Name: シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶ シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリ法を用いて、細菌やコロイド粒子などの微生物をマイクロフルイディクスチャネル内でパターニングする手法。長期的な生理機能と相互作用を高スループットで評価できる。

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1. シリコンマスターの準備
注:コロイドおよび微生物パターニングのためのテンプレートを形成する微細加工トラップを有するPDMSテンプレートは、Geisslerらによって導入された方法に従って作製された。17。 シリコンマスターは、クリーンルーム内で通常のリソグラフィー法により作製した。手順については次の手順を参照し、機器 の材料表 を参照してください。
<ol><li>コンピュータ支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して機能を設計します。</li>
	<li>UVダイレクトレーザーライターで設計された特徴を露光することによって、ポジ型フォトレジストの層を有するクロムガラスマスクを準備する。<ol>
<li>クロムガラスマスクを、1:4のフォトレジスト対水比で15秒間現像液を用いてスピン現像液で現像する。</li>
		<li>マスクをクロムエッチャントに50秒間浸します。</li>
		<li>10cmのシリコンウェーハを600Wで3分間プラズマ処理する。</li>
		<li>ヘキサメチルジシリザンの層を蒸着し、110°Cでベークするとフォトレジストに対する密着性が向上した。</li>
		<li>フォトレジストの層を4,500× g で2分間堆積させる。</li>
		<li>マスクアライナーでクロムガラスマスクを通して2秒間UVに露出させ、マスクは現像液で現像します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリコンマスターの製造を完了するには、深い反応性イオン交換を介してウェーハをエッチングし、所望の深さ(プロフィロメータで測定)を達成するためにエッチング時間(<2分)を調整します。</li>
</ol>2. マイクロ流路金型作製
<ol><li>CADソフトウェアでチャンネルを設計し、スライサーソフトウェアでスライスして、デザインしたモデルを3Dプリンタの指示に変換し、スライス距離を0.05mmに設定します。</li>
	<li>チャンネルを3Dプリンタで約1時間印刷します。</li>
	<li>金型を専用の養生洗濯機で洗って後硬化させます。<ol>
<li>純粋なイソプロピルアルコール(IPA)を充填した容器に型を入れ、液体を渦巻き(20分間洗浄する)。IPAで満たされた容器を機械から取り出します。</li>
		<li>洗浄した金型をIPA容器から取り出したら、洗浄硬化機に戻し、35°Cで15分間ポストキュアします。 注: 材料表 には、金型準備プロトコルで使用されている3Dプリンタと硬化および洗濯機が報告されています。3Dモデルは、3Dプリンタ独自のスライサーソフトウェアでスライスされました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プリントをUVオーブンに12時間置き、80°Cのオーブンに12時間置きます。 メモ:この手順では、PDMSが硬化するのを防ぐため、すべてのポリマーが硬化し、硬化していないすべてのポリマーが印刷物から除去されます。</li>
	<li>トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シランの蒸着によりモールドをシラン化する。<ol>
<li>3Dモールドを真空デシケーターに入れ、100%濃縮トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを金型の近くに置いたアルミニウム箔にピペットで20 μL入れます。</li>
		<li>デシケーター内に真空を作り、蒸気を発生させ、40分間放置する。</li>
		<li>デシケーターから金型を取り出し、PDMSを注ぐ前に純粋なエタノールですすいでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. マイクロ流体チップの作製
<ol><li>エラストマーとその架橋剤を混合してPDMS混合物を調製する(材料表)。気泡が形成され、PDMS混合物が不透明に見えるまで、混合物を激しく攪拌して2つの成分を均一にブレンドする。 注:架橋剤の量は、エラストマーの量の10重量%でなければならない。</li>
