Name: カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶマイクロ流体チップを用いたC. elegansの長期増殖と高解像度イメージング法。36時間の連続給餌と細胞プロセスの観察が可能で、発生生物学研究に有用です。

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我々は、CIFFイメージング施設、NCBSがDST-ナノテクノロジーセンター(No.SR / 55 / NM-36-2005)。DBT (SPK)、CSIR-UGC (JD)、DST (SM)、DBT (SM)、DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK and Gautam Menon) が支援するスピニングディスク、および HHMI-IECS grant number 55007425 (SPK) からの研究資金に感謝する。HB101、 PS3239、および wdIs51 株は、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されている Caenorhabditis 遺伝学センター(CGC)によって提供されました。S.P.K.はマイク・ノネットの研究室で jsIs609 を製作しました。

<ol><li>Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Mutant+Identification+with+a+One-Step+Whole-Genome-Sequencing+and+SNP+Mapping+Strategy%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy.</a> PloS One. 5 (11), 15435(2010).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook.+The+C.+elegans.+Research+Community%2C+WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).</li>
<li>Steele, L. M., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+Anesthetic+Mechanisms%3A+The+C.+elegans+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model.</a> Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).</li>
<li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook.+The+C.+elegans.+Research+Community%2C+WormBook%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).</li>
<li>Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+orienting+C.+elegans+using+geometry+at+microscale+for+high-throughput+visual+screens+in+neurodegeneration+and+neuronal+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies.</a> PloS One. 7 (4), 35037(2012).</li>
<li>Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+device+for+size+based+separation+of+C.+elegans+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages.</a> Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Desta, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+Trapping+of+a+Single+C.+elegans+Worm+in+a+Microfluidic+Chip+for+Automated+Microplate+Dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing.</a> SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).</li>
<li>Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+and+High-Throughput+In+Vivo+Drug+Screening+Platforms+Using+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics.</a> Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7, 13023(2016).</li>
<li>Fehlauer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Microfluidics+Device+for+Mechanical+Stimulation+and+High+Resolution+Imaging+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Cornaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+C.+elegans+embryo+arraying%2C+phenotyping%2C+and+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging.</a> Scientific Reports. 5, 10192(2015).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).</li>
<li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).</li>
<li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li>
<li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NemaLife+chip%3A+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).</li>
