カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ
2022年4月11日
このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。
この技術の主な利点は、動物が装置内で自由に成長でき、高解像度のイメージングのためにトラップできることです。デバイスは数回再利用できます。デバイスを製造する際、清浄度は、デバイスの操作中の漏れを防ぐためにほこりのないデバイスを製造できるようにするための最も重要な要素です。
ワードプロセッシングソフトウェアで長方形を使用して、フローレイヤーのパターン1とコントロールレイヤーのパターン2の設計を開始し、ポリエステルベースのフィルムに最小8マイクロメートルのフィーチャーサイズを持つレーザープロッターを使用してフォトマスクを印刷します。シリコンウェーハを高さと幅が2.5センチメートルの正方形にカットします。20%水酸化カリウムで1分間洗浄し、ウェーハを脱イオン水ですすいでください。
一方のウェーハをフローに使用し、もう一方のウェーハを制御層に使用します。14 P-S-I圧縮窒素ガスでピースを乾燥させた後、摂氏120度のホットプレートで4時間脱水します。冷却後、シリコン片を1つ取り、スピンコーダーのチャックに置き、真空をオンにしてウェーハを所定の位置に保持します。
シリコン片に約20マイクロリットルのヘキサメチルジシランを置き、スピンコーダーを使用して500 R-P-Mで5秒間コーティングした後、3000 R-P-Mで30秒間コーティングします。フロー層に固有の約40マイクロメートルの均一なフォトレジスト厚さを得るには、スピンコーダーを使用して約1.5ミリリットルのネガフォトレジスト1をシリコンウェーハに500 R-P-Mで5秒間塗布した後、2000 R-P-Mで30秒間コーティングします。シリコン片をヘキサメチルジシランで塗布し、2枚目のウェハに対してネガ型フォトレジスト1枚を繰り返し、制御層に固有の約40マイクロメートルの均一なフォトレジスト厚さを得た。
あるいは、高齢の動物のためにフロー層の厚さを約80マイクロメートルに増やすために、シリコンウェーハを約1.5ミリリットルのネガフォトレジスト2でコーティングし、スピンコーダーを使用して500 R-P-Mで5秒間、続いて2000 R-P-Mで30秒間。以前にフォトレジストでコーティングされた両方のシリコーン片をホットプレートで摂氏65度で1分間焼き、続いて摂氏95度で10分間焼きます。冷却後、フォトレジスト塗布面をU-Vランプに向けて、U-Vイルミネーターの露光ステージに柔らかく焼き上げたシリコーン片を置きます。
パターン1と2のフォトマスクを通して200ワットのランプを使用して、2つのピースを別々にU-Vに15秒間さらし、それぞれフローレイヤーとコントロールレイヤーを取得します。前述のように、コーティングされた層を上に向けて、露出した2つのシリコーン片を焼きます。片を冷却した後、シリコーン片をフォトレジスト現像液に20分間浸してパターンを現像する。
パターンが見えたら、純粋なイソプロピルアルコールですすぎ、窒素ガスを使用して静かにブロードライします。シリコーン片は、コーティングされた表面を上に向けてデシケーターに入れてください。スライドガラスに50マイクロリットルの純粋なT-C-P-F-O-Sを注ぎ、破片をシラン蒸気にさらします。
スライドをデシケーターの中に置き、2時間インキュベートします。エラストマーベースと硬化剤を混合してプラスチックカップにP-D-M-Sを作り、3分間絶えず攪拌します。P-D-M-Sミックスをデシケーターで30分間脱気して、すべての気泡を取り除きます。
制御層シリコンウェーハをペトリ皿に入れ、厚さ5ミリメートルのP-D-M-Sミックス層をシリコン片に注ぎます。P-D-M-S注液処理後、P-D-M-Sミックスの脱気を繰り返します。フロー層のあるシリコンウェーハをスピナートラックに向けて置き、200〜500ミリトルの真空圧をかけます。
シリコンウェーハに約1ミリリットルのP-D-M-Sを注ぎます。スピンコーターを使用してエンコードすると、約80マイクロメートルの厚さの層が得られます。2枚のシリコンウェーハをスピンコートしたP-D-M-Sで焼き、P-D-M-S層を50°Cの熱風対流式オーブンで6時間注ぎます。
冷却後、鋭利な刃を用いて制御層の周りのシリコン片から厚さ5ミリのP-D-M-S層を切り出し、シリコン基板から剥離する。P-D-M-Sブロックのリザーバーにハリスパンチャーを使用して直径約1ミリメートルの2つの穴を開け、固定化チャネルと隔離チャネルの入口をP-D-M-S膜偏向用のガスラインに接続します。スピンコーティングされたP-D-M-S層が入ったシリコン片をパターン1の上に置き、P-D-M-Sコーティングされた表面をプラスチックトレイの上に向けています。
パターン2のパンチされたP-D-M-Sブロックを、成形面を上に向けてトレイに置いておきます。プラスチックトレイをプラズマクリーナー内に保ち、低真空を適用して2つのP-D-M-S表面を18ワットの空気プラズマに2分間さらします。2つのプラズマ処理されたブロックを取り出し、パターン1とパターン2のプラズマ処理面を一緒に押し付けてブロックを穏やかに結合します。
接着パターンを摂氏50度で熱風対流式オーブンで2時間焼きます。接合されたデバイスをオーブンから取り出した後、パターン1とパターン2のシリコンウェーハから切り取り、ハリスパンチャーを使用してフロー層の入口と出口のリザーバーに穴を開けます。接着されたP-D-M-Sブロックをフロー層を上に向けてプラスチックトレイに置き、同じトレイにきれいなカバーガラスを保管します。
カバーガラスのブロックを18ワットの空気プラズマに2分間さらします。真空圧を調整して、紫色のチャンバーを確認します。プラズマ露出したP-D-M-Sブロックをカバーガラス上に置き、接着構造を摂氏50度のオーブンで2時間焼きます。
将来の実験のために、デバイスをクリーンチャンバーに保管してください。装置を取り、実体顕微鏡に置き、チューブを取り付けます。マイクロフレックスチューブを圧縮窒素ガスラインに接続し、もう一方の端に3方向コネクタを接続します。