	<li>エラストマーと架橋剤の混合物を真空デシケーターで脱気し、捕捉された気泡を除去する。混合物をデシケーター内で混合に用いた容器に移す(ステップ3.1)。すべての気泡が除去され、混合物が再び透明に見えるまで、脱気プロセスを続けます。 注: 通常、乾燥に必要な時間は 30 分です。</li>
	<li>シリコンマスターに3gの混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「床」として機能するテンプレートを生成します。 メモ: PDMS 層の厚さは、シリコンマスターに注がれる混合液の量を変更することで調整できます。<ol>
<li>厚さ400μmのテンプレートを得るには、シリコンマスターに3gのPDMSを注ぎ、シリコンマスターをスピンコーターの上に置き、21× g で5秒間、54× g で10秒間スピンコートした後、ステップ3.2で説明したように再び脱気して閉じ込められた気泡を除去した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3Dプリントされたモールドに20gのPDMS混合物を注ぎ、マイクロ流体チップの「屋根」として機能するマイクロチャネルを作り、ステップ3.2の説明に従って30分間脱気する。</li>
	<li>シリコンウェーハと3Dプリントモールドの両方を70°Cで少なくとも2時間焼きます。</li>
	<li>PDMS層を3Dプリントされた金型から剥がし、マイクロ流路の周りの刃でPDMSを切断し、マイクロ流体流路の入口と出口として機能する穴を打ち抜きます。</li>
	<li>PDMSをシリコンマスターから剥がし、PDMS層をテンプレートの上に結合されるマイクロ流体チャネルと同じ寸法の小さな断片に切断します。</li>
	<li>テンプレートとマイクロチャネルを1%洗剤溶液( 材料表を参照)で5分間優しくこすり、イオン交換水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャネルをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水ですすいでください。テンプレートとマイクロチャンネルを室温で1バールの圧縮空気で1分間乾燥させます。</li>
	<li>テンプレートとマイクロチャンネルをプラズマクリーナーに入れ、接着する表面を上向きにします。プラズマクリーナーの電源を入れ、テンプレートとマイクロチャンネルを40秒間プラズマ処理します。プラズマクリーナーから取り出し、テンプレートの上にマイクロチャンネルを互いに接触させてすぐに接着します。</li>
	<li>マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに5日間保管してPDMS疎水性回復を確保し、30〜60°10,11の最適な範囲内の後退接触角を有する。</li>
</ol>4. 細菌パターニング
<ol><li>実験の1日前に、 エシェリヒア・コリ (株MG1655 prpsM-GFP)の集団を増殖させた。凍結ストックから直接培養物を接種し、37°Cのシェーカーインキュベーター内のリゾゲンブロス(LB)培地中で20時間一晩生育させた。 細胞に50 μg/mLのカナマイシンを加え、prpsM-GFPプラスミドを保持する。</li>
	<li>実験当日、実験開始前に均一で安定した温度を有するように実験数時間前にボックスインキュベーター(図2A)を37°Cに設定した。シリンジポンプと加熱したガラス板を顕微鏡ステージ(図2B、C)にセットアップし、ボックスインキュベーターと同じ温度に温度を設定します。 注:顕微鏡(図2E)を含むシステム全体が囲まれたボックスインキュベーターは、チャネルを媒体でフラッシュしたときに、実験全体を通して均一で一定の温度が維持されることを保証します。</li>
	<li>実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノール(EtOH)で満たされた容器に入れ、少なくとも10分間、チャネルを100%EtOHでフラッシュする。マイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気する。EtOHを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理する。マイクロ流体チップを70°Cのオーブンに10分間入れ、流路に残った微量の液体を除去した。 注:このステップは、培養培地を流したときのチャネル内の気泡形成を防止するために必要である。この気泡防止プロトコルは、Wangら18から適応された。</li>