<li>Allen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Mitochondrial+Density+and+Positioning+along+a+Growing+Neuronal+Process+in+Individual+C.+elegans+Neuron+Using+a+Long-Term+Growth+and+Imaging+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+High-Resolution+Imaging+of+Developing+C.+elegans+Larvae+with+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time-lapse+microscopy+of+C.+Elegans+post-embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development.</a> Nature Communications. 7, 12500(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biostable%2C+anti-fouling+zwitterionic+polyurethane-urea+based+on+PDMS+for+use+in+blood-contacting+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+materials+chemistry+B%22%5BJournal%5D)">A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices.</a> Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).</li>
<li>Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+thin+films+as+biocompatible+coatings+for+microfluidic+devices%3A+cell+culture+and+flow+studies+with+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+ResearchPart+A%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells.</a> Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).</li>
<li>Folch, A., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+micropatterns+on+biocompatible+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Cellular micropatterns on biocompatible materials.</a> Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).</li>
<li>Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+PDMS+%28polydimethylsiloxane%29+bioreactor+for+large-scale+culture+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes.</a> Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).</li>
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<li>Fatouros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Tau+aggregation+in+a+novel+caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy+mitigates+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).</li>
<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+and+cell-speci+fi+c+expression+pro+fi+ling+reveal+dynamic+branching+and+molecular+determinants+of+a+multi-dendritic+nociceptor+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans.</a> Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
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<li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+fates+are+distinguished+by+a+transcriptional+switch+that+regulates+dendrite+branch+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization.</a> Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).</li>
<li>Shrestha, B. R., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+morphogenesis%3A+worms+get+an+EFF+in+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization.</a> Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).</li>
<li>Sure, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-16%2FJIP3+and+UNC-76%2FFEZ1+limit+the+density+of+mitochondria+in+C.+elegans+neurons+by+maintaining+the+balance+of+anterograde+and+retrograde+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+distribution+of+mitochondria+in+touch+receptor+neurons+of+C.+elegans+influences+touch+response%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
</ol>

S.M.およびS.P.K.は、マイクロ流体成長およびイメージングデバイスに関する出願中の特許(特許出願番号640/CHE/2011)の著者である。