3方向コネクタのチューブ1と2をそれぞれ隔離膜のトラップに接続します。2本のマイクロフレックスチューブを三方活栓の2つの出口ポートに接続します。2本のチューブのもう一方の端を長さ8ミリメートルの18ゲージの針に接続します。
入口ポートを通してマイクロピペットを使用して、フロー層をM-9バッファーで満たします。針に接続された端から両方のチューブに脱イオン水を入れます。2本の針を、隔離膜と捕捉膜を接続するパンチ穴に挿入します。
窒素ガスレギュレーターを14 P-S-Iで開き、チューブ1から三方弁を回して、制御層のマイクロ流体チャネル、つまりトラップ膜と隔離膜を介して水をデバイスに押し込みます。チャネルが水で満たされ、プライミングされたら、三方活栓を使用して圧力を解放します。流路を通して追加の媒体を流すことによって気泡を除去する。
図は、マイクロ流体チップ内で動物が成長し、8〜10時間ごとに固定化して蛍光画像をキャプチャするP-S-3-2-3-9の画像を示しています。発現パターンの変動は、同じ遺伝子が異なる発生段階の異なる細胞で発現される時間的遺伝子調節の例を表す。カエノラブディティスエレガンスの個々のW-D-I-S-5-1遺伝子型のイメージングは、各P-V-Dニューロンにメノラー様の分岐樹状突起構造を示し、それぞれL-2、後期L-2、L-3、およびL-4の発生段階で一次、二次三次、および四次プロセスを含む。
本明細書の図は、P−V−D発生および装置増殖動物と、N−G−Mプレート上で増殖させた動物とを比較する。ワーム発生のさまざまな段階でのS-PおよびQ-Pの数は、年齢とともに増加しました。カエノラブディティスエレガンスは、高解像度イメージングに必要な十分な麻痺を引き起こすために、3ミリモルのレバミゾールの滴で治療されました。
S-P値は、N-G-Mプレート上で増殖させ、寒天スライド上で3ミリモルのレバミゾールを用いて画像化した類似の病期動物と測定した場合、有意差はなかった。さらに、尾部に存在する2つのP-V-C細胞体と外陰部付近に存在する2つのP-V-C細胞体の間の距離は、装置内で増殖した動物とN-G-Mプレート上で増殖した動物の両方で離れるにつれて増加する。図は、マイクロ流体デバイス内で増殖する動物由来の触覚受容器ニューロンの高解像度画像を表す。
モンタージュは、ミトコンドリアとニューロンプロセスを強調する連続した時点でのP-L-M-Rニューロンプロセス全体を表します。グラフは、毎時10.4マイクロメートルの傾きで増加することが観察された総ニューロンプロセス長を表しています。微細加工されたデバイスは、高圧窒素ガスの存在下で偏向された薄いP-D-M-S膜を使用して、高解像度イメージングのためにC-エレガンスを固定化して所定の位置に保持します。
この手順により、長期間にわたって断続的な観察を必要とするC-エレガンスの細胞および細胞内プロセスの縦断的研究が可能になります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、36時間まで連続的な食料供給下でC. elegansを育成するためのマイクロ流体チップの設計と製造方法を概説しています。また、発生過程中の細胞プロセスの高解像度長期撮影を可能にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- マイクロ流体工学
- 発生生物学
背景
- この技術により、デバイス内でC. elegansを自由に成長させることができます。
- 動物が捕捉されている間に高解像度の撮影を行うことができます。
- デバイスは複数回再利用できます。
- 製造中は漏れを防ぐために清潔さが重要です。
研究目的
- C. elegansを研究するためのマイクロ流体デバイスを開発すること。
- 長期間にわたる継続的な食料供給と撮影を可能にすること。
- 細胞および細胞内プロセスの観察を容易にすること。
使用した方法
- ソフトウェアで長方形の形状を使用して流れと制御層を設計すること。
- レーザープロッターでフォトマスクを印刷すること。
- シリコンウェハーを2.5 cmの正方形に切断すること。
- カリウム水酸化物でウェハーを洗浄し、脱イオン水ですすぐこと。
主な結果
- デバイスはC. elegansの成長を成功裏にサポートします。
- 発生過程中に高解像度の撮影が達成されます。
- この方法により、デバイスの繰り返し使用が可能になります。
- デバイスの機能性を維持するために清潔さを保つことが重要です。
結論
- このマイクロ流体チップ設計は、C. elegansの研究に効果的です。
- 連続的な食料供給を提供し、長期の撮影を可能にします。
- このアプローチは様々な発生研究に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables longitudinal imaging of C. elegans without anesthetic interference, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening workflows. By allowing repeated high-resolution imaging of the same animal over developmental timepoints, it improves predictive confidence in early discovery assays. The system provides a disease-relevant system for studying neuronal growth, vulval development, and dendritic arborization with translational biomarker alignment potential.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through time-lapse imaging of neuronal process growth and subcellular events in individual animals.