	<li>3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)培地(1x)のピペット1 mLを遠心分離バイアルに入れ、10 μLの0.132 Mリン酸カリウム(K2HPO4)を加える。一晩培養物を37°Cのインキュベーターから取り出し、100 μLを遠心分離機バイアルにアリコートし、培養物を2,300 × gで2分間遠心分離した。遠心分離機バイアルから上清を軽くピペットで取り出し、ペレットを0.015% v/vのTween 20および0.01% v/vのリン酸カリウムを含む1mLの新鮮なMOPS培地に再懸濁する。 注:細菌懸濁液の典型的な濃度は0.015〜0.15体積%の範囲であり、これは拡張された移動性蓄積ゾーンの形成を保証し、基質上の粒子の蓄積を防止する。一晩培地を新鮮な培地に交換すると、テンプレート上の細菌のフィルムを放出するリスクが最小限に抑えられます。新鮮な培地中の炭素源の欠如は、テンプレートパターニング中に細胞が懸濁液中で増殖するのを妨げる。懸濁液中のTween 20の0.015% v/vの濃度は、PDMSテンプレート上の後退液の接触角が30〜60°の最適範囲内に収まるようにするために必要である。</li>
	<li>細菌懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。<ol>
<li>シリンジとチューブの接続を固定するには、外径0.6mmの針をチューブに直接挿入します。流路を挟んで入口近傍に残留する懸濁液が飛散するのを避けるために、パターニングプロセス中に出口として使用される孔(図3A−III)を通して新鮮な媒体を流す。</li>
		<li>シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がテンプレート領域をトラップで覆うまで、チャネルの上流部分に位置する入口を通って懸濁液をマイクロ流体チップに注入する。 メモ: 液体注入プロセス中、空気はチャネルの下流端にある出口から逃げることがあります。</li>
		<li>シリンジポンプをセットして、細菌懸濁液(図3A-I)を0.07-0.2μL/minの流速で引き抜くように設定しますが、これは記載された形状ではメニスカス後退速度80-100μm/minに相当します。</li>
		<li>顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視します。 注:ここでは、テンプレート上の後退メニスカスを監視するために10倍の倍率を使用し、微細加工トラップへの個々の細菌の沈着を監視するために20倍の倍率を使用した。</li>
	</ol></li>
	<li>テンプレートが細胞でパターン化されたら(図3A-II)、引き抜き流量を増やしてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、以前に少なくとも30分間脱気し、30°Cで予温した新鮮なLBで洗い流します。</li>
	<li>シリンジポンプを流量2 μL/minに設定して、流路を静かに流します。チャネルが満たされたら、特定の実験ニーズに応じて流量(15 μL/分)を増やします。</li>
	<li>所望の倍率および時間間隔で増殖する細菌の画像を取得する。</li>
</ol>5. コロイドパターニング
<ol><li>遠心分離機バイアルに0.015% v/v Tween 20水溶液900 μLをピペットし、元のコロイド懸濁液100 μLをピペットに入れます。懸濁液を13,500 × g で1分間遠心分離する。上清を静かに取り除き、Tween 20水溶液(0.015% v/v)と交換してください。このプロセスを3回繰り返して、サプライヤーの溶媒をストックサスペンションから完全に交換できるようにします。</li>
	<li>コロイド懸濁液を1mLシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。流路の上流部にある中央部に位置する入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入し、テンプレートが覆われるまで懸濁液を徐々に押し込む。</li>
	<li>メニスカス後退速度1~2μm/minに相当する0.07~0.2μL/minの流速でコロイド懸濁液を抜き取り、顕微鏡ソフトでパターニング過程を画像化します。10倍の倍率を使用してテンプレート上の後退メニスカスを監視し、20倍の倍率を使用して微細加工トラップへの個々の粒子の堆積を観察します。メニスカスがテンプレートの端に達したら流量を増やして、チャンネルをすばやく空にします。 注: 複数のパーティクルで構成されるコロイド配列は、ステップ 5.1 から 5.3 までのパターニング プロセスを直列に実行することによって生成できます。チャネルは、所望のコロイド配列の構成に従って、各反復で新しいコロイド懸濁液をロードされる。各パターニングステップは、コロイド配列に1つの粒子を追加し、トラップが所望の粒子の配列で満たされるまで連続して実行することができる。得られたコロイド配列の組成は、トラップを充填するために使用されるコロイド懸濁液の配列によってのみ与えられる(図3B)。</li>
</ol>