この論文では、成長中の単一の動物の一定の食物供給と高解像度イメージングを備えた C.エレガンス を成長させるための単純なマイクロ流体デバイスの製造と使用のためのプロトコルが説明されています。この製造プロセスは簡単で、非滅菌環境で行うことができます。製造段階では、ほこりのない環境が重要です。ダスト粒子の存在は、2つの結合面間の不適切な接触につながり、 C.エレガンス が固定されている間、高圧印加中のデバイスの結合不良および漏れをもたらす。製造されたすべてのデバイスのうち、95%のデバイスが実験に適しています。製造中または使用中の不適切なボンディングが原因で、少数のデバイス(5%)が故障します。世界中のいくつかの学術機関で利用可能な無塵(>1,000グレードのクリーンルーム)内で製造プロセスを実行することで、接着の失敗を減らすことができます。流路からバクテリアフードをきれいにし、デバイスの再利用を可能にするには、実験のたびにアルコールを流してデバイスを洗い流します。 
このプロトコルは、C. elegansのさまざまな発生段階やサイ...

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学、老化、発生生物学、および神経生物学を研究するための強力なモデル生物であることが証明されています。その透明な体、短いライフサイクル、容易なメンテナンス、定義された数の細胞、いくつかのヒト遺伝子との相同性、およびよく研究された遺伝学などの利点により、C.エレガンスは基礎生物学の発見と応用研究の両方で人気のあるモデルになりました1,2。個々の動物の繰り返しの長期観察から細胞の生物学的および発生的プロセスを理解することは有益であることがわかります。従来、C.エレガンスは寒天パッド上で麻酔をかけ、顕微鏡下で画像化されていました。動物の健康に対する麻酔薬の悪影響は、同じ動物の長期および反復断続的なイメージングのための麻酔動物の使用を制限します3,4。近年のマイクロ流体技術の進歩と、健康被害が無視できるほどのC.エレガンスの無麻酔トラップへの適応により、同じ動物の短期間および長期間にわたる高解像度イメージングが可能になりました。
マイクロ流体チップは、C. elegans'5ハイスループットスクリーニング6,7,8、トラップおよび分注9、薬物スクリーニング10,11、高解像度イメージングによるニューロン刺激12、および動物の高解像度イメージング12,13,14用に設計されています。スライドに固定化するための超薄型マイクロ流体シートも開発されている15。C.エレガンスの長期研究は、液体培養で成長する動物の低解像度画像を使用して、成長、カルシウム動態、行動に対する薬物の影響を観察して行われています16,17,18,19、それらの寿命、および老化20。シナプスの発達21、ニューロンの再生22、およびミトコンドリアの付加23を評価するために、高解像度顕微鏡を使用した長期的な研究が行われています。細胞の運命および分化の長期高解像度画像化および追跡は、マルチチャネルデバイス24,25で行われている。いくつかの細胞および細胞内イベントは数時間の時間スケールで発生し、in vivoでの細胞動態を理解するためのプロセスのすべての中間ステップを特徴付けるために、発生中の異なる時点で同じ個体をトラップする必要があります。器官形成、神経発生、細胞移動などの生物学的プロセスを画像化するには、動物を複数の時点で同じ方向に固定化する必要があります。我々は以前、ミトコンドリアが触覚受容体ニューロン(TRN)に沿って付加される場所を決定するために、C.エレガンスを36時間以上高解像度イメージングするためのプロトコルを公開しました23。
この論文は、高解像度イメージングを繰り返すためのマイクロフルイディクスベースの方法論を確立するためのプロトコルを提供します。この装置は、単一の流路を有し、装置ごとに1匹の動物の繰り返しイメージングに最適です。スループットを向上させ、一度に多くの動物を画像化するために、複数のデバイスを同じ圧力ラインに接続できますが、各デバイスの1匹の動物を制御する別々の3ウェイコネクタを使用します。このデザインは、胚発生後の発生過程、細胞移動、オルガネラ輸送、遺伝子発現研究など、高解像度のタイムラプス画像を必要とする研究に役立ちます。この技術は、多くの後期動物の並行成長とイメージングを必要とする寿命や老化の研究など、一部のアプリケーションに制限される可能性があります。ポリジメチルシロキサン(PDMS)エラストマーは、その生物学的安定性26、生体適合性27,28、気体透過性29,30、および調整可能な弾性率31のために、このデバイスの製造に使用されました。この2層装置は、マイクロ流体チャネルでの連続的な食物供給と、窒素ガスを使用したPDMS膜圧縮による個々のC.エレガンスの捕獲により、動物の成長を可能にします。この装置は、連続的な食物供給3の下でマイクロチャネル内で同じ動物を成長および画像化できるという利点を有する以前に公開された装置の拡張である。追加の分離膜ネットワークと2mm幅のトラップ膜により、発育中の動物の効率的な固定化が可能になります。このデバイスは、感覚PVDニューロンのニューロンの発達、外陰部の発達、および樹状突起の樹木形成を観察するために使用されています。動物は、デバイス内で健康に悪影響を与えることなく成長し、その発生中に同じ動物における細胞内イベントのイメージングを容易にするために繰り返し固定化することができる。
プロトコル全体は5つの部分に分かれています。パート1では、成長およびイメージングチップのデバイス製造について説明します。パート2では、PDMS膜たわみの圧力システムを設定して、個々の C.エレガンスを固定化して分離する方法について説明します。パート3では、デバイスイメージングのために線虫増殖培地(NGM)プレート上で C.エレガンス を同期させる方法について説明します。パート4では、1匹の動物をデバイスにロードし、マイクロ流体デバイス内で数日間動物を成長させる方法について説明します。パート5では、複数の時点で個々の動物を固定し、さまざまな対物レンズを使用して高解像度の画像をキャプチャし、フィジーを使用して画像を分析したりする方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>18 G 針</td><td>Sigma-Aldrich、バンガロール、インド</td><td>ゲージ 18</td><td></td></tr><tr><td>3 ウェイ ストップコック</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-30600-02</td><td>ルアーロック付きマスターフレックスフィッティング</td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>Andor Technology</td><td>EMCCD C9100-13no</td><td></td></tr><tr><td>回路基板フィルム</td><td>Fine Line Imaging、コロラド州、米国</td><td></td><td>デザインは 65,024 ドット/インチ (DPI)</td></tr> <tr><td>で印刷されています対流式オーブン</td><td>メタラボ サイエンティフィック インダストリーズ、インド</td><td>MSI-5</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>ブルースタット 顕微鏡カバー ガラス</td><td></td><td>22mm x 10Gms</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ハイメディア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハリス ユニコア パンチャー 1mm</td><td>キアゲン</td><td>Z708801</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサメチルジシラザン</td><td>シグマ-アルドリッチ、バンガロール、インド</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>&nbsp;IKA</td><td>RCT B S 22</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>26895</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>LSM 5 LIVE</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット チップ</td><td>ターソン</td><td></td><td>0.5-10 & マイクロ;Lマイクロピペットチップは食品供給に使用されます</td></tr><tr><td>ネガフォトレジスト-1</td><td>マイクロケム</td><td>SU8-2025</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>ネガティブフォトレジスト-2</td><td>マイクロケム</td><td>SU8-2050</td><td>http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>ローカルサプライヤー</td><td>商用窒素ガス</td><td>シリンダー容量 7立方メートル</td></tr><tr><td>PDMS(硬化液)</td><td>Dow Corning Corporation, MI, USA</td><td>&nbsp;シルガード硬化液</td><td>硬化剤</td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>プラビーン・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリック・プラズマ、ニューヨーク、アメリカ</td><td>&nbsp;PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>カミソリとブレード</td><td>リスター外科用ブレード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンエラストマー (ベース)</td><td>ダウコーニングコーポレーション、ミシガン州、米国</td><td>シルガード184ベース</td><td>エラストマーベース</td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>プラスチックチューブ、内径1.59 mm、外径3.18 mm</td></tr>シリコン<tr><td>ウェーハ</td><td>ユニバーシティウェーハ、マサチューセッツ州、米国</td><td>[100]向き、4インチ直径</td><td>直径100mmのウェーハから小片(2mm&times; 2 mm)をカット</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>SPS-Europe B.V., オランダ</td><td>SPIN 150</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク顕微鏡</td><td>Perkin Elmer ultra-view VOXシステム</td><td>CSU-X1-A3 N</td><td>システムは4基(405/488/561/640 nm)のレーザーを搭載し、Volocityソフトウェアパッケージで制御しました。</td></tr><tr><td>SU8開発者</td><td>Microchem、マサチューセッツ州、米国</td><td>SU8開発者</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン</td><td>Sigma-Aldrich、バンガロール、インド</td><td>448931</td><td>トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン蒸気は有毒</td></tr>な<tr><td>UVランプ</td><td>です Oriel Instruments、バンガロール、インド</td><td></td><td>200ワットとコリメートされたUV光源</td></tr><tr><td>Volocityソフトウェア</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td>Image解析</td></tr></tbody></table>

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、発生および細胞生物学的プロセスを研究するための貴重なモデルシステムであることが証明されています。これらの生物学的プロセスを理解するには、多くの場合、同じ動物の長期にわたる繰り返しのイメージングが必要です。寒天パッドで行われる従来の固定化方法に関連する長い回復時間は、動物の健康に悪影響を及ぼし、同じ動物を長期間にわたって繰り返し画像化することは不適切です。この論文では、マイクロ流体チップの設計、製造方法、オンチップ C.エレガンス 培養プロトコル、および個々の動物の発生過程を研究するための長期イメージングの3つの例について説明します。ポリジメチルシロキサンで作製し、カバーガラス上に接着したチップは、窒素ガスを用いて偏向されたエラストマー膜を用いてガラス基板上に動物を固定化する。 C.エレガンス の完全な固定化により、麻酔薬を使用しない方法で細胞および細胞内イベントの堅牢なタイムラプスイメージングが可能になります。大きな断面を有するチャネル形状は、動物が2つの部分的に密封された隔離膜内を自由に動くことを可能にし、連続的な食物供給を伴うチャネル内の成長を可能にする。このシンプルなチップを用いて、PVD感覚ニューロンにおける神経突起の成長、外陰部の発達、樹状突起の樹状突起などの発生現象を、動物がチャネル内で成長するにつれてイメージングすることができます。長期的な成長およびイメージングチップは、単一の圧力ラインで動作し、外部バルブ、安価な流体消耗品がなく、 C.エレガンスを使用する他のラボで簡単に適応できる標準的なワーム処理プロトコルを利用しています。

デバイスの特性評価: 成長およびイメージングデバイスは、不可逆プラズマ結合を使用して結合された2つのPDMS層(図1)で構成されています。長さ10mm、高さ40μmまたは80μmの流動層(パターン1)により、液体培養で動物を成長させることができます(図1A)。捕捉層(パターン2)は、高解像度イメージングのために動物を固定化するための2mm幅の膜(図1B)を有する。捕捉層用のマスクはまた、連続する画像化時点間の流路のセクション内の動物の動きを制限するための一対の隔離膜を作成する。装置の捕集膜は、我々の以前の撮像装置3から適合されている。現在の装置(図1C、L)には、複数の時間ポイントにわたって同じ動物を効率的に固定化するために、分離膜を追加し、捕捉膜の幅を2mmに増やすことが含まれています...

