シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

この方法は、マイクロ流体チャネル内で微生物のユーザ定義パターンを生成することを可能にする。パターン化されると、微生物をモニタリングして、その長期的な生理機能と相互作用をハイスループットで評価することができます。毛細管力の使用は、異なるクラスの材料に適用可能なパターニングのための非特異的経路を可能にする。

例えば、コロイド粒子や細菌が挙げられる。また、対象となる材料の空間配置を絶妙に制御した大きな配列を生成することを可能にする。今日まで、我々はコロイド粒子および微生物細胞にこの方法を試験し、適用した。

その結果、材料工学や、薬物スクリーニングなどの定量的単一細胞分析を必要とする分野での応用が期待できます。まず、エラストマーとその架橋剤を混合してPDMS混合物を調製する。次に、気泡が形成され、PDMS混合物が不透明に見えるまで、混合物を激しく攪拌して2つの成分を均一にブレンドする。

次に、すべての気泡が除去され、混合物が再び透明に見えるまで、真空デシケーターで混合物を脱気する。マイクロ流体チップの厚さ400マイクロメートルのテンプレート床を得るために、3グラムの混合物をシリコンマスター上に注ぎ、シリコンマスターをスピンコーター上に置き、21回Gで5秒間、54回Gで10秒間スピンコートする。前述のように捕捉された気泡を除去するための脱気を再度行う。

PDMS混合物20グラムを3Dプリントされた型に注ぎ、マイクロ流体チップの屋根として機能するマイクロチャネルを作り、前述のように30分間脱気する。シリコンウェーハと3Dプリントモールドを摂氏70度で少なくとも2時間焼いた後、PDMSを3Dプリントモールドの輪郭に沿って切断して剥がします。マイクロ流路の周りのブレードでPDMSを切断し、マイクロ流体流路の入口と出口として機能する穴を打ち抜きます。

次に、PDMSを切断してシリコンマスターから剥がし、PDMS層をテンプレートの上に接着されるマイクロ流体チャネルと同じ寸法の小さな断片に切断します。1%洗剤溶液を使用してテンプレートとマイクロチャンネルを5分間優しくこすり、イオン交換水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャネルをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水ですすいでください。

次に、テンプレートとマイクロチャンネルを室温で1分間乾燥させ、圧縮空気を1バールで乾燥させます。テンプレートとマイクロチャンネルをプラズマクリーナーに入れ、接合面を上向きにします。プラズマクリーナーの電源を入れた後、テンプレートとマイクロチャンネルを40秒間プラズマ処理し、プラズマクリーナーから取り出して、すぐにテンプレートの上にマイクロチャンネルを接着します。

マイクロ流体チップを摂氏70度のオーブンに5日間保管し、PDMSの疎水性回復を確保します。実験当日、実験数時間前にボックスインキュベーターを37°Cに設定し、シリンジポンプと加熱したガラス板を顕微鏡ステージ上に設置し、ボックスインキュベーターと同じ温度に設定した。実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノールで満たされた容器に入れ、チャネルを100%エタノールで少なくとも10分間フラッシュし、次いでマイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気する。

エタノールを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理します。マイクロ流体チップを摂氏70度のオーブンに10分間入れて、流路に残っている液体の痕跡を除去します。遠心分離機バイアルに1ミリリットルのMOPS培地をピペットし、10マイクロリットルの0.132モルリン酸カリウムを加える。

一晩培養物100マイクロリットルを遠心分離機バイアルにアリコートし、培養物を2,300倍Gで2分間遠心分離した。上清を静かに廃棄して、ペレットを0.015%のTween 20および0.01%のリン酸カリウムを含む1ミリリットルの新鮮なMOPS培地に再懸濁し、細菌懸濁液を1ミリリットルのシリンジに装填する。シリンジとチューブ接続を固定するには、チューブに直接針を挿入します。

次に、シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がトラップでテンプレート領域を覆うまで、チャネルの上流部分に位置する入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入します。シリンジポンプを毎分0.07〜0.2マイクロリットルの流量に設定して、細菌懸濁液を回収し、顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視する。テンプレートが細胞でパターン化されたら、引き抜き流量を増やしてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、以前に少なくとも30分間脱気し、摂氏30度で予温した新鮮なLBで洗い流します。

次に、シリンジポンプを毎分2マイクロリットルの流量に設定して、チャネルを静かにフラッシュします。流路が満たされたら、再び流量を増やします。所望の倍率および時間間隔で増殖する細菌の画像を取得する。

900マイクロリットルの0.015%Tween 20水溶液を遠心分離バイアルにピペットし、次いでその中に元のコロイド懸濁液100マイクロリットルをピペットする。懸濁液を13、500倍Gで1分間遠心分離し、上清をTween 20水溶液で穏やかに交換する。コロイド懸濁液を1ミリリットルのシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。

流路の上流部分の中央部内に位置する入口を通ってマイクロ流体チップに懸濁液を注入し、テンプレートが覆われるまで懸濁液を徐々に押し込む。毎分0.07〜0.2マイクロリットルの流速でコロイド懸濁液を抜き取り、顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを画像化する。メニスカスがテンプレートの端にすばやく到達したら、流量を増やします。

ストレートチャネル形状を利用して、5,000個の分析トラップの83%を堆積させる蛍光大腸菌株の静止した段階的細胞をパターン化しました。パターン化された細菌は、チャネルが新鮮なLBで満たされたときから1.5時間以内に異なる時間に増殖を再開した。増殖が再開されると、単一の細菌細胞は個々のコロニーを形成し始め、表層が形成され、単一細胞分解能が失われるまで拡大した。55,000個のトラップにわたって実施された分析は、2マイクロメートルおよび1マイクロメートルの直径粒子によって作られた緑 - 赤色二量体が、それぞれ分析されたトラップの93%および89%で形成されたことを示した。

そして、緑 - 赤 - 緑のトリマーはトラップの52%に形成されました。パターン化された粒子間の距離は、反対方向に2回の堆積を行い、したがって、各トラップの両端にそのような粒子を捕捉することによって正確に制御することができる。パターニングプロセス中の結露を防ぐために、テンプレート全体で均一な温度を確保することが重要です。

この目的のために、我々はテンプレートの下に加熱されたガラス板を置き、それをボックスインキュベーターと同じ温度に設定する。この方法は、定量的単一細胞分析を含む様々な生物学的研究に使用することができる。ユニークな利点は、同じ実験領域内で大規模な統計を提供する何千ものセルのパターン化を可能にする高スループットの性質です。