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<li>Ni, S., Isa, L., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+assembly+as+a+tool+for+the+heterogeneous+integration+of+micro-+and+nanoscale+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects.</a> Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).</li>
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<li>Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Insights+into+mechanisms+of+capillary+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly.</a> Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).</li>
<li>Pioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+capillarity-assisted+particle+assembly+in+a+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+metal+nanowires+using+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fabrication of metal nanowires using microcontact printing.</a> Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+prevention+of+bubble+formation+and+accumulation+for+long-term+culture+of+pancreatic+islet+cells+in+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device.</a> Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).</li>
<li>Crowley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

ここで説明するマイクロ流体プラットフォームは、コロイドや細菌などのマイクロサイズの物体をPDMS基板上の所定の空間配置にパターニングすることを可能にする。マイクロフルイディクスが提供する環境条件を完全に制御し、sCAPA技術によって付与されたマイクロメトリック精度で細胞をパターン化する能力により、将来の生理学および生態学研究にとって非常に有望なプラットフォームとなっています。
本研究で提示した実験では、 材料表に報告されたフォトレジストを用いてシリコンマスターを実現した。しかし、PDMS成形で説明され、使用可能なサイズ範囲のフィーチャーを製造するのに適した任意のフォトレジストを使用することができる。マイクロ流路モールドの作製に用いた3D印刷用樹脂についても同様である。記載された寸法の特徴を生成し、PDMS成形と互換性のある任意の樹脂を使用することができる。
このプロトコルでは、マイクロ流体チップを70°Cで5日間保管することで、Tween 20を細菌またはコロイド懸濁液に添加したときの表面親水...

単一の微生物の空間パターニングは、特にマイクロ流体デバイスなどの環境条件を完全に制御できる実験分野では、幅広い文脈で非常に望ましい。例えば、微生物を規則的な配列に配置することで、多数の個々の細胞を正確にイメージングし、それらの増殖、生理機能、環境刺激に応答した遺伝子発現、および薬物感受性の研究を可能にする。また、細胞コミュニケーション(例えば、クォーラムセンシング)、交配(例えば、藻類 - 細菌共生)、または拮抗作用(例えば、アレロパシー)に関する研究において特に関心のある細胞間相互作用を研究することを可能にする。細胞生理・進化研究1、細胞間相互作用研究2、表現型分化スクリーニング3、環境モニタリング4、薬物スクリーニング5 は、このような定量的単一細胞解析を実現できる技術から大きな恩恵を受けることができる分野の一つです。
近年、ホログラフィック光学トラップ6および不均一な表面機能化方法7,8,9,10から単一細胞ケモスタット11および液滴マイクロ流体12まで、単一細胞を単離および処理するためのいくつかの戦略が提案されている。これらの方法は、技術的に非常に要求が厳しいか、細胞生理機能に影響を与え、長期間にわたって研究できる微生物をパターン化するための高スループットプラットフォームを提供しず、単一セル分解能、完全な光学アクセス、および環境条件の制御を保証します。この論文の目標は、毛細管現象支援アセンブリを介してPDMS表面上の所定の空間配置にマイクロメトリック精度で細菌をパターン化するプラットフォームを記述することです。このプラットフォームは、微生物の正確で柔軟な空間パターニングを可能にし、そのマイクロ流体の性質のおかげで、環境条件に対する完全な光学アクセスと制御を可能にします。
このプラットフォームの背後にある技術は、マイクロ流体プラットフォーム16に統合されたsCAPA13,14,15(シーケンシャルキャピラリーアシスト粒子アセンブリ)と名付けられた近年開発されたアセンブリ技術です。蒸発する液滴のメニスカスは、マイクロ流体チャネル内のパターン化されたポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上を後退しながら、液体中に懸濁した個々のコロイド粒子を基板上に微細化されたマイクロメトリックウェルにトラップする毛細管力を発揮する(図1A)。懸濁粒子は、最初に対流電流によって気液界面に輸送され、次いで毛細管現象によってトラップに入れられる。移動メニスカスによって加えられる毛細血管力は、粒子相互作用に関与する力と比較して、より大きなスケールで作用する。
したがって、アセンブリ機構は、粒子の材料、寸法、および表面特性の影響を受けない。粒子濃度、メニスカスの速度、温度、懸濁液の表面張力などのパラメータは、パターニングプロセスの収率に影響を与える唯一のパラメータです。読者は、パターニングプロセスに対する前述のパラメータの影響の詳細な説明をin13、14、15で見つけることができる。オリジナルのsCAPA技術13,14,15では、コロイドパターニングプロセスはオープンシステムで行われ、テンプレートを横切ってサスペンションを駆動するために高精度の圧電ステージが必要でした。このプラットフォームは、異なる戦略を活用し、制御された環境でマイクロフルイディクスで一般的に使用される標準機器でパターニングを実行できるため、サンプルを汚染するリスクを最小限に抑えることができます。
このマイクロ流体プラットフォームは、まずコロイド粒子上で最適化され、不活性粒子の規則的な配列を作成し、その後細菌に首尾よく適用されました。このホワイトペーパーでは、両方のマイクロ流体プラットフォームについて説明します(図1B、C)。プロトコルに記載されている準備ステップと実験装置のほとんどは、2つのアプリケーションで共通です(図2)。我々は、コロイドパターニングを報告して、この技術を使用して同じ表面上で複数の連続的な堆積を行い、複雑でマルチマテリアルパターンを作成できることを実証する。特に、各ステップごとに1つの単一粒子を堆積させて、トラップの形状および充填シーケンスによってのみ決定される特定の形状および組成を有するコロイド配列を形成する。細菌のパターニングに関しては、単一の堆積が記載されており、その結果、トラップごとに1つの細菌が堆積する。細胞が表面にパターニングされると、マイクロ流体チャネルは、細菌増殖を促進するために培地でフラッシュされる、任意の単一細胞研究の予備段階である。