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

この技術の主な利点は、動物が装置内で自由に成長でき、高解像度のイメージングのためにトラップできることです。デバイスは数回再利用できます。デバイスを製造する際、清浄度は、デバイスの操作中の漏れを防ぐためにほこりのないデバイスを製造できるようにするための最も重要な要素です。ワードプロセッシングソフトウェアで長方形を使用して、フローレイヤーのパターン1とコントロールレイヤーのパターン2の設計を開始し、ポリエステルベースのフィルムに最小8マイクロメートルのフィーチャーサイズを持つレーザープロッターを使用してフォトマスクを印刷します。シリコンウェーハを高さと幅が2.5センチメートルの正方形にカットします。20%水酸化カリウムで1分間洗浄し、ウェーハを脱イオン水ですすいでください。一方のウェーハをフローに使用し、もう一方のウェーハを制御層に使用します。14 P-S-I圧縮窒素ガスでピースを乾燥させた後、摂氏120度のホットプレートで4時間脱水します。冷却後、シリコン片を1つ取り、スピンコーダーのチャックに置き、真空をオンにしてウェーハを所定の位置に保持します。シリコン片に約20マイクロリットルのヘキサメチルジシランを置き、スピンコーダーを使用して500 R-P-Mで5秒間コーティングした後、3000 R-P-Mで30秒間コーティングします。フロー層に固有の約40マイクロメートルの均一なフォトレジスト厚さを得るには、スピンコーダーを使用して約1.5ミリリットルのネガフォトレジスト1をシリコンウェーハに500 R-P-Mで5秒間塗布した後、2000 R-P-Mで30秒間コーティングします。シリコン片をヘキサメチルジシランで塗布し、2枚目のウェハに対してネガ型フォトレジスト1枚を繰り返し、制御層に固有の約40マイクロメートルの均一なフォトレジスト厚さを得た。あるいは、高齢の動物のためにフロー層の厚さを約80マイクロメートルに増やすために、シリコンウェーハを約1.5ミリリットルのネガフォトレジスト2でコーティングし、スピンコーダーを使用して500 R-P-Mで5秒間、続いて2000 R-P-Mで30秒間。以前にフォトレジストでコーティングされた両方のシリコーン片をホットプレートで摂氏65度で1分間焼き、続いて摂氏95度で10分間焼きます。冷却後、フォトレジスト塗布面をU-Vランプに向けて、U-Vイルミネーターの露光ステージに柔らかく焼き上げたシリコーン片を置きます。パターン1と2のフォトマスクを通して200ワットのランプを使用して、2つのピースを別々にU-Vに15秒間さらし、それぞれフローレイヤーとコントロールレイヤーを取得します。前述のように、コーティングされた層を上に向けて、露出した2つのシリコーン片を焼きます。片を冷却した後、シリコーン片をフォトレジスト現像液に20分間浸してパターンを現像する。パターンが見えたら、純粋なイソプロピルアルコールですすぎ、窒素ガスを使用して静かにブロードライします。シリコーン片は、コーティングされた表面を上に向けてデシケーターに入れてください。スライドガラスに50マイクロリットルの純粋なT-C-P-F-O-Sを注ぎ、破片をシラン蒸気にさらします。スライドをデシケーターの中に置き、2時間インキュベートします。エラストマーベースと硬化剤を混合してプラスチックカップにP-D-M-Sを作り、3分間絶えず攪拌します。P-D-M-Sミックスをデシケーターで30分間脱気して、すべての気泡を取り除きます。制御層シリコンウェーハをペトリ皿に入れ、厚さ5ミリメートルのP-D-M-Sミックス層をシリコン片に注ぎます。P-D-M-S注液処理後、P-D-M-Sミックスの脱気を繰り返します。フロー層のあるシリコンウェーハをスピナートラックに向けて置き、200〜500ミリトルの真空圧をかけます。シリコンウェーハに約1ミリリットルのP-D-M-Sを注ぎます。スピンコーターを使用してエンコードすると、約80マイクロメートルの厚さの層が得られます。2枚のシリコンウェーハをスピンコートしたP-D-M-Sで焼き、P-D-M-S層を50°Cの熱風対流式オーブンで6時間注ぎます。冷却後、鋭利な刃を用いて制御層の周りのシリコン片から厚さ5ミリのP-D-M-S層を切り出し、シリコン基板から剥離する。P-D-M-Sブロックのリザーバーにハリスパンチャーを使用して直径約1ミリメートルの2つの穴を開け、固定化チャネルと隔離チャネルの入口をP-D-M-S膜偏向用のガスラインに接続します。スピンコーティングされたP-D-M-S層が入ったシリコン片をパターン1の上に置き、P-D-M-Sコーティングされた表面をプラスチックトレイの上に向けています。