Name: リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶリアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を用いた骨芽細胞の生体エネルギー評価法。酸素消費量と細胞外酸化率を測定し、ATP産生とミトコンドリア機能を解析します。

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この研究は、国立衛生研究所(NIH)国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)グラントAR072123および国立加齢研究所(NIA)グラントAG069795(ERRへ)の支援を受けた。

すべての手順は、ヴァンダービルト大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に基づいていました。
1. 試薬の調製とアッセイのセットアップ
<ol><li>骨髄間質細胞の単離および培養(前項30も参照)。<ol>
<li><li><li></li><li><li> </li><li><li></li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol start="5" style="margin-left: 40px;"><li></li><li><li> </li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li> </li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig04large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig05large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li></li></ol>

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<li>XF cell mito stress test. , Available from: 
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<li>XF cell mito fuel flex test. , Available from: 
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<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+uptake+and+Runx2+synergize+to+orchestrate+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation.</a> Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).</li>
<li>Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+radiometric+analysis+of+glucose+uptake+and+distribution+in+mouse+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone.</a> Bone Research. 4, 16004(2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22Normalization+of+agilent+seahorse+XF+data+by+in-situ+cell+counting+using+a+BioTek+cytation+5+application+note%22">Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note</a>. , (2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

リアルタイムの細胞代謝フラックス分析装置は、さまざまな条件下で細胞エネルギーを探索するために使用できます。このプロトコルは、BMSCの効率的な単離、適切な細胞培養プレートでの細胞の培養、および成熟骨芽細胞への分化を示しており、細胞外フラックス分析装置を使用したさまざまなアッセイに使用できます。さらに、センサーカートリッジの水和、注入ポートの装填、アッセイの実行、データの正規化、およびデータ分析を含む、リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイの重要なステップも詳細に説明されています。このアッセイは、細胞の生体エネルギー学を理解するために、異なるミトコンドリアおよび解糖系阻害剤に対する骨芽細胞の応答を評価する。このプロトコルは、細胞型に基づいて骨芽細胞用に特別に最適化されており、この方法は、製造業者の標準プロトコルと比較して、より堅牢で正確なガイドを提供する。細胞播種密度、化合物の濃度、培地への外因性基質の添加、緩衝能を含むこのプロトコールにおけるいくつかのパラメータは、特定の細胞型およびその背景に基づいて最適化される必要がある。
細胞外フラックス分析計は、 エクスビボ...

