Name: T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶビーズ担持脂質二重層（BSLB）を用いたT細胞免疫シナプスの粒子出力解析法。フローサイトメトリーと最適化されたプロトコルで、免疫応答の生化学的調節機構を詳細に研究できます。

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建設的な科学的議論をしてくれた研究室メンバーとケネディリウマチ研究所コミュニティ、特にフローサイトメトリー施設マネージャーのジョナサン・ウェバーに感謝しています。この研究は、Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z、ERC Advanced Grant(SYNECT AdG 670930)、Kennedy Trust for Rheumatology Research(KTRR)(3つともMLDに)から資金提供を受けました。PFCDは、欧州委員会(LTFCOFUND2013、GA-2013-609409)およびMarie Sklodowska-Curie Actionsと共同で、EMBO長期フェローシップ(ALTF 1420-2015)およびオックスフォード・ブリストル・マイヤーズスクイブ・フェローシップによって支援されました。

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
<li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li>
<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
<li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
<li>Céspedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反はありません。

BSLBは、モデルAPC膜で刺激されたT細胞の粒子出力を研究するための汎用性の高いツールです。この方法の柔軟性により、複雑で還元主義的な膜組成物の再構成が、tSVおよび超分子攻撃粒子およびその成分の分泌に対するリガンドおよびそのシグナルの影響を研究することができる。我々は、この技術を、前活性化TH、CTL、Tregs、およびCART15を含む様々なT細胞でテストした。このプロトコルは、新しく単離された静止期のT細胞のシナプス粒子放出の測定にも機能する。新たに単離されたT細胞を使用することの1つの制限は、これらの静止した集団が、それらの細胞表面組成と相関するシナプス貫通粒子の異なるプロファイルを産生することである(詳細は 15 を参照されたい)。
単純なフローサイトメトリーパネルとして、抗TCRクローンIP26、抗CD81クローン5A6、抗パーフォリン(PRF1)クローンB-D48または抗CD40Lクローン24-31、およびATTO 390またはATTO 565含有脂質(BSLBに固有の蛍...