<table><tbody><tr><td>アルカテルAMS 200SE I-Speeder</td><td>アルカテルマイクロマシニングシステム</td><td></td><td>深部反応性イオン交換システム</td></tr><tr><td>アルコノックス</td><td></td><td></td><td>洗剤</td></tr><tr><td>AZ400K現像液</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ400K</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mLシリンジ(ルアーロック)</td><td>BD</td><td>300912</td>、<td>新鮮なLysogenyブロスをマイクロ流体チャネルに流すために使用されます</td></tr><tr><td>ボックスインキュベーター</td><td>ライフ</td><td>チャネル内の均一で一定の温度を確保するために使用される</td>イメージングサービス <td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td>一晩の媒体を新鮮な最小限の媒体に置き換えるために使用されます</td></tr><tr><td>遠心分離機バイアル</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>30120086 1.5 mL</td></tr><tr><td>CETONI Base 120</td><td>CETONI GmbH</td><td></td><td>シリンジポンプ</td></tr><tr><td>直径0.98 & マイクロの蛍光PS粒子;m (red)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi267</td><td></td></tr><tr><td>直径1.08の蛍光PS粒子 &m (green)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi182</td><td></td></tr><tr><td>直径2.07の蛍光PS粒子 &m (green)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi183</td><td></td></tr><tr><td>直径2.08の蛍光PS粒子 &10cm</td>シリコンウェーハのプラズマ処理に使用されるm(赤)<td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi180</td><td></td></tr><tr><td>Gigabatch 310 M</td><td>PVA TePla</td><td></td><td></td></tr><tr>加熱ガラス板の<td>H401-T-CONTROLLER</td> 加熱<td>ガラス板の</td><td>Okolab</td><td></td>コントローラー</tr><tr><td>H601-NIKON-TS2R-GLASS</td><td>Okolab</td><td></td><td>加熱ガラス板</td></tr><tr><td>ハイデルベルクDWL 2000</td> ハイ<td>デルベルグ機器</td><td></td><td>UVダイレクトレーザーライター</td></tr>イン<tr><td>スリンシリンジ、U 100、ル</td><td>アーCodan Medical ApS</td><td>CODA621640</td><td>1 mLシリンジを使用して、パターニングプロセス中に液体懸濁液を回収するために使用</td></tr><tr><td>Klayout</td><td>Opensource</td><td></td>は、<td>シリコン</td></tr><tr><td>マスターLBブロス、ミラー(Luria-Bertani)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>244610</td><td>Lysogenyブロスをマイクロ流体チャネルMasterflexにフラッシュしました</td></tr><tr><td>トランスファーチューブ</td><td>Masterflex</td><td>HV-06419-05</td><td>0.020'' ID, 0.06'' OD</td></tr><tr><td>MOPS (10x)</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>10倍をミリQ水で10倍に希釈し、一晩中媒体の交換に使用</td></tr> ニ<tr><td>コンエクリプス Ti2</td><td>ニコンインスツルメン</td><td></td><td>ツ顕微鏡</td></tr><tr><td>openSCAD</td><td></td><td></td><td>金型の設計に使用</td></tr><tr><td>OPTIspin SB20</td><td>ATMグループ</td><td>51-0002-01-00</td>スピン<td>現像</td></tr><tr><td>液 プラズマチャンバー Zepto</td><td>Diener 電子</td><td>ZEPTO-1</td><td>テンプレートとマイクロチャネルをプラズマ処理してそれらを結合するために使用される</td></tr><tr><td>ポジティブフォトレジスト AZ1505</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ1505</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>MOPS 1x</td></tr><tr><td>Prusa 硬化および洗濯機 CW1S</td><td>Prusa</td><td></td> <td>に追加すべてのポリマーが硬化し、未硬化のポリマーが型から除去されることを確認するために使用されます</td></tr><tr><td>Prusa Resin - Tough</td><td>Prusa Research a.s.</td><td></td><td>3Dプリント用UV感光性405nm液体樹脂</td></tr><tr><td>Prusa SL1 3Dプリンター</td><td></td><td></td><td>モールドのプリントに使用</td></tr><tr><td>スケール</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>PDMS混合物の重量に使用</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ(10cm)</td><td>シリコンマテリアルズ株式会社</td><td></td><td>N/フォス <100> 1-10 & オメガ;cm</td></tr><tr><td>S&uuml;ss MA6 マスク アライナー</td><td>SUSS MicroTec グループ</td><td></td><td>クロムガラス マスクと基板を位置合わせし、基板を露出させるために使用されます</td></tr><tr><td>シルガード 184</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td>シリコーン エラストマー キット; 硬化剤</td></tr><tr><td>テクニ エッチング Cr01</td><td>テクニック</td><td></td><td>クロム エッチング</td></tr><tr><td>トリクロロ (1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル) シラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>448931</td><td>3Dプリント金型をシリアン化するために使用されます</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td>は、<td>パターニング プロセス中に最適な後退接触角を確保するために使用されます</td></tr><tr><td>Veeco Dektak 6 M</td><td>Veeco</td><td></td><td>プロファイラー</td></tr><tr><td>VTC-100 バキューム スピン コーター</td><td>MTI コーポレーション</td><td></td><td>バキューム スピン コーター</td></tr></tbody></table>