骨芽細胞による骨の形成は、破骨細胞による骨の協調的な破壊または再吸収を伴う。骨芽球性骨形成と破骨細胞再吸収との間のバランスは、骨格恒常性維持に不可欠な骨代謝回転またはリモデリングを記述する結合プロセスである。骨芽細胞機能障害は、骨形成の障害をもたらし、骨粗鬆症を含む様々な疾患をもたらす1,2,3。骨髄間質幹細胞(BMSC)から骨芽細胞前駆体および成熟骨芽細胞へのエクスビボ/インビトロ分化は、経時的に培養容器内の石灰化骨マトリックスの形成および沈着をもたらす4,5,6。骨芽細胞によるこの骨形成は、かなりの量の細胞エネルギーを必要とする。具体的には、コラーゲン合成および分泌は、細胞ATP:ADP比に大きく依存することが示されており、おそらく、石灰化小胞の輸送および分泌は、追加のATP7、8、9、10、11を必要とする。多くの研究者は、骨芽細胞形成および骨芽細胞機能のプロセスが、骨形成の代謝需要を満たすために十分なエネルギー供給を必要とすることを実証している12,13,14,15,16。したがって、この方法の目標は、リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を用いて骨芽細胞分化全体を通して初代マウス間質細胞の生体エネルギー状態を特徴付けることである。これらの技術は、骨格恒常性の理解を深めるのに役立ち、最終的には骨格障害を改善することができる新規な治療選択肢の開発につながる可能性がある。
リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置は、それぞれミトコンドリアおよび解糖系ATP産生に対応する生骨芽細胞の酸素消費速度(OCR)および細胞外酸性化速度(ECAR)を測定するために使用することができる。この方法論の基本的なことは、グルコースから乳酸への変換において解糖系中に乳酸塩あたり1つのH+イオンが放出され、ECAR値に反映された媒体pHを変化させるという事実である。逆に、TCA(トリカルボン酸)サイクルの間、ミトコンドリアを介した酸化的リン酸化は、酸素を利用または消費することによってCO2を生成するため、OCRのモニタリングはこの代謝プロセスを反映している。このアナライザは、細胞外微小環境におけるOCRとECARの両方を同時にリアルタイムで測定するため、細胞の生体エネルギーを研究する際に大きな可能性を秘めています6,17。さらに、これらのアッセイの実行は比較的簡単で、実験目標に応じて簡単にカスタマイズできます。同様の技術が、免疫系18、19、癌開始、および進行20のT細胞代謝調節を、メタボリックシンドローム21、22に寄与する複数の他の細胞型とともにさらに理解するために採用されている。
代替技術に対するリアルタイム代謝フラックス分析装置の利点には、(1)生細胞の細胞生体エネルギーをリアルタイムで測定する能力、(2)比較的少数の細胞でアッセイを行う能力(5,000細胞という低い細胞が必要)、(3)ハイスループット96ウェルシステムで複数の治療を並行して操作する注入ポート、(4)正規化のための放射性ラベルフリー自動細胞イメージャの使用18、23,24。以下の方法は、分析装置を用いた骨芽細胞分化全体を通してマウスBMSCにおける細胞生体エネルギー学のモニタリングに関する一般化されたが詳細な説明を提供することを目的としている。これには、日常的に行われるアッセイが含まれます。ただし、多くの手法や方法と同様に、個々のラボが実験の具体的な詳細を決定することを強くお勧めします。
アッセイの選択と利用可能なさまざまな種類のアッセイ:実験結果の信頼性と一貫性を確保しながら、細胞の生体エネルギー学を研究するために、多種多様なアッセイキットと試薬が利用可能です。さらに、デスクトップソフトウェアは、簡単にカスタマイズできるアッセイテンプレートも提供します。アッセイは、異なる代謝パラメータを測定するユーザのニーズに基づいて定義することができる。これらのアッセイは、実験目標および/または科学的質問に基づいて様々な方法で修正することができる。例えば、4つの注入ポートを用いて、複数の化合物をアッセイ培地に注入して、各代謝経路に特異的な細胞応答を分析することができる。
細胞エネルギー表現型試験:このアッセイは、生細胞の代謝表現型および代謝能を測定する。このアッセイは、経路特異的代謝の一般化されたアイデアを得るための第一歩としても推奨されます。ATP合成酵素の阻害剤であるオリゴマイシンA-と、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)-の混合物を注入し、細胞エネルギーポテンシャルを理解する。オリゴマイシンAの注射は、ATPの合成を阻害し、細胞がエネルギー需要を満たすことを可能にする解糖系(ECAR)の割合を増加させる。一方、FCCPの注射は、ミトコンドリア膜の脱分極のためにより高いOCRをもたらす。本質的に、このアッセイは、基礎代謝呼吸、および二重注射、プッシュ、またはストレスに続く代謝応答を描写する。これらのパラメータに基づいて、ソフトウェアは、細胞を経時的に好気的、静止状態、解糖系、またはエネルギー状態として分類することによって、細胞のOCRおよびECARをプロットする25,26。
ATPリアルタイム生産速度アッセイ: これは、解糖系およびミトコンドリア呼吸からの細胞ATP産生を同時に測定する。このアッセイは、2つのエネルギー経路からの代謝シフトを定量的に測定し、経時的なミトコンドリアおよび解糖系ATP産生速度に関するデータを提供する。アッセイは、基礎OCRおよびECARデータを取得し、続いて、オリゴマイシンAの注射によるミトコンドリアATP産生速度およびロテノン+アンチマイシンA混合物の注射による解糖系ATP産生速度(ミトコンドリア機能の総阻害)を計算し、ミトコンドリア酸性化をもたらす17、27。
細胞ミトコンドリアストレス試験(または細胞ミトストレス試験):これは、ATP結合呼吸を介してミトコンドリア機能を測定し、細胞の生体エネルギー学を定量化し、ミトコンドリア機能不全を同定し、ストレスに対する細胞の応答を測定する。基礎呼吸能力および予備呼吸能力、ATP結合呼吸、最大呼吸、および非ミトコンドリア酸素消費を含む様々なパラメータを、1つのアッセイで得ることができる。このアッセイは、オリゴマイシンA、FCCP(ミトコンドリア脱共役剤)、ロテノン/アンチマイシンA阻害剤の混合物の逐次注射を含み、ミトコンドリア機能に対するこれらの影響を効率的に分析する28。
柔軟性水戸燃料フレックステスト: これは、それらの阻害剤の有無による3つの主要なミトコンドリア燃料の酸化によるミトコンドリア呼吸数を測定する。グルコース、グルタミン、および脂肪酸の逐次阻害は、エネルギー需要を満たすために、細胞の依存性、容量、および柔軟性、ならびに様々な細胞経路における細胞の依存性を測定するのに役立つ。ミトコンドリアが他の燃料を酸化することによって目的の経路の遮断された要求を満たすことができないとき、細胞は依存状態に入る。細胞の容量は、他の2つの代替経路の阻害とそれに続く目的の経路の阻害によって計算される。細胞の柔軟性は、ミトコンドリアが阻害された経路の燃料ニーズを補償し、満たす能力を理解するのに役立ちます。これは、細胞の容量から細胞の依存性を差し引くことによって計算されます。3つの異なる阻害剤を独立して、または2つの混合物として使用して、アッセイパラメータを効果的に計算する。2-シアノ-3-(1-フェニル-1H-インドール-3-イル)-2-プロペン酸(UK5099)は、解糖系中のピルビン酸担体を遮断することによってグルコースの酸化を阻害する。ビス−2−(5−フェニルアセトアミド−1,3,4−チアジアゾール−2−イル)(BPTES)エチルスルフィドはグルタミン酸化経路を阻害し、エトモキシルは長鎖脂肪酸の酸化を阻害する29。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> 図1:分析のために骨芽細胞を培養および調製するための方法論の概略図。 マウスBMSCは長骨から単離され、培養され、25,000細胞/ウェル密度で96ウェルプレートに播種される。これらの細胞を骨芽細胞特異的培地中で培養することは、それらが80%〜100%コンフルエントに達したときに開始され、それらの分化を開始する。アッセイは、分化の異なる段階で行われる。カートリッジプレートをアッセイの1日前に水和させる。アッセイ当日、アッセイ要件に基づいて異なる阻害剤をセンサーカートリッジのポートに注入し、校正バッファーを96ウェル校正プレートに添加します。較正後、リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイが行われ、続いてマイクロプレートイメージャを用いて細胞培養マイクロプレートを画像化することにより、リアルタイム細胞代謝フラックス分析計データを細胞数で正規化する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン EDTA</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>2-シアノ-3-(1-フェニル-1H-インドール-3-イル)-2-プロペン酸</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>アンチマイシン A</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Σ-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>ビス-2-(5-フェニルアセタミド-1,3,4-チアジアゾール-2-イル)エチルスルフィド</td><td>ΣAldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr> シ<tr><td>アン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5 イメージングリーダー</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>マイクロプレートイメージャー</td></tr><tr><td>エトモキシルナトリウム塩水和物</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸-アルブミン ウシ血清</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシンA - 5 mg</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 1.0 M グルコース溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 100mM ピルビン酸ソリューション</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 200mM グルタミン溶液</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF DMEM 培地</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>DMEM アッセイ培地 eith 5mM HEPES、pH 7.4、フェノールレッド、重炭酸ナトリウム、グルコース、ピルビン酸、L-グルタミンなし</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XFe96 アナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>リアルタイム代謝フラックス分析装置</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XFe96 FluxPak</td><td>アジレント・テクノロジー</td><td>ズ 102416-100</td><td>XFe96 センサーカートリッジ、細胞培養マイクロプレート、タツノオトシゴ XF キャリブラント溶液</td></tr><tr><td>を含む 細胞イメージング 1.1.0.11 ソフトウェア</td><td>アジレント・テクノロジーズ - BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウェーブ・ソフトウェア 2.6.1</td><td>アジレント・テクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ&β;-グリセロール・リンフェート</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