免疫学的シナプス(IS)は、物理的接触に従事する細胞の界面に形成される極めて重要な分子構造であり、ジュクストラクリン情報の調節された交換を促進する。さまざまなISが文献に記載されており、これらの分子ハブが細胞ネットワークの保存された特徴であることを示唆する証拠が増えています。B細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、T細胞などのさまざまな免疫細胞は、短命の接点1の集合を介して情報を交換します。マルチオーミック研究は、病原性細胞ネットワークを駆動し、未知の機能を有する表面タンパク質を発現する白血球および間質細胞の新規サブセットの理解を進めている。合成APCとして、BSLBは、T細胞による活性化シグナル、すなわち抗原および共刺激/コアプレッションの統合における個々のタンパク質の機能的役割の直接的な調査を可能にし、その結果、シグナル4と呼ばれるエフェクター粒子の放出を可能にする。
このホワイトペーパーでは、BSLBを使用してモデルAPCの表面組成を模倣する際に考慮すべきプロトコルと重要な技術的ポイントについて説明します。APC上の免疫受容体および他の表面タンパク質の定量的測定のためのプロトコルは、これらの測定された量を含む合成APCの再構成のためのプロトコルと共に提示される。次に、T細胞とBSLBの共培養に必要なステップを、フローサイトメトリーを用いたシナプス間貫通粒子移動の定量的測定のためのプロトコールとともに提示する。最も驚くべきことに、BSLBは、シナプスエクトソーム(SE)と呼ばれるtSVの原形質膜由来集団の研究を容易にする。T細胞抗原受容体富化(TCR+)SEは、TCRトリガー2に応答して放出され、BSLBs3によって効率的に捕捉され、抗原およびモデル化された膜組成のアゴニスト特性を評価するための優れた読み出しを表す。CD63+エキソソームおよび超分子攻撃粒子(SMAP)も、刺激されたT細胞によって放出され、BSLBによって捕捉される。それらは、T細胞による活性化および結果として生じる外分泌性および溶解性顆粒分泌の追加の読み出しとして使用することができる。T細胞の相互作用極への外来小胞の動員はまた、活性化に応答してIL−2、IFN−γ、およびIL−10などのサイトカインの指向性放出を促進する4、5、6、7、8。T細胞放出サイトカインはBSLBでも検出できるが、免疫学的シナプスにおけるサイトカイン放出の定量的解析を検証するためのより献身的な研究が現在開発中である。
特定の膜組成がT細胞のシナプス出力にどのように影響するかを調べるには、標的膜成分の生理学的密度を定義する必要があります。細胞表面タンパク質のフローサイトメトリーベースの定量は、このプロトコルの重要なステップであり、1)抗体あたりの蛍光色素数(F/P)が既知である抗体の使用、および2)測定された平均蛍光強度(MFI)から蛍光色素分子を補間するための標準的な基準を提供するベンチマークビーズが必要です。
これらのベンチマーク標準は、5つのビーズ集団で構成され、それぞれが任意の蛍光検出のダイナミックレンジにまたがる同等の可溶性蛍光色素(MESF)の数を増やしています。これらの標準集団は離散的な蛍光ピークを生成し、単純な線形回帰によって任意の蛍光単位のMESFへの変換を容易にする。得られたMESFは、抗体F/P値とともに使用され、細胞当たりの結合分子の平均数(または後のステップではBSLB)を計算する。推定された細胞表面積を平均検出分子数に適用することで、生理学的密度を分子/μm2として計算することができます。この定量化プロトコルはまた、T細胞上のタンパク質密度の測定およびホモタイプT細胞シナプス(すなわち、T−Tシナプス9)の形成を媒介する膜組成物の生化学的再構成にも適合させることができる。必要に応じて、抗体結合の価数は、1分子当たり既知の数の蛍光色素で標識された組換え標的を使用することによってさらに推定することができる。次いで、結合蛍光タンパク質の数と定量抗体とを同時に比較することによって(2つの異なる定量蛍光色素およびMESF標準を使用)、同じBSLB集団に対する抗体結合価数を計算することができる。
APC膜の再構成には、シリカビーズ上に支持された脂質二重層(SLB)を組み立てる必要があります1。異なるリン脂質種を含むリポソームストックを利用して、汎用性の高い脂質二重層マトリックスを形成することができ、異なる結合化学を有する組換えタンパク質のアンカーリングを可能にする(リポソームの調製は 10に詳述されている)。「細胞上」の関連するリガンドの生理学的密度(または密度)が定義されると、同じフローサイトメトリープロトコルが、BSLBsを標的生理学的密度で被覆するのに必要な組換えタンパク質の濃度を推定するように適合される。2つの異なるアンカーシステムは、組み合わせて使用することも、別々に使用することもできます。
第1に、最終的な12.5モル%のNi2+含有リン脂質を含有するSLBは、1平方ミクロンあたり約10,000個のHisタグ結合部位を提供するのに十分であり10 、生理学的密度がこの最大負荷容量を超えないほとんどの市販タンパク質でBSLBを装飾するのによく機能する。第2のローディングシステムは、ビオチン含有リン脂質(モル%)を利用して、ストレプトアビジン架橋を介してビオチン化抗CD3e Fab(またはHLA/MHCモノマー)をロードする。これら2つのBSLB装飾方法を組み合わせることで、BSLBを合成APCとして柔軟に調整できます。非常に複雑なAPC表面組成の場合、リン脂質およびタンパク質のmol%を増加させて、手元の質問が必要とするだけ多くのタンパク質を負荷することができる。タンパク質の作用濃度とビオチン化リン脂質のmol%が定義されると、BSLBを組み立てて、マルチパラメトリックフローサイトメトリーでT細胞のシナプス出力を調べることができます。