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

定義された空間配置への微生物の制御されたパターニングは、微生物生理学および相互作用の研究を含む、広範囲の生物学的用途のためのユニークな可能性を提供する。最も単純なレベルでは、微生物の正確な空間パターニングは、多数の個々の細胞の信頼性の高い長期イメージングを可能にし、距離依存の微生物 - 微生物相互作用を定量的に研究する能力を変革する。よりユニークなことに、マイクロ流体技術によって提供される正確な空間パターニングと環境条件の完全な制御を組み合わせることで、微生物生態学における単一細胞研究のための強力で汎用性の高いプラットフォームが提供されます。 
このホワイトペーパーでは、マイクロ流体チャネル内で微生物の汎用性とユーザー定義のパターンを生成し、長期的かつ高スループットのモニタリングのための完全な光アクセスを可能にするマイクロ流体プラットフォームを紹介します。この新しいマイクロ流体技術は、毛細管現象支援粒子アセンブリに基づいており、マイクロ流体チャネル内の蒸発懸濁液の制御された動きから生じる毛細管力を利用して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板上に微細化されたトラップのアレイに個々のマイクロサイズの物体を堆積させる。シーケンシャルデポジションは、トラップのジオメトリと充填シーケンスによってのみ決定される、単一または複数のタイプのマイクロサイズのオブジェクトの所望の空間レイアウトを生成する。 
プラットフォームは、異なる寸法および材料のコロイド粒子を使用して較正されており、多様なコロイドパターンを生成し、捕捉された粒子の表面官能化を実行するための強力なツールであることが証明されています。さらに、プラットフォームを微生物細胞上で試験し、モデル細菌として 大腸菌 細胞を使用した。何千もの個々の細胞を表面にパターン化し、その成長を経時的にモニターした。このプラットフォームでは、単一細胞堆積とマイクロ流体技術を組み合わせることで、微生物の幾何学的パターニングと環境条件の正確な制御の両方が可能になります。したがって、予備実験によって示されているように、単一の微生物の生理学と微生物と微生物の相互作用の生態学への窓が開かれます。