骨芽細胞による骨形成は、骨格の恒常性を維持し、最終的には骨折を防ぐために、適切な骨獲得と骨代謝回転に不可欠なプロセスです。ピーク骨量を最適化し、様々な筋骨格疾患(すなわち、閉経後骨粗鬆症、神経性食欲不振、1型および2型真性糖尿病)と戦うために、骨生物学の分野では、骨芽細胞の分化プロセス全体にわたって完全に特徴付けるための信じられないほどの努力がなされてきた。マトリックスタンパク質および石灰化小胞を分泌する成熟骨芽細胞の主な役割を考えると、これらのプロセスは信じられないほどの量の細胞エネルギー、またはアデノシン三リン酸(ATP)を必要とすることが注目されている。全体的な細胞エネルギー状態は、しばしば細胞生体エネルギー学と呼ばれ、細胞のニーズを満たすためにATPを導出するための基質の利用可能性を感知する一連の代謝反応を含む。したがって、現在の方法は、初代マウス骨髄間質細胞(BMSC)を単離し、骨芽細胞分化の様々な段階でリアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用してそれらの生体エネルギー状態を監視するプロセスを詳述する。重要なことに、これらのデータは、代謝プロファイルが骨芽細胞分化を通して劇的に変化することを実証した。したがって、この生理学的に関連する細胞型を使用することは、細胞の生体エネルギー状態が全体的な機能を調節する方法を十分に理解するために必要である。

