivoおよびex vivo研究のためのウイルス検出および追跡の適用および実現可能性である。K18ヒトACE2トランスジェニックマウスモデルにおけるSARS-CoV-2のインビボイメージングの使用は、インビボでのSARS-CoV-2感染の治療のための治療薬を評価するための優れた選択肢を表す。レポーターSARS-CoV-2の実施は、病原性、ウイルス複製、およびインビボでの栄養症を評価するための優れた選択肢を表す。SARS-CoV-2を発現するルシフェラーゼを用いたin vivo研究では、生物発光シグナルを改善するために、マウスを剃毛し、基質注入後に迅速なイメージングを行うことが推奨される。in vivoイメージングシステム(IVIS)を開始し、パラメータを設定し、画像モードをクリックして生物発光をクリックしてからフィルターを開き、露光時間を自動に設定することで、生物発光モニタリングを開始します。次に、既に剃毛して麻酔したマウスを隔離チャンバから取り出し、25ゲージ針を用いて、PBSで1〜10希釈したルシフェラーゼ基質100マイクロリットルをマウスに後眼窩的に投与する。次に、マウスを隔離チャンバに戻し、低体温を防止するための発熱部品を備えたIVISマシンに隔離チャンバを移し、IVISイメージャのドアを閉じて、ソフトウェアプログラムで[取得]を選択してイメージングを初期化します。取得した生物発光画像を解析するには、ソフトウェアのROIまたは関心領域ツールを使用して、正確な信号を指定し、フラックスを測定します。イメージングソフトウェアを起動し、パラメータを設定します。画像モードを蛍光にクリックし、励起フィルターを500ナノメートル、発光フィルターを530ナノメートルに設定し、露光時間を自動に設定します。 壊死検査を行い、マウスから肺を切除します。切除した肺を2ミリリットルの1X PBSを含む6ウェルプレートに入れ、すすぎ洗いして余分な血液を除去します。70%エタノールを使用してサンプル間の手術器具を消毒し、清掃する。IVISマシンを初期化した後、肺を黒いシートの上に置き、組織を互いに分離する。次に、トレイをバイオセーフティキャビネット内の隔離チャンバ内に置き、隔離チャンバをIVISに移します。IVISイメージャのドアを閉じ、集録をクリックしてイメージングシステムを開始します。蛍光を分析するには、ROIツールを利用し、個々の肺の周囲にROIを描画します。各ROIを手動で測定し、与えられた平均放射効率値を使用して、偽感染マウスから差し引く。イメージングが完了したら、ドライアイス凍結用のクライオチューブに組織を入れて、後で処理するためにマイナス 80 °Cで保存します。組織ホモジネートから得られたスーパーネートを利用して、10倍の段階希釈を行い、各上清希釈液の1ミリリットルを3連でベロE6細胞のコンフルエント単層に感染させる。加湿された5%二酸化炭素インキュベーター内で37°Cで1時間ウイルスを吸着させます。完了したら、1ミリリットルの1X PBSで細胞を洗浄し、次いで、摂氏37度の加湿5%二酸化炭素インキュベーター内で、1%寒天を含む2ミリリットルの感染後培地中で細胞を72時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを10%中性緩衝ホルマリンで摂氏4度で24時間不活性化し、プレート全体が水没することを確認します。バイオセーフティレベル3からプレートを取り出し、室温で10分間、1ミリリットルの0.5%Triton X-100で細胞を3回洗浄する。次に、透過処理した細胞を1ミリリットルのウシ血清アルブミンまたはBSAおよびPBSで摂氏37度で1時間ブロックし、続いて2.5BSAで希釈したSARS-CoVヌクレオカプシドタンパク質交差反応性モノクローナル抗体1C7C7を1ミリリットルあたり1ミリリットルの37°Cで1時間インキュベートした。1ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄し、製造元の指示に従ってABCおよびジアミノベンゼン、またはDABペルオキシダーゼ基質キットを使用してプラークを発生させ、ウイルス力価を1ミリリットルあたりのプラーク形成単位として計算する。この研究では、生物発光性ナノルシフェラーゼ(Nluc)は容易に検出され、rSARS-CoV-2 Nlucに感染したマウスは観察されたが、rSARS-CoV-2野生型または偽感染マウスは感染しなかった。定量分析は、感染後の異なる日におけるNluc強度を示した。rSARS-CoV-2 Nlucに感染したマウスの肺表面上の肉眼病変は、rSARS-CoV-2野生型感染群の病変と同程度であった。さらに、ウイルス力価が検出され、rSARS-CoV-2 Nluc感染マウスは、感染後の異なる日にすべての臓器においてrSARS-CoV-2野生型に感染したものと同等であった。同時に、Nluc活性は、rSARS-CoV-2 Nluc感染マウスからの器官においてのみ検出された。偽感染マウスおよびウイルス感染マウスの別群を、体重および生存率の変化について12日間モニターした。rSARS-CoV-2 NlucおよびrSARS-CoV-2野生型に感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後7〜8日間にウイルス感染に屈した。rSARS-CoV-2金星感染後、rSARS-CoV-2金星に感染したマウスからすべての肺で金星の発現が容易に検出されたが、rSARS-CoV-2野生型または偽感染型に感染したマウスでは検出されなかった。定量的分析により、金星強度は感染後2日目にピークに達し、感染過程および感染マウスの肺にわたって減少することが示された。肺表面の画像は、rSARS-CoV-2金星に感染したマウスの肉眼的病変を明らかにし、rSARS-CoV-2野生型感染マウスのそれと同程度であった。また、rSARS−CoV−2金星への感染は、全ての器官においてrSARS−CoV−2野生型に感染したマウスにおいて観察されたものと同等のウイルス力価をもたらした。rSARS-CoV-2金星およびrSARS-CoV-2野生型に感染したマウスは、体重の最大25%を失い、感染後9日目までにウイルス感染に屈し、生存しなかった。SARS-CoV-2を発現するレポーターの結果は、ウイルス感染の有効な代理であることを示している。したがって、これはSARS-CoV-2感染の治療のための対策の迅速な同定と評価につながる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

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Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

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Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

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Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

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ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2...

SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。...

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

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成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

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