毛細管現象支援アセンブリを利用して、PDMSテンプレート上に微細加工されたトラップにコロイド粒子と細菌をパターン化するマイクロ流体プラットフォームが開発されました。毛細管現象支援アセンブリによるコロイドと細菌のパターニングを最適化するために、2つの異なるチャネル形状が設計されています。最初のチャネル形状(図1B)は、長さ23mmの平行な3つのセクションで構成され、それらの間に物理的な障壁はありません。側面の2つのセクションは幅5mm、高さ1mmで、中央セクションは幅7mm、高さ500μmです。この設計は、後退する凸状のメニスカスを有する明確に定義された可動液滴を維持するのに役立つ。このプラットフォームの動作原理は、Pioliらによって詳細に説明されています。実験で横方向の流路を充填する必要がある場合、細菌培養の場合のように、通常、エアポケットが形成される。このため、チャネルを媒体でフラッシュしたときの充填プロセスを簡素化する2番目のジオメトリを設計してテストしました。この場合、プラットフォーム(<strong class="xfi...

マイクロ流体プラットフォーム内の毛細管現象支援アセンブリを用いて、細菌やコロイドなどの液体中に浮遊するマイクロサイズの物体をポリジメチルシロキサン基板上の所定のアレイにパターニングする技術を提示する。