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> 図6:対照対処置群の細胞生体エネルギープロファイルをそれらのそれぞれの標準誤差とともに理解するために日常的に実施されるアッセイのための代表的なグラフ。プロットは、対照対2つの治療群(n = 3)の解糖系(ECAR)対ミトコンドリア呼吸(OCR)を表す。オリゴマイシンAおよびFCCPストレッサーの注射は、オープンシンボルによって示されるベースライン活性を上昇させるが、クローズドシンボルは、異なるストレッサーに対する細胞の応答を示す。(b)リアルタイムATP率アッセイ。ATP率アッセイは、対照群および処置群(n=2)の両方が、酸化的リン酸化と比較して解糖系を介してより多くのATPを産...

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

この方法は、ATP産生速度のような細胞エネルギーを決定するのに役立ち、また、特定の代謝産物に対する細胞の嗜好をリアルタイムで決定するのに有用である。まず、200マイクロリットルのXFキャリブラントを添加し、アッセイの前にユーティリティプレートを少なくとも1時間インキュベートします。補充されたXF DMEMを用いて80ミリリットルのXFアッセイ培地を調製する。氷上でオリゴマイシンA、ロテノン、およびアンチマイシンAを解凍する。使用前に化合物を上下にピペットで溶かします。26.4マイクロリットルの2.5ミリモルオリゴマイシンAをチューブAに、3.1マイクロリットルの12.67ミリモルロテノンに、4.1マイクロリットルの9.4ミリモルアンチマイシンAに、30マイクロリットルのフックの染色をチューブBに3ミリリットル加え、チューブBに30マイクロリットルのフック染色剤を充填する。そして最後に、20マイクロリットルのこれらの化合物を、200マイクロリットルのアッセイ培地中の細胞に装填する。細胞培養用マイクロプレートを摂氏37度の培養器から取り出し、顕微鏡下で細胞を観察した。アッセイ培地を水浴から除去する。予め加温したアッセイ培地200マイクロリットルで細胞を2回穏やかに洗浄し、ウェル当たり200マイクロリットルのアッセイ培地を加える。顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞がウェルに接着したままであることを確認します。D5およびE8ウェル内の細胞が一貫した単分子膜で接着され、洗浄ステップ中に洗い流されなかったことを確認する。細胞イメージングソフトウェアは、オートフォーカスと自動露出を設定するためにこれら2つのウェルを使用します。機器の横にあるコンピューターでデスクトップソフトウェアを開きます。コントローラソフトウェアの左下隅にある接続ステータスを確認します。テンプレートに移動し、XF ATP 率アッセイテンプレートまたは適切なアッセイテンプレートを選択します。画面上部の [グループ定義] を選択し、グループを定義します。プレートマップレイアウトを選択し、定義されたグループに応じてウェルを割り当てます。計測器プロトコルを確認します。追加したコンパウンドが正しくリストされていることを確認し、今後の参照用にプロジェクト情報を含めます。「アッセイの実行」をクリックします。これにより、結果ファイルの保存場所の選択が促されます。結果ファイルを保存する場所を選択します。アッセイ日を含むファイルを保存し、[実行の開始]をクリックします。センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置き、[準備完了]をクリックしてキャリブレーションを開始します。コンピュータ上の細胞イメージングソフトウェアを開きます。マイクロプレートイメージャの電源が入っていて、ポートがコンピュータに接続されているこ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP...