パターン2のパンチされたP-D-M-Sブロックを、成形面を上に向けてトレイに置いておきます。プラスチックトレイをプラズマクリーナー内に保ち、低真空を適用して2つのP-D-M-S表面を18ワットの空気プラズマに2分間さらします。2つのプラズマ処理されたブロックを取り出し、パターン1とパターン2のプラズマ処理面を一緒に押し付けてブロックを穏やかに結合します。接着パターンを摂氏50度で熱風対流式オーブンで2時間焼きます。接合されたデバイスをオーブンから取り出した後、パターン1とパターン2のシリコンウェーハから切り取り、ハリスパンチャーを使用してフロー層の入口と出口のリザーバーに穴を開けます。接着されたP-D-M-Sブロックをフロー層を上に向けてプラスチックトレイに置き、同じトレイにきれいなカバーガラスを保管します。カバーガラスのブロックを18ワットの空気プラズマに2分間さらします。真空圧を調整して、紫色のチャンバーを確認します。プラズマ露出したP-D-M-Sブロックをカバーガラス上に置き、接着構造を摂氏50度のオーブンで2時間焼きます。将来の実験のために、デバイスをクリーンチャンバーに保管してください。装置を取り、実体顕微鏡に置き、チューブを取り付けます。マイクロフレックスチューブを圧縮窒素ガスラインに接続し、もう一方の端に3方向コネクタを接続します。3方向コネクタのチューブ1と2をそれぞれ隔離膜のトラップに接続します。2本のマイクロフレックスチューブを三方活栓の2つの出口ポートに接続します。2本のチューブのもう一方の端を長さ8ミリメートルの18ゲージの針に接続します。入口ポートを通してマイクロピペットを使用して、フロー層をM-9バッファーで満たします。針に接続された端から両方のチューブに脱イオン水を入れます。2本の針を、隔離膜と捕捉膜を接続するパンチ穴に挿入します。窒素ガスレギュレーターを14 P-S-Iで開き、チューブ1から三方弁を回して、制御層のマイクロ流体チャネル、つまりトラップ膜と隔離膜を介して水をデバイスに押し込みます。チャネルが水で満たされ、プライミングされたら、三方活栓を使用して圧力を解放します。流路を通して追加の媒体を流すことによって気泡を除去する。図は、マイクロ流体チップ内で動物が成長し、8〜10時間ごとに固定化して蛍光画像をキャプチャするP-S-3-2-3-9の画像を示しています。発現パターンの変動は、同じ遺伝子が異なる発生段階の異なる細胞で発現される時間的遺伝子調節の例を表す。カエノラブディティスエレガンスの個々のW-D-I-S-5-1遺伝子型のイメージングは、各P-V-Dニューロンにメノラー様の分岐樹状突起構造を示し、それぞれL-2、後期L-2、L-3、およびL-4の発生段階で一次、二次三次、および四次プロセスを含む。本明細書の図は、P−V−D発生および装置増殖動物と、N−G−Mプレート上で増殖させた動物とを比較する。ワーム発生のさまざまな段階でのS-PおよびQ-Pの数は、年齢とともに増加しました。カエノラブディティスエレガンスは、高解像度イメージングに必要な十分な麻痺を引き起こすために、3ミリモルのレバミゾールの滴で治療されました。S-P値は、N-G-Mプレート上で増殖させ、寒天スライド上で3ミリモルのレバミゾールを用いて画像化した類似の病期動物と測定した場合、有意差はなかった。さらに、尾部に存在する2つのP-V-C細胞体と外陰部付近に存在する2つのP-V-C細胞体の間の距離は、装置内で増殖した動物とN-G-Mプレート上で増殖した動物の両方で離れるにつれて増加する。図は、マイクロ流体デバイス内で増殖する動物由来の触覚受容器ニューロンの高解像度画像を表す。モンタージュは、ミトコンドリアとニューロンプロセスを強調する連続した時点でのP-L-M-Rニューロンプロセス全体を表します。グラフは、毎時10.4マイクロメートルの傾きで増加することが観察された総ニューロンプロセス長を表しています。微細加工されたデバイスは、高圧窒素ガスの存在下で偏向された薄いP-D-M-S膜を使用して、高解像度イメージングのためにC-エレガンスを固定化して所定の位置に保持します。この手順により、長期間にわたって断続的な観察を必要とするC-エレガンスの細胞および細胞内プロセスの縦断的研究が可能になります。

a-simple-microfluidic-chip-for-long-term-growth-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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