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

この方法は、マイクロ流体チャネル内で微生物のユーザ定義パターンを生成することを可能にする。パターン化されると、微生物をモニタリングして、その長期的な生理機能と相互作用をハイスループットで評価することができます。毛細管力の使用は、異なるクラスの材料に適用可能なパターニングのための非特異的経路を可能にする。例えば、コロイド粒子や細菌が挙げられる。また、対象となる材料の空間配置を絶妙に制御した大きな配列を生成することを可能にする。今日まで、我々はコロイド粒子および微生物細胞にこの方法を試験し、適用した。その結果、材料工学や、薬物スクリーニングなどの定量的単一細胞分析を必要とする分野での応用が期待できます。まず、エラストマーとその架橋剤を混合してPDMS混合物を調製する。次に、気泡が形成され、PDMS混合物が不透明に見えるまで、混合物を激しく攪拌して2つの成分を均一にブレンドする。次に、すべての気泡が除去され、混合物が再び透明に見えるまで、真空デシケーターで混合物を脱気する。マイクロ流体チップの厚さ400マイクロメートルのテンプレート床を得るために、3グラムの混合物をシリコンマスター上に注ぎ、シリコンマスターをスピンコーター上に置き、21回Gで5秒間、54回Gで10秒間スピンコートする。前述のように捕捉された気泡を除去するための脱気を再度行う。PDMS混合物20グラムを3Dプリントされた型に注ぎ、マイクロ流体チップの屋根として機能するマイクロチャネルを作り、前述のように30分間脱気する。シリコンウェーハと3Dプリントモールドを摂氏70度で少なくとも2時間焼いた後、PDMSを3Dプリントモールドの輪郭に沿って切断して剥がします。マイクロ流路の周りのブレードでPDMSを切断し、マイクロ流体流路の入口と出口として機能する穴を打ち抜きます。次に、PDMSを切断してシリコンマスターから剥がし、PDMS層をテンプレートの上に接着されるマイクロ流体チャネルと同じ寸法の小さな断片に切断します。1%洗剤溶液を使用してテンプレートとマイクロチャンネルを5分間優しくこすり、イオン交換水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャネルをイソプロパノールですすぎ、脱イオン水ですすいでください。次に、テンプレートとマイクロチャンネルを室温で1分間乾燥させ、圧縮空気を1バールで乾燥させます。テンプレートとマイクロチャンネルをプラズマクリーナーに入れ、接合面を上向きにします。プラズマクリーナーの電源を入れた後、テンプレートとマイクロチャンネルを40秒間プラズマ処理し、プラズマクリーナーから取り出して、すぐにテンプレートの上にマイクロチャンネルを接着します。マイクロ流体チップを摂氏70度のオーブンに5日間保管し、PDMSの疎水性回復を確保します。実験当日、実験数時間前にボックスインキュベーターを37°Cに設定し、シリンジポンプと加熱したガラス板を顕微鏡ステージ上に設置し、ボックスインキュベーターと同じ温度に設定した。実験の90分前に、マイクロ流体チップを100%エタノールで満たされた容器に入れ、チャネルを100%エタノールで少なくとも10分間フラッシュし、次いでマイクロ流体チップを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間脱気する。エタノールを蒸留水と交換し、チップを少なくとも30分間真空処理します。マイクロ流体チップを摂氏70度のオーブンに10分間入れて、流路に残っている液体の痕跡を除去します。遠心分離機バイアルに1ミリリットルのMOPS培地をピペットし、10マイクロリットルの0.132モルリン酸カリウムを加える。一晩培養物100マイクロリットルを遠心分離機バイアルにアリコートし、培養物を2,300倍Gで2分間遠心分離した。上清を静かに廃棄して、ペレットを0.015%のTween 20および0.01%のリン酸カリウムを含む1ミリリットルの新鮮なMOPS培地に再懸濁し、細菌懸濁液を1ミリリットルのシリンジに装填する。シリンジとチューブ接続を固定するには、チューブに直接針を挿入します。次に、シリンジをシリンジポンプに取り付け、懸濁液がトラップでテンプレート領域を覆うまで、チャネルの上流部分に位置する入口からマイクロ流体チップに懸濁液を注入します。シリンジポンプを毎分0.07〜0.2マイクロリットルの流量に設定して、細菌懸濁液を回収し、顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを監視する。テンプレートが細胞でパターン化されたら、引き抜き流量を増やしてマイクロ流体チャネルをすばやく空にし、以前に少なくとも30分間脱気し、摂氏30度で予温した新鮮なLBで洗い流します。次に、シリンジポンプを毎分2マイクロリットルの流量に設定して、チャネルを静かにフラッシュします。流路が満たされたら、再び流量を増やします。所望の倍率および時間間隔で増殖する細菌の画像を取得する。900マイクロリットルの0.015%Tween 20水溶液を遠心分離バイアルにピペットし、次いでその中に元のコロイド懸濁液100マイクロリットルをピペットする。懸濁液を13、500倍Gで1分間遠心分離し、上清をTween 20水溶液で穏やかに交換する。コロイド懸濁液を1ミリリットルのシリンジにロードし、マイクロ流体チューブを介してシリンジをチップに接続します。流路の上流部分の中央部内に位置する入口を通ってマイクロ流体チップに懸濁液を注入し、テンプレートが覆われるまで懸濁液を徐々に押し込む。毎分0.07〜0.2マイクロリットルの流速でコロイド懸濁液を抜き取り、顕微鏡ソフトウェアを介してパターニングプロセスを画像化する。メニスカスがテンプレートの端にすばやく到達したら、流量を増やします。ストレートチャネル形状を利用して、5,000個の分析トラップの83%を堆積させる蛍光大腸菌株の静止した段階的細胞をパターン化しました。パターン化された細菌は、チャネルが新鮮なLBで満たされたときから1.5時間以内に異なる時間に増殖を再開した。増殖が再開されると、単一の細菌細胞は個々のコロニーを形成し始め、表層が形成され、単一細胞分解能が失われるまで拡大した。55,000個のトラップにわたって実施された分析は、2マイクロメートルおよび1マイクロメートルの直径粒子によって作られた緑 - 赤色二量体が、それぞれ分析されたトラップの93%および89%で形成されたことを示した。そして、緑 - 赤 - 緑のトリマーはトラップの52%に形成されました。パターン化された粒子間の距離は、反対方向に2回の堆積を行い、したがって、各トラップの両端にそのような粒子を捕捉することによって正確に制御することができる。パターニングプロセス中の結露を防ぐために、テンプレート全体で均一な温度を確保することが重要です。この目的のために、我々はテンプレートの下に加熱されたガラス板を置き、それをボックスインキュベーターと同じ温度に設定する。この方法は、定量的単一細胞分析を含む様々な生物学的研究に使用することができる。ユニークな利点は、同じ実験領域内で大規模な統計を提供する何千ものセルのパターン化を可能にする高スループットの性質です。

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Research

JoVE Journal

Engineering

工学

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌)...

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はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

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シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

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