C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

このプロトコルは、細胞外フラックスアッセイを使用して初代白血病細胞の細胞外酸性化率(ECAR)と酸素消費率(OCR)を測定するための生化学的アプローチを提供します。これらの細胞の代謝プロファイルの評価は、それらの要求を特徴付けるのに役立ち、個別化治療につながります。...

細胞外フラックスアッセイ:細胞の代謝プロファイルを測定する方法

源：エレトラ・レオ1、ルイザ・H.D.カルドーゾ1、サビーヌ・シュミット1、エーリッヒ・グナイガー11オロボロス機器このビデオでは、酸素フラックスを使用して、生きているおよび透過処理された哺乳類細胞のミトコンドリア呼吸を評価する方法について説明します。これは、さまざまな呼吸状態を特徴付けるために、ジギトニン、代謝基質、ADP、アンカプラー、および阻害剤を順次使用することを実証しています。得られた酸素フラックスプロファイルは、定義された条件下でのミトコンドリア機能とエネルギー結合効率を明らかにします。...

生細胞および透過処理細胞におけるミトコンドリア呼吸を評価するための酸素フラックス測定

この動画では、細胞外フラックスアナライザーを使用して、活性化したヒトNK細胞のエネルギー代謝を解析する方法を実演しています。電子伝達鎖複合体のさまざまな阻害剤は、酸素消費率またはOCRを通じて測定されるATP合成に影響を与え、細胞代謝と生体エネルギー学に関する洞察を提供します。...

細胞外フラックスアナライザーを用いたヒトNK細胞のエネルギー代謝のリアルタイムモニタリング

代謝リプログラミングは、M1およびM2マクロファージの分極のための特性的かつ前提条件です。この原稿では、マウス骨髄由来マクロファージにおける解糖系とミトコンドリア機能の基本パラメータを測定するためのアッセイについて説明します。このツールは、特定の要因がマクロファージの代謝と表現型にどのように影響するかを調査するために適用できます。...

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

ヒト網膜色素上皮細胞(H-RPE)の代謝状態は、その健康と機能を反映しています。ここでは、高解像度の呼吸測定を使用してH-RPEのリアルタイムの代謝フラックスを調べるための最適化されたプロトコルを紹介します。...

高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。...

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

本研究では、細胞膜を選択的に透過させるプロトコルを提示し、基質や阻害剤の標的的送達を可能にすることで、培養細胞におけるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)を評価し、通常は分析を妨げる形質膜輸送障壁を克服します。この技術を用いて、OXPHOSの機能がムスカリン作動薬およびアンタゴニストによって調節されることを示しました。...

ジトニン透過化されたBE(2)-C神経芽細胞における酸化リン酸化結合のコリン作動位子依存性調節

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD -...

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

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リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

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