t細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

抗原提示細胞(APC)は、物理的接触に関与するT細胞に、1)抗原、2)共刺激/コアプレス、および3)可溶性サイトカインの3つの活性化シグナルを提示する。T細胞は活性化に応答して2種類のエフェクター粒子を放出する:シナプス小胞(tSV)および超分子攻撃粒子は、それぞれ細胞間メッセンジャーを伝達し、細胞毒性を媒介する。これらの実体は、T細胞との物理的接触に関与するAPCによって迅速に内在化され、それらの特性評価を困難にする。この論文では、ビーズ支持脂質二重層(BSLB)を抗原提示細胞(APC)模倣体として製造および使用して、これらのシナプス貫通粒子を捕捉および分析するためのプロトコルを提示する。また、細胞表面上のタンパク質密度の絶対測定のためのプロトコル、そのような生理学的レベルを有するBSLBの再構成、およびT細胞によるシナプス粒子放出を追跡するためのフローサイトメトリー手順も記載されている。このプロトコールは、ヘルパーT細胞、細胞傷害性Tリンパ球、制御性T細胞、およびキメラ抗原受容体発現T細胞(CART)を含むT細胞のエフェクター出力に対する個々のタンパク質、複合リガンド混合物、病原体病原性決定基、および薬物の効果を研究するために適合させることができる。

細胞表面上の絶対タンパク質定量のためのFCM リガンドの生理学的密度を示すBSLBの再構成には、モデル化された細胞サブセット上の総タンパク質密度の推定が必要である。BSLBsを再構成するには、BSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質、例えばCD40、CD58、およびB7受容体(CD80およびCD86)などのBSLBと細胞との間の接着および機能的相互作用を支持するタンパク質と共に、目的のシグナル伝達軸において役割を果たすと予想される任意の関連リガンドが含まれる。ICOSL3、PD-L1、およびPD-L215などの共刺激分子を含む追加のタンパク質を、手元の質問に応じて追加することができる。他の分子については、定量的フローサイトメトリーで細胞を直接分析することによって決定された分子密度を使用してBSLBを再構成する。直接結合抗体の場合、BioLegend は各抗体ロット番号の F/P 値を提供します。抗体を社内で標識し、F/P比を分光光度法によって決定することもでき、所望の蛍光色素に...

ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

免疫シナプスの出力の研究は、主に顕微鏡的方法に限定されてきた。BSLBは、フローサイトメトリー、顕微鏡、プロテオミクス、RNAシーケンシング技術など、T細胞免疫シナプスの出力を研究するために使用できるツールのレパートリーを拡大しました。そのため、BSLBは、多種多様な免疫学の質問や、T細胞出力の組成および生化学的調節の同定に使用することができる。これには、例えば、キメラ抗原受容体、特異的シグナル伝達経路を阻害する薬物、または目的の遺伝子の遺伝子アブレーションの研究が含まれる。このプロトコルの最も重要な側面の1つは、目的のシナプス貫通粒子を追跡するために必要なタンパク質較正および多色フローサイトメトリーパネルを最適化することです。これには、タンパク質濃度、抗体濃度、および機器設定の体系的な反復が必要です。まず、1マイクロリットルのビーズ溶液を1,000マイクロリットルのPBSで希釈します。血球計数器チャンバーを使用してビーズをカウントし、ミリリットルあたりの濃度を計算します。次に、滴定ポイントあたり500,000の最終BSLBに必要なシリカビーズの体積を計算します。必要量のシリカビーズを滅菌1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。シリカビーズを1ミリリットルの滅菌PBSで3回洗浄し、ビーズを遠心分離する。最終12.5モル%のニッケル含有リン脂質を含む3倍量のリポソームマスターミックスを調製する。リポソームマスターミックスを使用して、洗浄したシリカビーズを再懸濁します。その後、総体積の半分を上下にピペッティングして穏やかに混ぜる。滅菌技術を使用して、アルゴンまたは窒素ガスをチューブに追加して空気を置換し、混合中の脂質を酸化から保護します。4ミリモルの脂質ストックにアルゴンを加える。ストックを保管し、滅菌技術を用いて操作する。BSLBを垂直ミキサーに移動し、10RPMでの軌道混合を使用して室温で30分間混合する。その後、ベンチトップ型小型遠心分離機で室温で15秒間遠心分離することによりビーズをスピンダウンする。BSLBs上のNTA部位を飽和させるために、100マイクロモルの硫酸ニッケルを含む5%BSAを1ミリリットル加えることにより、形成されたBSLBをブロックします。HBS-HSA緩衝液を使用して3回洗浄し、余分なブロッキング溶液を除去します。新しいU底またはV底96ウェルプレートを取り、タンパク質の2倍段階希釈液を調製する。100マイクロリットルのHBS-HSAバッファーに500,000個のBSLBが含まれるように、調製したBSLBを容量に再懸濁する。次に、別のU底またはV底96ウェルプレートを取り、各ウェルが500,000BSBLを受け取るように100マイクロリットルのBSLB懸濁液をウェルに移します。2 番目のプレートを室温で 300x G で 2 分間スピンダウンします。上清を捨て、100 マイクロリットルの容量のタンパク質滴定プレートから沈降した BSLB を含むプレートに移します。ピペッティング中に過剰な気泡が発生しないように、穏やかに混ぜます。アルミホイルを使用して光から保護し、室温で1,000RPMで30分間インキュベートします。その後、HBS-HSAバッファーをプレートに添加してプレートを3回洗浄し、洗浄後の細胞を300x G.Countで室温で2分間スピンダウンします。次いで、シナプス転写アッセイ培地を用いてそれらを1ミリリットル当たり250万の終濃度に希釈する。BSLBにタンパク質ミックスをロードしたら、HBS-HSAバッファーでBSLBを2回洗浄して、過剰の結合していないタンパク質を除去します。ウェルあたり 500, 000 BSLB を 200 マイクロリットルの HBS-HSA バッファーに再懸濁します。ウェルあたり 100 マイクロリットルの BSLB を新しい U 底 96 ウェルプレートに移して複製を作成し、ウェルあたりの BSLB の最終量が 250,000 になるようにします。BSLBを300x Gで室温で2分間スピンダウンします。上清を捨て、次いで100マイクロリットルのT細胞懸濁液を用いてBSLBを再懸濁する。気泡の形成を防ぐために穏やかに混合する。共培養物を摂氏37度で90分間インキュベートする。細胞を光から保護し、最初に室温で最低15分間インキュベートすることによって、共培養物を冷却する。共存培養物を室温で500x G.Discardで5分間遠心分離し、上清を捨て、室温で共培養物を室温でカルシウムおよびマグネシウムイオンフリーの2%BSA PBSに再懸濁してブロッキングする。細胞を氷の上に45分間置き、光から保護します。染色バッファーとして氷冷0.22マイクロメートルろ過した2%BSAおよびPBSを用いて抗体マスターミックスを調製する。このマスターミックスは余分なブロッキングを提供します。共培養物を500x Gで5分間、摂氏4度回転させます。上清を廃棄し、次いでマルチチャンネルピペットを使用して、最適化された抗体濃度を含む染色マスターミックス中の細胞を再懸濁する。アイソタイプ標識された細胞およびBSLBs、蛍光および非蛍光BSLB、ならびに単独で染色された細胞およびBSLBsが含まれる。ボリュームの半分を上下にピペッティングして優しく混ぜます。氷上で30分間インキュベートし、光から保護します。細胞とBSLBを氷冷2%BSA PBSを用いて2回洗浄する。500x Gで4°Cで5分間スピンダウンします。遠心分離後、ウェルの底に沈降した共培養物を確認する。その後、洗浄した共培養物を100マイクロリットルのPBSに再懸濁し、直ちに取得する。側面散乱ライトの対数スケールと、側面散乱ライトと前方散乱ライトの飛行時間パラメータをアクティブにします。MESF規格を取得して、薄暗い集団と最も明るい母集団の両方が装置の線形範囲に入るようにします。次に、補正サンプルを取得し、補正を計算し、補正行列を実験に適用します。各定量チャネルについて、合計 20, 000 個の MESF 標準を取得して保存します。FACSシース液または類似のMESFビーズの再懸濁には、蛍光色素を破壊する塩やアルコールが含まれており、蛍光ピークが広くなり、誤差が大きいため、使用しないでください。ハイスループットサンプラーを使用した集録の場合は、機器集録を標準に設定し、サンプル集録を80マイクロリットルに設定します。毎秒2〜3マイクロリットルのサンプル流量、50マイクロリットルでのサンプル混合量、毎秒150マイクロリットルのサンプル混合、および3〜5ウェルあたりの混合。サンプルあたり最低 10,000 個の単一 BSLB を取得します。最後に、FCS ファイルをエクスポートします。扁桃B細胞およびヘルパーT細胞の表面上のICAM-1の定量的フローサイトメトリー測定の一例をここに示す。代表的な画像は、ヒトパラチン扁桃腺から単離された単一のCXCR5 B細胞および濾胞ヘルパーT細胞を分析するためのゲーティング戦略を説明する。このシーケンシャルゲーティング戦略は、連続集録ウィンドウ内の単一のライブイベントを識別します。このダブレットを、集団の関連するアイソタイプで標識したFMO対照およびFMO対照と比較したICAM−1の細胞表面発現を、ここに示す。MESF集団のオーバーレイされたヒストグラムにおける異なる標準MESF集団からのMFIのゲーティングおよび測定がここに示されている。値は、5 つの MESF 母集団のそれぞれの MFI を表します。ここでは、MESF 集団に対する cMFI に対する MESF の線形回帰を示します。この傾きは、TFH中の扁桃B細胞の表面上のICAM-1のFCMデータから細胞に結合したMESFを抽出する。絶対分子密度への変換は、これらの単純な数学的操作に従います。代表的な画像は、組換え単量体ICAM−1 12ヒスチジンの密度の増加で再構成されたBSLBsのフローサイトメトリー分析を示す。測定濃度に対するICAM-1参照濃度の回帰分析をここに示す。傾きは、細胞の密度を達成するためにタンパク質の標的濃度を計算するために使用されます。フロー図は、T細胞をBSLBsと共培養するための重要なステップを示し、フローサイトメトリーによる粒子移動のその後の測定においてモデル膜を再構成する。連続取得ウィンドウ内で単一のBSLBと細胞を識別するためのゲーティング戦略をここに示します。このプロトコルの最も重要な側面の1つは、結果の再現性を維持するために、タンパク質または脂質ストックを変更するたびに、新しいキャリブレーション分析を実行する必要があることです。異なるT細胞サブセットによって分泌される新しい有効分子を発見するために、BSLBsは、トランスクリプトームおよびプロテオーム分析に供されるように蛍光活性化細胞ソーティングによってさらに単離され得る。オックスフォード大学の同僚は、この技術を使用して、新しい受容体 - リガンド相互作用を研究および実証し、T細胞免疫シナプスの出力に対する遺伝的アブレーションの影響を研究しました。