- Operational Value: Supports biological de-risking by capturing temporal gene regulation patterns and developmental progression without confounding anesthetic effects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by maintaining animal health and enabling continuous food supply during extended culture.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent immobilization via elastomeric membrane deflection using nitrogen gas pressure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by imaging dendritic arborization in PVD sensory neurons across L2-L4 stages.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by generating quantitative dependent variable measurements such as neuronal process length increase (10.4 μm/hour).
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by enabling repeated imaging sessions that support mechanistic de-risking and predictive confidence in target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by immobilizing animals for high-resolution imaging of cellular and subcellular events over time.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through time-lapse imaging of developmental phenomena such as vulval formation and neuronal branching.
- Analytics: Enables measurement of dependent variables like neuronal process length and subcellular localization to compare conditions and track progression.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling developmental processes relevant to human neurodevelopment and disease.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability due to cleanable PDMS design and standard worm handling compatibility, reducing per-assay cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through longitudinal imaging, target validation via subcellular resolution, and reduction of mechanistic ambiguity in developmental pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability enabled by single-pressure-line operation and no external valves.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency through device reuse, and reduced late-stage biological risk by detecting developmental defects early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative imaging readouts and developmental trajectory alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic fabrication, photolithography, and PDMS bonding techniques.
- Needs access to spin coaters, UV illuminators, plasma cleaners, and nitrogen gas pressure control systems.
- Demands cross-team standardization of chip preparation, priming, and worm loading protocols for consistent results.
- Requires adaptation considerations when scaling to different worm strains or developmental stages due to channel geometry constraints.
- Practical limitations include the need for dust-free fabrication to prevent leakage and careful handling to maintain membrane integrity during repeated use.