preparation-bead-supported-lipid-bilayers-to-study-particulate-output

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

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球状担持脂質二重層アッセイ:ミクロスフェア上のセプチンアセンブリを観察する技術

このビデオは、支持脂質二重膜(SLB)上のナチュラルキラー(NK)細胞における免疫学的シナプスの形成を視覚化する技術を示しています。SLBは、最初に蛍光色素でタグ付けされたNK細胞活性化受容体リガンドで標識され、続いてNK細胞とインキュベートされます。続いて、重合アクチンおよびパーフォリン陽性溶解顆粒について細胞を染色します。このアプローチにより、STED(Stimulated Emission...

担持脂質二重膜上におけるNK細胞免疫学的シナプス形成の超解像イメージング

このビデオは、初代ヒトT細胞と担持脂質二重膜(SLB)との間の免疫シナプス形成を研究するin...

T細胞と支持された平面脂質二重膜との相互作用を研究するためのIn Vitro技術

このビデオでは、ビーズ支持脂質二重膜による合成抗原提示細胞の再構成と、活性化T細胞によって生成されたシナプス出力の評価におけるそれらの応用を示しています。...

ビーズ担持脂質二重膜を用いたT細胞からのシナプス出力の調査

サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。...

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

プロトコルでは、平面脂質二重膜を用いたシナプス インターフェイスを形成する主なポリクローナル T 細胞の機能を研究する手法について説明します。主に由来するリンパ節、末梢血 T...

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

学ぶビーズ担持脂質二重層（BSLB）を用いたT細胞免疫シナプスの粒子出力解析法。フローサイトメトリーと最適化されたプロトコルで、免疫応答の生化学的調節機構を詳細に研究できます。

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

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